Глаукома — прогрессирующая нейропатия зрительного нерва с характерными структурными патологическими изменениями в зрительном нерве [1]. Во всем мире насчитывается более 60 млн человек с глаукоматозной оптической нейропатией, из них 8,4 млн — слепые. Ожидается, что глобальная заболеваемость глаукомой к 2040 г. вырастет до 111,8 млн [2].

Наличие открытого угла передней камеры глаза, а также повышенного внутриглазного давления (ВГД), сужения/выпадения полей зрения, эскавации зрительного нерва (патологическая триада) позволяет характеризовать глаукому как открытоугольную. Основным патогенетическим звеном закрытоугольной глаукомы является блокада угла передней камеры глаза корнем радужки. Несмотря на то что большинство патологических процессов при глаукоме проходит на фоне повышения ВГД, его снижение не приводит к стабилизации глаукомного процесса, так как данный процесс характеризуется комплексностью и связан с изменением сетчатки, поэтому в терапии также используются средства, действие которых направлено на уменьшение гибели нейрональных клеток. На сегодняшний день чрезвычайно важной является разработка лекарственных препаратов (ЛП) для сохранения зрительной функции при глаукоме с помощью механизмов, не связанных со снижением ВГД, с акцентом на нейропротекцию. Препараты нейропротекторного действия должны обладать следующими характеристиками: реализовывать свое действие при условии наличия специфических точек приложения в структурах сетчатки, проявлять нейропротекторную активность в отношении ганглионарных клеток сетчатки (ГКС) и достигать сетчатки и стекловидного тела в достаточных концентрациях [3].

Модели глаукомы на лабораторных животных не являются точным повторением структурных и патогенетических процессов, происходящих у человека, и не могут учитывать индивидуальные особенности течения патологии у отдельного субъекта, тем не менее современные методы моделирования глаукомы in vivo позволяют добиться высокой схожести патологических изменений, наблюдаемых в эксперименте и в клинической практике.

Учитывая характер течения заболевания первичной открытоугольной глаукомой и основываясь на данных литературы [4] и результатах измерения уровня ВГД, офтальмоскопии и патоморфологии, наиболее близкой экспериментальной моделью первичной открытоугольной глаукомы является модель с введением в переднюю камеру глаза гиалуроновой кислоты. Этот способ сопровождается длительным и умеренным повышением ВГД и характеризуется простотой выполнения, что, в свою очередь, отличает его от других методов моделирования глаукомы, таких как лигирование эписклеральных вен, лазерная коагуляция тканей лимба и т.д.

При планировании доклинических исследований, направленных на оценку потенциальной активности ЛП, необходимо обеспечить всестороннюю оценку возможного терапевтического эффекта препарата. Несмотря на то что использование ЛП нейропротекторного действия в терапии глаукомы в клинической практике неотъемлемо связано со снижением ВГД, в доклиническом исследовании новых ЛП первоочередной задачей является изучение эффективности конкретного препарата на смоделированной патологии, исключая возможную погрешность и лекарственное взаимодействие (изучается в отдельных исследованиях), — при этом имеется возможность введения в эксперимент групп комбинированной терапии (например, ЛП для снижения ВГД + ЛП нейропротекторного действия) либо полного отказа от монотерапии, в зависимости от дизайна исследования. При использовании ЛП, оказывающих терапевтический эффект в отношении глаукомы по механизмам, не связанным со снижением ВГД, особое внимание уделяется выбору показателей, по значениям которых можно сделать выводы об эффективности терапии.

В данном исследовании в качестве перспективного показателя рассматривается электроретинография (ЭРГ). В клинической практике ЭРГ является часто используемым офтальмологическим тестом, однако, поскольку глаукома характеризуется поражением ганглиозных клеток и их аксонов, ЭРГ может быть непоказательной для диагностики глаукомы у человека, что затрудняет ее использование в клинических исследованиях. Тем не менее ЭРГ активно используется в диагностике глаукомы у человека в качестве дополнительного теста. В то же время существует ряд опубликованных работ, в которых описана зависимость развития глаукомы и угнетение амплитуд a- и b-волн ЭРГ у животных [5], что объяснимо, поскольку моделируемая на животных патология характеризуется обширностью и контролируемым течением. Патологические процессы во внутренних слоях сетчатки приводят к снижению амплитуды b-волны ЭРГ, в то время как изменения а-волны могут также фоново проявляться при дисфункции фоторецепторов и биполярных клеток под влиянием повышенного ВГД. Однако опубликованных результатов недостаточно для включения этого показателя в эксперимент на крысах в условиях длительного моделирования глаукомы, поскольку отсутствуют данные о корреляции развития патологии и возможности ее корректировки, минуя снижение ВГД.

Цель исследования — проверить, можно ли ассоциировать изменения в амплитуде a- и b-волн ЭРГ с ранними функциональными изменениями сетчатки у крыс, подвергающихся моделированию глаукомы, с морфологическими доказательствами потери функциональной целостности сетчатки и с возможностью ее корректировать.

Материал и методы

Экспериментальное исследование выполнено на 40 аутбредных крысах в возрасте 3—4 мес. Крысы были разделены на пять групп по 8 самцов (8 глаз). Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование было рассмотрено и одобрено для проведения биоэтической комиссией НИИ фармакологии живых систем (протокол от 17.07.19). Моделирование глаукомы осуществляли путем введения гиалуроновой кислоты (Sigma Aldrich, Германия) в виде 1% раствора в переднюю камеру глаза (рис. 1), все манипуляции осуществлялись только на правом глазу. Гиалуроновую кислоту вводили раз в неделю на протяжении 9 нед согласно методике, описанной J. Benozzi и соавт. [6]. Для проведения всех болезненных и предполагающих обездвижение животных манипуляций крыс вводили в общий наркоз (хлоралгидрат в дозе 300 мг/кг) с непрерывным контролем глубины наркоза.

Рис. 1. Введение гиалуроновой кислоты в переднюю камеру глаза наркотизированной крысы.

Экспериментальные животные методом рандомизации были распределены на следующие группы: 1) интактная; 2) контроль патологии; 3) позитивный контроль (ПК), в качестве препарата для ПК (ППК) использовался ретиналамин в дозе 0,214 мг/кг; 4) ППК — ретиналамин в дозе 0,428 мг/кг; 5) ППК — ретиналамин в дозе 0,857 мг/кг.

В группах ПК использовался комплекс пептидов, выделенных из сетчатки крупного рогатого скота (Ретиналамин, ООО «ГЕРОФАРМ», Россия) — стимулятор репарации тканей, успешно применяемый в терапии глаукомы. Известно, что ретиналамин уменьшает деструктивные изменения в пигментном эпителии сетчатки при различных формах дегенерации, модулирует активность клеточных элементов сетчатки, улучшает эффективность функционального взаимодействия пигментного эпителия и наружных сегментов фоторецепторов при развитии патологических процессов, стимулирует фибринолитическую активность крови и оказывает иммуномодулирующее действие. Механизм действия определяется метаболической активностью: препарат активизирует метаболизм тканей глаза, нормализует функции клеточных мембран, улучшает внутриклеточный синтез белка, регулирует процессы перекисного окисления липидов, оптимизирует энергетические процессы. Препарат взаимодействует с такими связанными с повреждением сетчатки при глаукоме рецепторами, как AMPA [7] и NMDA [8], умеренно взаимодействует с рецепторами mGluR1, kainite и mGluR5 (показано in vitro методом радиолигандного связывания) и обладает биодоступностью к тканям глаза и головному мозгу (показано in vivo с применением радиоактивного мечения ¹²⁵I). На основании вышеизложенного для ПК был выбран препарат, терапевтический эффект которого не связан с влиянием на ВГД. ЛП вводили внутримышечно. С учетом того, что стандартная терапия глаукомы часто включает применение глазных капель, в качестве дополнения животным всех групп, кроме интактной, ежедневно конъюнктивально вводили стерильный изотонический раствор натрия хлорида. Дизайн эксперимента представлен на рис. 2.

Рис. 2. Дизайн эксперимента.

На 63-й день эксперимента (до начала терапии) проводили прижизненный контроль формирования патологии: определяли уровень ВГД, регистрировали показатели ЭРГ и офтальмоскопии. Начиная с 63-го дня эксперимента ежедневно в течение 10 дней осуществляли терапию в группах ПК. На 73-й день эксперимента, после регистрации контрольных показателей (ВГД, ЭРГ, офтальмоскопия), животных подвергали эвтаназии в СО₂-камере с последующим забором сетчатки и головного мозга для гистологического исследования.

Определение уровня ВГД у лабораторных животных осуществляли тонометром Icare TonoVet (Финляндия). Для исследования глазного дна у лабораторных крыс проводили офтальмоскопию с использованием линзы V78C (Volk Optical, США).

ЭРГ проводили после темновой адаптации, для этого животных выдерживали в темноте не менее 30 мин [9—11]. Роговичный серебряный электрод помещали на роговицу, предварительно смоченную изотоническим раствором натрия хлорида для более полного контакта, референтный игольчатый электрод EL452 помещали подкожно в области черепа, заземляющий игольчатый электрод EL450 — подкожно в области основания хвоста. Регистрацию ЭРГ проводили в ответ на одиночную вспышку белого света стробоскопа (Biopac System, Inc., США). Вызванные биопотенциалы пропускали на частоте 1—1000 Гц, усиливали, усредняли и представляли графически на экране с помощью компьютерной программы AcqKnowledge 4.2 (Biopac System, Inc., США). Запись ЭРГ проводили в течение 0,5 с у каждой крысы в группах. Для оценки степени развития функциональных повреждений сетчатки оценивали величину амплитуд а- и b-волн ЭРГ [11].

Для гистологического исследования глазные яблоки и головной мозг извлекали и фиксировали иммерсионным способом в 10% растворе формалина. Этапы гистологической обработки выполнены с использованием оборудования фирмы Leica (Германия). Для микроскопического исследования, морфометрии и архивирования готовые микропрепараты сканировали с помощью компьютерной системы архивирования и анализа изображений Mirax Desk (Carl Zeiss, Германия). Анализ изображений и морфометрия выполнены с помощью программы Pannoramic Viewer 1.15.4. Количественные данные регистрировали в электронных таблицах MS Excel. С целью объективизации оценки выявляемых качественных изменений сетчатки степень изменений регистрировали с помощью условных баллов: 0 баллов — без изменений, 1 балл — минимальные изменения, 2 балла — умеренно выраженные, 3 балла — выраженные изменения нейрональных структур. Коэффициент изменения (КИ) ганглиарного слоя сетчатки рассчитывали по формуле:

КИ=(1·n+2·n+3·n)/N,

где n — количество участков с соответствующей (0; 1; 2; 3) степенью изменений; N — общее количество исследованных участков.

Результаты

Экспериментальная глаукома была смоделирована на крысах за 9 нед. После завершения периода формирования патологии прижизненными методами была подтверждена состоятельность модели: в группе контроля патологии наблюдалось достоверное увеличение ВГД до уровня 20,8±1,0 мм рт.ст/, что в среднем в 2,2—2,5 раза превышало исходные значения и статистически отличалось от ВГД интактных животных; наблюдалось достоверное снижение амплитуды b-волны ЭРГ и характерные для глаукомы изменения глазного дна. У животных интактной группы отклонений от нормы зафиксировано не было.

По результатам оценки ВГД в группе ПК по окончании курса введения было показано отсутствие влияния терапии на ВГД крыс со сформированной глаукомой. По результатам офтальмоскопии было отмечено, что в группах ПК улучшение состояния глазного дна наблюдалось преимущественно за счет общего вида сетчатки, снижения бледности глазного дна и уменьшения серости ДЗН. Показатели в данных группах достоверно отличались от таковых как в группе интактных животных, так и в группе плацебо.

Основные результаты исследования отражены на рис. 3.

Рис. 3. 73-й день. Результаты ЭРГ: амплитуда a- и b-волн на фоне результатов гистологии ганглионарного слоя сетчатки.

1 — интактная группа; 2 — контроль патологии; 3 — ППК в дозе 0,214 мг/кг; 4 — ППК в дозе 0,428 мг/кг; 5 — ППК в дозе 0,857 мг/кг; * — статистически значимое отличие от интактной группы; ** — статистически значимое отличие от группы контроля патологии; p<0,05, t-критерий Стьюдента.

На 73-й день исследования амплитуда a- и b-волн в группе контроля патологии достигала наименьшего значения, снижаясь на 25 и 36% соответственно относительно исходного уровня и значимо отличаясь от группы интактных животных (p<0,05). В группах ПК во всех дозах снижение амплитуды a-волны было слабо выражено в сравнении с группой плацебо, однако значимых отличий от интактной группы и группы плацебо не выявлено. Изменение амплитуды b-волны в группах ПК отличалось дозозависимостью, при этом только у животных, получавших ретиналамин в максимальной дозе, имелись значимые отличия от показателей группы плацебо.

Морфологические исследования подтвердили наличие глаукоматозных повреждений сетчатки: в группе контроля патологии наблюдались специфичные для глаукомы изменения сетчатки, проявлявшиеся в развитии гибели нейронов ганглионарного слоя при незначительных изменениях других слоев сетчатки. ППК проявил нейропротективную активность при воздействии на сетчатку, качественно и количественно проявлявшуюся в уменьшении нейрональной гибели в ганглионарном слое сетчатки. Нейропротективный эффект характеризовался прямой дозозависимостью: КИ снижался в меньшей степени при введении препарата в дозе 0,214 мг/кг и в наибольшей степени — при максимальной дозе 0,857 мг/кг. В группе контроля патологии наблюдались очаги разрежения фоторецепторного и наружного ядерного слоев сетчатки, терапия же привела к значительному сглаживанию картины патологии.

По результатам морфологического исследования головного мозга, у животных из группы контроля патологии наблюдали изменение венозной микроциркуляции и параваскулярных пространств, гиперхромию и пикноз ядер. Нейроны, имеющие реактивную природу, наблюдались очагово, преимущественно в средних и крупных пирамидных нейронах, более чувствительных к гипоксии, и имели реактивный характер.

В группах ПК препарат оказал нейропротективное действие во всех исследованных дозах. Нейропротекция проявлялась в отношении звездчатых нейронов внутреннего гранулярного слоя, несмотря на наличие микроциркуляторных нарушений, которые могли быть непосредственной причиной тяжелых нейрональных повреждений.

Обсуждение

Сетчатка глаза содержит приблизительно 1,5 млн ГКС с предполагаемой скоростью их потери 0,4% в год из-за нормального физиологического старения, которая увеличивается до 4% в год у пациентов с глаукомой [12]. Потеря ГКС часто характеризуется как самая ранняя форма гибели клеток при глаукоме, и снижение функции ГКС в конечном счете является причиной потери полей зрения [13]. В литературе описаны также другие теории прогрессирования глаукомы [14—17], которые, однако, не отрицают значимости состояния ГКС при глаукоме. Большая часть аксонов ГКС заканчиваются за пределами глазного яблока. Около 70% волокон зрительного тракта, формируя ретиногеникулярные пути, заканчиваются в наружном коленчатом теле, в составе которого проходят магноцеллюлярный, парвоцеллюлярный и кониоцеллюлярный зрительные пути. Для глаукомных процессов характерно поражение зрительного центра мозга. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что развитие глаукомы у экспериментальных крыс сопровождалось гибелью нейронов ганглионарного слоя сетчатки, при этом наблюдались также отклонения от нормы в других слоях сетчатки, что предположительно связано с увеличением гидродинамической нагрузки в камерах глаз. Одновременно с этим характерные изменения формировались в подкорковых зрительных центрах.

В ходе эксперимента наблюдались изменения длины волны на ЭРГ: амплитуда a- и b-волн значимо снижалась при формировании патологии, что указывает на частичную потерю функциональной способности сетчатки к передаче импульса. Следует отметить также тот факт, что нейропротекция на фоне введения ретиналамина заметно проявлялась в отношении звездчатых нейронов внутреннего гранулярного слоя, которые являются возбуждающими в межнейронных цепях, а также конечным звеном для афферентных зрительных путей.

Наиболее значимым для прогноза эффективности ЛП на модели глаукомы показателем ЭРГ была признана амплитуда b-волны: прослеживалась прямая зависимость между снижением коэффициента изменения ганглиарного слоя сетчатки и амплитудой b-волны. Обращает на себя внимание также корреляция между снижением амплитуды a-волны в группе контроля патологии и тенденция к увеличению ее амплитуды в группах терапии ретиналамином с результатами гистологии фоторецепторного слоя, что расценивается как отклонение от нормы, развивающееся на фоне гидродинамической нагрузки в камерах глаза.

Заключение

По результатам проведенного исследования на основании комплексных результатов для групп контроля патологии и позитивного контроля был сделан вывод о том, что определение амплитуд a- и b-волн ЭРГ может быть использовано в доклинических исследованиях глаукомы в качестве показательного прижизненного метода диагностики состояния сетчатки глаза животных. Использование данного метода особенно ценно для проведения доклинических исследований ЛП, предполагающих длительное применение, когда использование только офтальмоскопии и измерения ВГД не может в полной мере охарактеризовать течение глаукомы, а эвтаназия животных представляется излишней и негуманной.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.К., А.С.П.

Сбор и обработка материала: А.С.П., А.Д., А.А.П., М.П.

Статистическая обработка данных: А.С.П., А.Д., А.А.П., М.П.

Написание текста: А.К., А.С.П., Д.А

Редактирование: А.С.П., А.Д., А.А.П., М.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.