Впервые термин «иммунная привилегия» был предложен P. Medawar в 1948 г. при описании способности некоторых тканей изменять иммунный ответ для максимального сохранения основных свойств [1]. Известно, что глаз относят к иммунологически привилегированным органам, характеризующимся наличием регуляторных механизмов, направленных на подавление индукции иммунного ответа (афферентная блокада), его изменение благодаря развитию иммунной толерантности, а также удаление эффекторных иммунных клеток за счет действия специфических молекул (эфферентная блокада) [2, 3].
Афферентная блокада определяется свойствами роговичной ткани (отсутствием кровеносных и лимфатических сосудов, низким содержанием антигенпрезентирующих дендритных клеток и макрофагов) и наличием гематоофтальмического барьера. Иммунная толерантность обусловлена низкой экспрессией антигенов главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) I типа и отсутствием выработки белков MHC II типа клетками роговицы в покое [4].
Кроме того, по данным многочисленных исследований, существует «иммунное отклонение, связанное с передней камерой» (anterior chamber associated immune deviation, ACAID), при котором в ответ на появление антигенов происходит активация только CD8+ T-лимфоцитов [5, 6]. К регуляторным молекулам, экспрессируемым на мембранах эндотелиальных клеток (ЭК), относят CD86-лиганд, который, связываясь с рецепторами на поверхности T-лимфоцитов, препятствует их активации, CD95- и PD-лиганды (programmed death-ligand, PDL), индуцирующие апоптоз активированных T-лимфоцитов, их пролиферацию, а также выработку провоспалительных цитокинов [7, 8]. Еще одним компонентом эфферентной блокады иммунного ответа служат некоторые биологически активные эндогенные вещества (цитокины, хемокины и факторы роста), входящие в состав внутриглазной жидкости (ВГЖ) и обеспечивающие межклеточные взаимодействия [9].
Известно, что ВГЖ представляет собой прозрачную субстанцию, заполняющую переднюю и заднюю камеры глаза и формирующую внутриглазное давление (ВГД). Она образуется путем диффузии, ультрафильтрации и активной секреции плазмы крови и растворенных в ней веществ через стенки центральных артериол цилиарных отростков. Установлено, что ВГЖ отличают низкая концентрация белков и повышенное содержание хлорид-, лактат-, аскорбат-анионов в сравнении с плазмой крови [10, 11]. Вероятно, это связано с избирательной проницаемостью гематоофтальмического барьера, образуемого беспигментными эпителиальными клетками цилиарного тела. Кроме того, изменение состава ВГЖ часто является отражением развития патологического процесса в переднем отрезке глаза.
Все цитокины ВГЖ могут быть разделены на классы по доминирующему биологическому действию: провоспалительные (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α, IFNγ, MCP-1, MIP-1β), противовоспалительные (IL-4, IL-7, IL-8, IL-10), факторы, влияющие на рост и дифференцировку лимфоцитов (IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IL-17), и факторы роста (в том числе G-CSF, GM-CSF) [12, 13].
В последние годы было показано, что изменение концентрации эндогенных биологически активных веществ в ВГЖ тесно связано с уменьшением плотности ЭК роговицы, приводящим к эндотелиальной дисфункции с развитием длительного стромального отека и буллезных изменений эпителия (буллезная кератопатия — БК). Однако опубликованные исследования были выполнены с включением пациентов, относящихся только к азиатской популяции. В связи с этим полученные результаты не могут в полной мере отражать патологические процессы, лежащие в основе эндотелиальной дисфункции роговицы [14].
Как известно, нарушение эндотелиального барьера может быть обусловлено наследственной патологией — дистрофией Фукса (ДФ), когда ЭК приобретают фенотип фибробластов и начинают синтезировать каплевидные образования (гутты). К причинам развития БК относят механическое повреждение ЭК при проведении интраокулярных хирургических вмешательств, длительное отсутствие компенсации ВГД и инфекционные заболевания роговицы. Несмотря на различную этиологию БК, снижение барьерной функции эндотелиального слоя роговицы в большинстве случаев связано с нарушением целостности плотных и щелевидных межклеточных контактов, а также с развитием апоптоза ЭК [15, 16].
Цель исследования — изучение содержания эндогенных биологически активных веществ во внутриглазной жидкости у пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса и буллезной кератопатией.
Материал и методы
В исследование были включены 74 пациента (74 глаза). Первую группу составил 31 пациент с диагнозом эндотелиальная ДФ. Среди них 12 мужчин и 19 женщин. Средний возраст исследуемых был равен 72,7±9,2 года. Вторая группа была представлена 35 пациентами (23 мужчины, 12 женщин) с БК. Средний возраст составил 72,4±9,1 года (табл. 1). До операции всем больным измеряли толщину центральной зоны роговицы (RTvue-100 OCT, Optovue, США).
Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов
| Показатель | ЭД Фукса | БК | Контроль |
| Количество глаз | 31 | 35 | 8 |
| Пол (м/ж) | 12/19 | 23/12 | 1/7 |
| Возраст, годы | 72,7±9,2 | 72,37±9,06 | 74,25±4,13 |
| Толщина роговицы (мкм) | 764,61±100,35 | 777,14±136,35 | 554,0±25,01 |
Пациентам 1-й и 2-й групп была выполнена задняя послойная кератопластика (автоматизированная эндотелиальная кератопластика с удалением десцеметовой мембраны, Descemet’s stripping automated endothelial keratoplasty (DSAEK), изолированная трансплантация десцеметовой мембраны с эндотелием, Descemet’s membrane endothelial keratoplasty (DMEK), или сквозная кератопластика (СКП).
В контрольную группу были включены 8 пациентов (8 глаз), сопоставимых по возрасту с больными основных групп, с диагнозом незрелая катаракта, которым была проведена факоэмульсификация с имплантацией интраокулярной линзы.
Критериями исключения пациентов из исследования были отсутствие компенсации ВГД, наличие острых воспалительных заболеваний глаз, гемофтальма, аутоиммунных и неопластических заболеваний любой локализации.
У всех пациентов на начальном этапе операции через парацентез инсулиновым шприцом с иглой 30G были взяты образцы ВГЖ (100—150 мкл), которые затем хранили при температуре –80 °C. Перед проведением иммунологического анализа образцы ВГЖ размораживали при температуре 18—20 °C и центрифугировали при температуре 4 °C со скоростью 10 000 об./мин в течение 10 мин.
Определение концентрации цитокинов (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, MCP-1, MIP-1β и TNF-α) в ВГЖ выполняли лазерным иммуноанализатором Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США) методом флуоресцентной проточной цитометрии с использованием стандартной 17-плексной тест-системы Bio-Plex Pro Human Cytokine Grp I Panel 17-plex (Bio-Rad, США).
Последующую обработку результатов осуществляли с помощью приложения Bio-Plex Manager 6,0 Properties (Bio-Rad, США). Статистический анализ данных проводили с использованием программы SPSS 23 (IBM). Согласно тесту Колмогорова—Смирнова, был выявлен ненормальный тип распределения переменных, в связи с чем в дальнейшем были использованы методы непараметрической статистики. Для оценки значимости различий между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна—Уитни. Полученные данные представлены в виде среднего, минимального и максимального значений. Статистически значимыми различия считали при p<0,05.
Результаты и обсуждение
При анализе концентрации эндогенных биологически активных веществ в ВГЖ у пациентов 1-й и 2-й групп статистически значимых различий выявлено не было (табл. 2).
Таблица 2. Уровень цитокинов (пг/мл) во внутриглазной жидкости у пациентов с эндотелиальной дистрофией Фукса и буллезной кератопатией
| Показатель | ЭД Фукса (n=31) | БК (n=35) | Контроль (n=8) | p* | p** | p*** | |
| Mean [min; max] | Mean [min; max] | Mean [min; max] | |||||
| Interleukin-1β | IL-1β | 0,040 [0,01; 0,15] | 0,060 [0,01; 0,17] | 0,045 [0,04; 0,06] | 0,688 | 0,537 | 0,372 |
| Interleukin-2 | IL-2 | 0,790 [0,63; 0,95] | 0,790 [0,55; 1,11] | 0,790 [0,63; 0,95] | 0,232 | 0,269 | 0,558 |
| Interleukin-4 | IL-4 | 0,030 [0,02; 0,32] | 0,030 [0,02; 0,53] | 0,040 [0,03; 0,14] | 0,056 | 0,002 | 0,235 |
| Interleukin-5 | IL-5 | 0,890 [0,59; 57,96] | 0,820 [0,59; 130,72] | 0,970 [0,82; 1,04] | 0,552 | 0,422 | 0,943 |
| Interleukin-6 | IL-6 | 10,460 [0,92; 2614,46] | 21,560 [1,19; 4172,30] | 2,085 [0,70; 3,84] | 0,008 | <0,0005 | 0,133 |
| Interleukin-7 | IL-7 | 0,150 [0,11;1,19] | 0,150 [0,11; 1,59] | 0,140 [0,13; 0,16] | 0,025 | 0,056 | 0,927 |
| Interleukin-8 | IL-8 | 2,230 [0,13; 150,67] | 4,970 [0,13; 206,37] | 0,130 [0,04; 0,48] | <0,0005 | <0,0005 | 0,179 |
| Interleukin-10 | IL-10 | 0,050 [0,04; 0,48] | 0,050 [0,03; 0,42] | 0,050 [0,04; 0,06] | 0,836 | 0,659 | 0,747 |
| Interleukin-12 | IL-12 | 0,180 [0,16; 0,35] | 0,180 [0,12; 0,46] | 0,180 [0,16; 0,20] | 0,956 | 0,732 | 0,504 |
| Interleukin-13 | IL-13 | 0,080 [0,06; 0,09] | 0,080 [0,06; 2,19] | 0,080 [0,08; 0,09] | 0,003 | 0,016 | 0,882 |
| Interleukin-17 | IL-17 | 0,040 [0,03; 0,46] | 0,040 [0,03; 0,46] | 0,040 [0,03; 0,15] | 0,519 | 0,537 | 0,929 |
| Granulocyte Colony-Stimulating Factor | G-CSF | 0,080 [0,05; 53,66] | 0,100 [0,05; 1999,13] | 0,080 [0,07; 0,08] | 0,241 | 0,052 | 0,536 |
| Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor | GM-CSF | 0,080 [0,06; 0,83] | 0,080 [0,06; 1,09] | 0,10 [0,09; 0,11] | 0,004 | <0,0005 | 0,053 |
| Interferon γ | IFNγ | 2,720 [0,66; 18,41] | 2,480 [0,04; 25,22] | 0,935 [0,24; 1,0] | <0,0005 | 0,001 | 0,928 |
| Monocyte Chemoattractant Protein-1 | MCP-1 | 102,550 [49,97; 417,50] | 110,600 [16,71; 522,86] | 57,165 [32,49; 61,62] | 0,001 | <0,0005 | 0,964 |
| Macrophage Inflammatory Protein-1β | MIP-1β | 1,170 [0,26; 7,20] | 1,510 [0,12; 9,84] | 0,705 [0,26; 1,01] | 0,005 | 0,055 | 0,662 |
| Tumor Necrosis Factor α | TNF-α | 0,700 [0,20; 1,52] | 0,700 [0,17; 2,55] | 0,700 [0,20; 0,94] | 0,455 | 0,419 | 0,732 |
Примечание. p* — сравнение пациентов с ЭД Фукса и контрольной группы. Критерий Манна—Уитни; p** — сравнение пациентов с БК и контрольной группы. Критерий Манна—Уитни; р*** — сравнение групп пациентов с ЭД Фукса и БК. Критерий Манна—Уитни. Полужирным шрифтом выделены статистически достоверные различия между группами (p<0,05).
Вероятно, это обусловлено тем, что в исследование были включены пациенты с ДФ на стадии декомпенсации (выраженный отек роговицы и буллезные изменения эпителия) и БК — состояниями, являющимися показанием для проведения хирургического лечения (DMEK, DSAEK или СКП). Так, средняя толщина роговицы в центральной зоне у больных 1-й группы составила 764,61±100,35 мкм, у пациентов 2-й группы — 777,14±136,35 мкм. Статистически значимых достоверных различий между группами не обнаружено (см. табл. 1).
При сравнении уровня IL-1β и TNF-α в ВГЖ у пациентов основных и контрольной групп не выявили статистически значимых различий (см. табл. 2), что свидетельствует об отсутствии локального острого воспалительного процесса.
Вместе с тем было отмечено достоверное отличие уровня IL-6, IL-8, GM-CSF, IFNγ, MCP-1, MIP-1β в ВГЖ у пациентов с ДФ и БК по сравнению с показателями пациентов контрольной группы (см. табл. 2).
IL-6 относят к мультифункциональным цитокинам, экспрессируемым иммунными (T-лимфоцитами, дендритными клетками, макрофагами) и неиммунными клетками (эпителиальными клетками, кератоцитами и ЭК). IL-6 обеспечивает сохранение T-клеток в очаге воспаления, индуцируя в них синтез белков-ингибиторов апоптоза (Bcl-2) [17]. IL-8 является α-хемокином, продуцируемым моноцитами/макрофагами, естественными киллерами (natural killers, NK), а также Th2-субпопуляцией CD4+-клеток. Он служит медиатором воспаления, обеспечивая миграцию гранулоцитов, моноцитов/макрофагов и лимфоцитов в патологический очаг [18]. Полученные нами данные согласуются с результатами, описанными в работе J. Rosenbaum и соавторов. Проведенное ими иммуногистохимическое исследование роговичных дисков, полученных при СКП у пациентов с БК, показало высокий уровень экспрессии IL-8 в эпителиальных клетках, кератоцитах и ЭК [19].
К провоспалительным цитокинам, индуцирующим пролиферацию и дифференцировку макрофагов стромы роговицы, также относят GM-CSF. Основным источником данного фактора служат Th1-лимфоциты, реже Th2- и CD8+-клетки [17]. Результаты мультиплексного анализа ВГЖ свидетельствуют о высокой концентрации GM-CSF в ВГЖ у пациентов с ДФ и БК, подтверждая наличие хронического локального воспалительного процесса (см. табл. 2). Сходные данные были получены T. Yamaguchi и соавторами, изучившими состав ВГЖ у пациентов с БК и низкой плотностью ЭК [20].
По данным мультиплексного анализа ВГЖ, у пациентов с ДФ и БК была обнаружена повышенная концентрация β-хемокинов MCP-1 и MIP-1β в сравнении с контролем (см. табл. 2). Подобные результаты были получены H. Yazu и соавторами при изучении состава ВГЖ у пациентов с БК [21]. Основным источником данных цитокинов являются макрофаги/моноциты стромы роговицы. В свою очередь, эти биологически активные эндогенные вещества служат хемоаттрактантами для моноцитов, Th1-клеток и NK [18]. M. Matthaei и соавторы показали, что у пациентов с ДФ в стадии декомпенсации в ВГЖ содержится MCP-1 в высокой концентрации. Данный фактор, являясь одним из медиаторов эпителиально-мезенхимального перехода, способствует приобретению ЭК фенотипических признаков фибробластов, а также рубцеванию экстрацеллюлярного матрикса стромы роговицы [22].
Также нами было выявлено достоверное повышение уровня IFN-γ в ВГЖ у пациентов 1-й и 2-й групп в сравнении с контрольной (см. табл. 2). Основной функцией данного цитокина является его участие в регуляции звеньев иммунного ответа. В связи с особенностями иммунной толерантности роговичной ткани основным источником IFN-γ служат CD8+-цитотоксические клетки (T-лимфоциты, CD8-лиганды которых связываются с молекулами MHC I типа ЭК) [17]. В исследовании I. Lahdou и соавторов, проведенном in vitro, было показано, что IFN-γ в высоких концентрациях индуцирует экспрессию молекул MHC II на мембранах ЭК роговицы. В результате происходит активация CD4+-клеток, которые затем дифференцируются в Th1- и Th2-лифоциты [23]. Вместе с тем отмечено, что IFN-γ способствует клеточному иммунитету, стимулируя продукцию субпопуляции Th1-клеток и угнетая выработку Th2-клеток [13].
Еще одним подтверждением Th1-предрасположенности иммунного ответа служит незначительное изменение уровня IL-4 и IL-13 (цитокинов, продуцируемых Th2-субпопуляцией) у пациентов с ДФ и БК по сравнению с группой контроля (см. табл. 2).
Известно, что ЭК роговицы обладают иммуномодулирующими свойствами. В исследованиях, проведенных in vitro, было показано, что ЭК, в свою очередь, препятствуют продукции IFN-γ CD4+ T-лимфоцитами. Кроме того, ЭК содержат на своих мембранах PDL1, которые, связываясь с PD молекулами Th-клеток, подавляют их превращение в Th1-лимфоциты [24]. Проведенные P. Sagoo и соавторами исследования показали, что длительная экспозиция (48 ч) культуры ЭК с раствором, содержащим такие провоспалительные цитокины, как IFN-γ, TNF-α, IL-lβ, способствует экспрессии индуцированной NO-синтазы (iNOS), катализирующей образование оксида азота (NO), обладающего цитотоксическим действием [25]. Результаты анализа образцов ВГЖ, полученных при проведении СКП, DMEK и DSAEK у пациентов с различной патологией роговицы, свидетельствуют о наличии прямой корреляции между высокой концентрацией IFN-γ и быстрым снижением плотности ЭК в послеоперационном периоде [20].
Заключение
Результаты проведенного исследования свидетельствуют о повышении концентрации в ВГЖ при ДФ в фазе декомпенсации и БК таких цитокинов, как IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1, MIP-1β. Изменение данных показателей обусловливает развитие хронического локального воспаления, приводящего к ремоделированию роговичной ткани с исходом в фиброз. Проведенный мультиплексный анализ не выявил достоверных различий уровня эндогенных биологически активных веществ у пациентов с ДФ в фазе декомпенсации и БК. Полученные данные позволяют рассматривать эти состояния как патологический процесс, возникающий на фоне нарушения одного из механизмов, обеспечивающих «иммунную привилегию» глаза, ключевую роль в котором играют ЭК роговицы и эндогенные биологически активные вещества водянистой влаги передней камеры.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Н.Ф., С.Т.
Сбор и обработка материала: С.Т., К.А., В.В., А.С., Н.Ф.
Статистическая обработка: Н.Ф.
Написание текста: Н.Ф.
Редактирование: С.Т., В.В.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.