За последние годы «клинический портрет» ретинопатии недоношенных (РН) претерпел значительные изменения. В структуре заболеваемости большое значение приобрели тяжелые атипичные формы патологии: задняя агрессивная форма РН и так называемая РН I зоны, развивающиеся у глубоко недоношенных детей с экстремально низкой массой тела при рождении [1—3].

Как известно, стандартом лечения классических форм РН, демонстрирующим высокую эффективность, является лазеркоагуляция аваскулярных зон сетчатки [4]. Однако при «злокачественных» формах РН данный метод лечения не обеспечивает достаточно высокую частоту стабилизации патологического процесса (его эффективность не превышает 55—77%) [5], а также имеет очевидные ограничения, связанные с обширными зонами рубцовых изменений сетчатки после массивной лазеркоагуляции и соответствующим сужением полей зрения, миопией высокой степени, а также нарушением развития переднего сегмента глаза [6—8].

Альтернативой лазеркоагуляции аваскулярной зоны сетчатки при задней агрессивной форме РН и РН I зоны стало интравитреальное введение антиангиогенных препаратов [9]. Однако данный метод лечения при очевидных преимуществах (относительная простота и быстрота процедуры, быстрое развитие первичного эффекта, отсутствие «блокады» периферической сетчатки с возможностью продолжения роста сосудов и созревания сетчатки, меньшая частота развития и степень миопизации) также не лишен серьезных недостатков, таких как длительный период возможного появления рецидивов (до 70 нед), требует длительного наблюдения и частых осмотров, риск развития тракционных фиброваскулярных мембран, риск побочных системных эффектов, влияющих на развитие незрелых органов недоношенных детей [9—13].

Таким образом, в силу недостаточной эффективности и безопасности имеющихся методов лечения очевидной становится важность поиска новых возможностей профилактики развития «современной» РН как основы снижения инвалидности по зрению вследствие данной патологии. В серии проведенных нами ранее работ на модели экспериментальной РН (ЭРН) на новорожденных крысятах было показано, что интраперитонеальное введение экзогенного мелатонина в период развития сосудистой системы сетчатки крысят, находящихся в опытных условиях, т.е. на доклинической стадии развития патологии, предотвращает появление гистологических признаков развития ЭРН, способствует стабилизации гематоретинального барьера и оказывает выраженное антиоксидантное действие [14]. Превентивные свойства мелатонина открыли перспективы для проведения дальнейших исследований, в том числе направленных на изучение эффективности его аналогов, поскольку потенциальное применение в клинической практике нативного мелатонина ограничено его полифункциональностью и связанным с этим высоким риском побочных эффектов.

Цель работы — изучение механизмов влияния мелатонина и его аналогов на развитие ЭРН на доклинической стадии патологического процесса для обоснования новых подходов к профилактике РН в клинической практике.

Материал и методы

Исследование было выполнено на 42 крысятах породы Вистар (84 глаза) в соответствии с ГОСТ 53434—2009 от 02.12.09 «Принципы надлежащей лабораторной практики GLP», постановлением главного государственного врача РФ №51 от 29.08.14 «Об утверждении СП 2.2.1.3218—14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)»«, Федеральным законом №61-ФЗ от 12.04.10 «Об обращении лекарственных средств». Протокол исследования был утвержден локальным этическим комитетом. Крысята были разделены на 6 групп: контрольная группа, опытная группа (крысята с ЭРН), опытные группы на фоне введения мелатонина, а также трех его аналогов — K-148, AL-3 и K-096.

Применяемая в работе модель ЭРН на новорожденных крысятах разработана и описана нами ранее, подтверждена иммуногистохимическими и гистологическими исследованиями, выявляющими характерные признаки заболевания, которые соответствуют 1—3-й стадиям активной фазы РН у детей [15].

Контрольную группу составили крысята, с момента рождения находившиеся в условиях с нормальным содержанием кислорода.

Еще четырем группам крысят, находившихся в опытных условиях, с 1-х по 14-е сутки интраперитонеально вводили раствор мелатонина (Sigma-Aldrich, США) или его аналогов по 0,1 мг в 30 мкл стерильного 0,05 М фосфатного буферного раствора (pH 7,4), содержащего 10% диметилсульфоксида. Аналоги мелатонина были синтезированы на кафедре медицинской химии и тонкого органического синтеза МГУ им. М.В. Ломоносова.

Крысят выводили из эксперимента на 7-е сутки (по 4—5 крысят, т.е. 8—10 глаз, из каждой группы на каждом сроке исследования). Всем крысятам проводили бинокулярную энуклеацию, выделяли сетчатки, гомогенизировали, после чего определяли концентрацию в гомогенатах фактора, индуцированного гипоксией (HIF-1α) и сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGF-А) методом иммуноферментного анализа (ELISA kit for hypoxia inducible factor 1 alpha, ELISA kit for VEGF A; Cloud-Clone Corp., США) и концентрацию общего белка по Лоури. Содержание HIF-1a и VEGF-А приводится в пересчете на количество белка в гомогенате сетчатки.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием статистических пакетов Microsoft Excel и Statistica 10.0. Для оценки достоверности различий между группами с уровнем значимости не менее 95% был применен непараметрический U-критерий Манна—Уитни.

Результаты

Сравнительный анализ показал, что средний уровень HIF-1α в сетчатке крысят опытной группы (34,5±5,7 пг/мг белка) достоверно превышал данный показатель в контрольной группе (16,4±3,9 пг/мг белка; p<0,05). Интраперитонеальное введение мелатонина и его аналогов (К-148, AL-3, К-096) крысятам опытной группы приводило к снижению уровня данного регуляторного фактора практически до контрольных значений — 20,2±1,2; 14,2±3,7; 15,1±4,7 и 14,9±2,7 пг/мг белка соответственно (рис. 1). При этом аналоги К-148 и К-096 оказывали значимо более выраженное влияние на величину данного показателя, по сравнению с мелатонином (p<0,05).

Рис. 1. Средний уровень HIF-1α в сетчатке крысят исследуемых групп на 7-е сутки эксперимента.

Сходные результаты были получены при анлизе содержания VEGF-A. Его средний уровень в сетчатке крысят опытной группы, как и уровень HIF-1α, достоверно превышал данный показатель в контрольной группе — 52,2±3,6 и 34,3±3,7 пг/мг белка соответственно (p<0,05). Применение мелатонина и его аналогов (К-148, AL-3, К-096) приводило к нормализации этого показателя, снижая его до уровня контроля — 30,7±3,2; 35,6±2,5; 40,9±4,3 и 34,4±2,4 пг/мг белка соответственно (рис. 2). При этом в отличие от HIF-1α влияние мелатонина было достоверно более выраженным по сравнению с его аналогами (p<0,05).

Рис. 2. Средний уровень VEGF-A в сетчатке крысят исследуемых групп на 7-е сутки эксперимента.

Обсуждение

Важно отметить, что 7-е сутки эксперимента в применяемой модели заболевания соответствуют сроку персистенции аваскулярных зон сетчатки, т.е. доклинической стадии развития патологического процесса. Нормализация уровней изучаемых ангиогенных факторов на фоне введения мелатонина и его аналогов именно на данном сроке свидетельствует об их превентивных свойствах и раскрывают механизм показанного ранее влияния на развитие патологической неоваскуляризации при РН.

Роль VEGF-А в развитии патологической вазопролиферации при РН довольно широко изучена и лежит в основе применения анти-VEGF- препаратов в лечении определенных форм РН во вторую фазу заболевания [16, 17]. Ангиогенные свойства HIF-1α также являются предметом активного изучения. Известно, что важнейшее свойство HIF-1α — способность к стимуляции экспрессии VEGF-А. Содержание активного HIF-1α в клетках снижается в условиях гипероксии и повышается при возвращении в условия нормоксии, что коррелирует с экспрессией VEGF-А. В период внутриутробного развития низкие концентрации кислорода подавляют активность пролилгидроксилазы, инактивирующей HIF-1a, в результате чего растет локальная концентрация активного HIF-1a и, как следствие, VEGF, что, в свою очередь, способствует нормальному васкулогенезу [18]. В нашей работе в сетчатке крысят с ЭРН содержание этих факторов роста было повышено еще до начала патологической вазопролиферации, что, вероятно, является причиной ее индукции в дальнейшем. Показанное в более ранних наших работах положительное влияние мелатонина на развитие ЭРН [14] можно объяснить блокадой данных факторов на столь раннем сроке.

Особого внимания заслуживают данные, полученные в отношении аналогов мелатонина, ввиду большей перспективности применения последних в клинической практике по сравнению с нативным мелатонином. Известно, что мелатонин представляет собой крайне полифункциональную молекулу. В многочисленных исследованиях было показано, что он обладает широким спектром антиоксидантных, противовоспалительных, нейропротекторных, а также антиангиогенных свойств [19—22]. Однако следует также помнить, что прежде всего он играет ключевую роль в регуляции циркадных ритмов, а также принимает участие в функционировании репродуктивной, цереброваскулярной, нейроэндокринной, иммунной и зрительной систем [23], так что его применение у недоношенных детей, особенно в раннем постнатальном периоде, может приводить к нарушению нормального созревания и функционирования данных систем. Важно отметить, что различные подтипы мелатониновых рецепторов широко представлены практически во всех структурах глаза, и воздействие на них может приводить к разного рода физиологическим и биохимическим изменениям в различных внутриглазных тканях. Поэтому особую важность приобретает вопрос применения селективных агонистов (или антагонистов) конкретных рецепторов мелатонина, что будет способствовать повышению эффективности выбранного лечения при одновременном снижении возможных побочных действий.

Заключение

Полученные в данной работе результаты позволяют рассматривать применение изученных нами аналогов мелатонина в качестве перспективных средств профилактики развития РН. Требуется дальнейшее изучение механизмов, а также эффективности и безопасности их действия с целью возможности внедрения рассматриваемых препаратов в клиническую практику.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.К., Н.Ч.

Сбор и обработка материала: О.Б., Н.О., А.П.

Статистическая обработка: О.Б.

Написание текста: Н.О.

Редактирование: Л.К., Н.Ч.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.