Известно, что некоторые длины электромагнитных волн оказывают фотодинамический эффект. Для усиления этого действия часто применяют фотосенсибилизатор. Одним из таких методов воздействия на ткань является метод кросслинкинга (КРЛ) роговичного коллагена. Этот метод основан на возбуждении фотосенсибилизатора (рибофлавина) под воздействием ультрафиолетовых лучей спектра А (УФА), образовании активных форм кислорода и сшивании волокон коллагена в роговице.
Результаты экспериментов in vitro свидетельствуют о том, что в ходе КРЛ происходит повышение биомеханической прочности роговицы и изменение свойств ткани, приводящее к повышению температуры денатурации коллагена при гидротермальной обработке [1, 2], а также повышению устойчивости к различным ферментам, ответственным за разрушение коллагена [3]. Все перечисленные эффекты КРЛ на ткань роговицы, такие как повышение биомеханической прочности, повышение устойчивости к термовоздействию и ферментам, обеспечивают лечебный эффект КРЛ при инфекционном кератите. Помимо этого, по мнению ряда авторов, КРЛ воздействует непосредственно на бактериальные ферменты, замедляя их действие и частично их дезактивируя [4, 5]. Так, E. Spoerl и соавт. [3] в исследовании на свиных роговицах показали, что после КРЛ устойчивость роговицы к пищеварительной коллагеназе и пепсину повысилась в 2 раза.
Однако наиболее важным воздействием КРЛ является антимикробный эффект, который возникает за счет взаимодействия УФА с рибофлавином [4]. Первоначально антимикробное действие фотосенсибилизации с использованием рибофлавина для устранения патогенов нашло применение в области трансфузиологии. Технология подавления патогенов (PRT), используемая в системе Mirasol PRT (Terumo BCT, Лейквуд, Колорадо) и разработанная для снижения риска передачи инфекции при проведении трансфузии, также основана на возбуждении молекул рибофлавина [6]. Данный метод эффективно уничтожает широкий спектр микроорганизмов. Механизм действия представлен непосредственным влиянием УФА на генетический материал микробов, неспецифическим повреждением в результате окислительного стресса и более специфическим эффектом, основанным на интеркаляции рибофлавина, приводящей к окислению гуанина ДНК/РНК микробов [7].
Метод используется в лечении бактериальных кератитов у людей, включая бактериальные кератиты с изъязвлением, грибковые, смешанные кератиты и расплавления роговицы [8—10]. Различия в скорости наступления излечения после процедуры КРЛ могут объясняться как микробиологическими особенностями возбудителя, так и степенью прогрессирования патологического процесса — глубиной язвенного дефекта, степенью кератомаляции, длительностью заболевания, а также действием других методов лечения, применявшихся до КРЛ. По данным T. Seiler, проникновение УФА в ткани ограничено — наибольший эффект от оксидационной терапии достигается в поверхностных слоях роговицы на глубине до 300 мкм [11]. Поэтому УФ-излучение может не достигать гнойных инфильтратов и язв, захватывающих глубокие слои роговицы. Помимо этого в отличие от прозрачной стромы нормальной роговицы в плотных, непрозрачных, глубоко расположенных гнойных инфильтратах УФА лучи могут затухать быстрее и не проникать в их толщу.
Не только УФА, но и излучение других частей спектра видимого диапазона обладают самостоятельными противоинфекционными свойствами [24, 25].
Поскольку рибофлавин обладает способностью к люминесценции, он переизлучает исходный УФА в видимый зеленый свет с максимумом 525 нм, который также оказывает бактерицидный и фунгицидный эффекты в ходе процедуры КРЛ [12].
K. Makdoumi и соавторы протестировали влияние УФА и рибофлавина на бактериальные суспензии в жидком растворе. Они продемонстрировали, что воздействие в течение 60 мин обеспечивает высокую степень уничтожения бактерий in vitro, тогда как воздействие в течение 30 мин обеспечивает лишь ограниченное уничтожение [13].
Усиление антибактериального эффекта в культуре золотистого стафилококка было отмечено группой авторов при использовании люминофора хлорофилла за счет переизлучения в красную область видимого спектра [14].
В последние годы ряд авторов вместо УФ-излучения стали использовать blue-light (синий спектр излучения — ССИ) [15]. Экспериментальные работы доказали, что ССИ имеет большую длину волны (445 нм), достигает глубже расположенных слоев роговицы, что, вероятно, позволит излечить кератиты, распространяющиеся до глубоких слоев роговицы [16]. Однако данный метод еще не используется в клинической практике.
Цель исследования — оценка бактерицидного и фунгицидного действия разных спектров излучения видимого и ультрафиолетового света. В нашей работе мы исследовали их влияние на различные культуры клинически значимых микроорганизмов — бактерий и грибов, являющихся наиболее частой причиной развития гнойных кератитов.
Материал и методы
Штаммы микроорганизмов и условия культивирования. В исследование были включены коллекционные штаммы бактерий Staphylococcus aureus №ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa №ATCC 27853 (типовые представители грамположительных и грамотрицательных бактерий соответственно) и коллекционный штамм Candida albicans №ATCC 10231 — типовой представитель дрожжевых грибов. Микроорганизмы культивировали на плотных питательных средах при 37 °C в течение 24 ч. Для выращивания S. aureus и P. aeruginosa использовали кровяной агар Мюллера-Хинтона (Himedia), для культивирования C. albicans — агар Сабуро (Himedia). Каждую культуру рассевали на 5 чашек.
Облучение образцов
Сразу после равномерного заселения поверхности чашек микроорганизмами каждой культуры у 4 из 5 образцов центральную зону поверхности диаметром 1 см облучали разными спектрами света — от ультрафиолетового до красного. Один образец оставался контрольным. Время экспозиции при облучении каждым из спектральных диапазонов рассчитывали, исходя из эквивалента мощности 5,4 Дж/см2, что соответствует 3 мВт/см2. Одним из технических средств для облучения служило выпускаемое серийно устройство IROC UV-X1000 (IROC, Швейцария) с известными параметрами излучения в УФ-диапазоне: 370нм, 3 мВт/см2. Исходно устройство было разработано для проведения процедуры, известной как кросслинкинг. Для облучения образцов видимым спектром применяли сертифицированный источник медицинского света HS 150RC (Moller Wedel International, Германия) с гибким световодом и набором светофильтров. Эквивалент мощности для каждого светофильтра определяли с помощью фотометра-яркометра ТКА-ПКМ02 (ТКА, Россия). Учитывая разную ширину окна пропускания, профиль спектральной прозрачности фильтров и собственный спектральный профиль источника медицинского света, для соблюдения эквивалента дозы, получаемой микроорганизмами, при облучении применяли разную экспозицию и дистанцию (см. таблицу) от поверхности образца до волновода. Облучение проводили во влажной атмосфере (условия 100% относительной влажности), препятствующей высыханию поверхности образца.
Оценка фототоксического воздействия некогерентного светового излучения
| Группа | Длина волны, нм | Фильтр | Дистанция, см | Экспозиция, мин | Источник | Общая плотность энергии облучения, Дж/см2 |
| Контроль | ||||||
| 1-я | 675 | Красный | 5 | 30 | HS 150RC | 5.4 |
| 2-я | 500 | Зеленый | 1 | 28 | HS 150RC | 5.4 |
| 3-я | 430 | Синий | 0.1 | 43 | HS 150RC | 5.4 |
| 4-я | 370 | Нет | 5 | 30 | IROC UV-X1000 | 5.4 |
После суток культивирования облученные и необлученные зоны образцов оценивали визуально. Для получения объективной информации о метаболической активности организмов в зоне, подвергавшейся облучению, применяли метод визуализации с использованием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) с предварительным контрастированием лантаноидами. Для этого пробы подготавливали следующим образом; к заселенной микроорганизмами поверхности геля адгезивной стороной прижимали стерильное гибкое покровное стекло Thermanox Plastic Coverslip 24×30 мм (Thermanox, Калифорния, США). Затем стекло с прилипшими к нему фрагментами колонии обрабатывали растворами для подготовки к сканирующей электронной микроскопии на основе хлорида неодима и ацетата свинца BioREE-B (ООО Глаукон, РФ). Проводку осуществляли по протоколу, описанному в методической статье [17].
Визуализацию осуществляли посредством СЭМ Zeiss EVO LS10 (Zeiss, Германия) в режиме низкого вакуума (EP=70 Па) при ускоряющем напряжении 21,5 кВ и токе зонда на образце 120—200пА. Изображения захватывались с разрешением 20,2 нм на 1 точку. Подробно метод визуализации описан [17]. Объем выборки в каждом случае составлял несколько сотен индивидуальных замеров.
Оценивали:
1. Общую метаболическую активность: для ее подсчета проводили сравнение яркости изображения полистироловой подложки и микробных клеток, превышение уровня яркости последних рассчитывали в условных единицах (усл. ед.). Яркость микробной клетки на сканограмме при использовании СЭМ с лантаноидным контрастированием прямо зависит от ее метаболической активности, определяемой интенсивностью обмена фосфора.
2. Активность эффлюкс-систем — транспортных систем клеточной стенки микробной клетки, активизирующихся при ее повреждении. Этот показатель можно оценить только у бактерий. В нашем исследовании они визуализировались как точечные яркие образования на клеточной стенке бактерий; оценивали долю клеток, их имеющих.
3. Морфологическую характеристику (форму и размер) микроорганизмов: увеличение размеров микробных клеток и изменение их формы (становилась неправильной) свидетельствовали о грубом их повреждении, предшествующем гибели.
Результаты
На изображениях контрольных образцов S. Aureus, P. Aeruginosa и C. albicans, полученных при помощи СЭМ с предварительным контрастированием лантаноидами, микробные клетки имеют типичную морфологию и четкие границы. Синегнойная палочка P. aeruginosa демонстрирует палочковидную форму, микробные клетки имеют размеры, равные примерно 2 мкм, и взаимное распределение друг с другом по отношению друг к другу (рис. 1, а, рис. 2). Стафилококки S. aureus имеют шаровидную форму (размер 0,8—1,2 мкм), высококонтрастные границы и плотно прилегают друг к другу (см. рис. 1, е, рис. 2). Клетки грибов C. albicans организованы в кластеры, имеют округлую форму, размер клеток составляет от 2 до 6 мкм (см. рис. 1, л, рис. 2).
Рис. 1. Изображение колоний микроорганизмов (P. aeruginosa, S. Aureus, C. Albicans), полученное методом сканирующей электронной микроскопии с лантаноидным контрастированием (режим детекции обратно рассеянных электронов).
а, е, л — без воздействия облучения (контрольные); б, ж, м — после облучения светом красного спектра длиной волны 675 нм; в, з, н — после облучения светом зеленого спектра длиной волны 500 нм, клетки имеют неправильную форму и менее четкие границы по сравнению с контрольным изображением; г, и, о — после облучения светом синего спектра с длиной волны 430 нм; д, к, п — после облучения длиной волны 370 нм. Масштабный отрезок равен 1 мкм. Яркость клеток — показатель их жизнеспособности и метаболической активности. Темные зоны на рисунке соответствуют инактивированным микроорганизмам. Количественная оценка метаболической активности микроорганизмов приведена на рис. 2.
Рис. 2. Влияние облучения светом разной длины волны на размер и функции клеток микроорганизмов S. aureus, C. albicans, P. aeruginosa.
При облучении зеленым светом в образце S. aureus резко возрастает доля клеток с активными эффлюкс-системами, а значение относительной активности метаболизма C. albicans снижается почти в 2 раза по сравнению с контрольным образцом.
Среднее значение относительной активности метаболизма клеток контрольных образцов находится в диапазоне 40—50 усл. ед. для S. aureus и P. aeruginosa. Для C. albicans данный показатель составляет 63,5 усл. ед. (см. рис 2).
Число клеток с активными эффлюкс-системами не превышает 5 и 20% для P. aeruginosa и S. aureus соответственно (см. рис. 2). Объем выборки в каждом случае составлял несколько сотен индивидуальных замеров: при исследовании метаболической активности на культуре S. Aureus изучено 312 образцов (контроль) и 543 образца (после облучения); на культуре P. Aeruginosa — 380 (контроль) и 374 (после облучения); C. Albicans — 216 (контроль) и 208 (после облучения).
СЭМ-анализ образцов, подверженных облучению разными спектрами света, демонстрировал явные структурные и метаболические изменения в микробных клетках: нарушение формы, снижение четкости границ (см. рис. 1, ж—к), изменение относительной активности метаболизма и активности эффлюкс-систем. Наиболее выраженные нарушения наблюдались в образцах, облученных зеленым светом (500 нм). Клетки S. aureus, облученные светом данного спектра, на сканограммах имели неправильную форму и менее четкие границы по сравнению с контрольным изображением (см. рис. 1, з, рис. 2). Наблюдалось увеличение числа ярко контрастированных точек в границах клеток, что свидетельствует об увеличении активности эффлюкс-систем. На изображении C. albicans, подверженных облучению зеленым светом, клетки теряли округлость и приобретали неправильную форму (см. рис. 1, н, рис. 2).
Относительная активность метаболизма клеток, облученных зеленым светом, находилась на более низком уровне по сравнению с соответствующим показателем других образцов (контрольных образцов и образцов, облученных другими спектрами света) для всех трех исследованных микроорганизмов (см. рис. 2).
Для P. aeruginosa среднее значение относительной активности метаболизма после облучения зеленым светом составило 26 усл. ед. (p<0,01), после облучения другими спектрами света — не ниже 36 усл. ед. (при облучении красным светом — 37 усл. ед. (p<0,01), при облучении синим светом — 36 усл. ед. (p<0,01) и при облучении ультрафиолетом — 49 усл. ед. (p>0,05)). Для S. aureus данный показатель после облучения зеленым светом составлял 33 усл. ед. (p<0,01), после облучения светом других спектров не изменялся (при облучении красным и синим светом — 45 усл. ед. (p>0,05)) или, напротив, повышался (после облучения ультрафиолетом — 53 усл. ед. (p>0,05)) по сравнению с контрольным образцом.
Следует отметить, что в образце S. aureus, облученном зеленым светом, резко возросла доля клеток с активными эффлюкс-системами: она превышала соответствующий показатель контрольного образца (16,7%) более чем в 2 раза и составила 37,5%. При этом в образцах, облученных другими спектрами света, не превышала 20%. Среднее значение относительной активности метаболизма C. albicans после облучения зеленым светом снизилось почти в 2 раза по сравнению с контрольным образцом и составило 37 усл. ед. (p<0,05), после облучения светом других спектров — не менее 39,5 усл. ед. (красным светом — 59 усл. ед. (p>0,05), синим светом — 41 усл. ед. (p>0,05) и ультрафиолетом — 39,5 усл. ед. (p<0,05)).
Обсуждение
В настоящей работе исследовано действие разных спектров света на клинически значимые микроорганизмы P. aeruginosa, S. aureus и C. albicans. Наиболее выраженные отличия от контрольных образцов наблюдались в клетках, облученных зеленым светом. Под действием зеленого излучения резко нарушалась форма (становилась неправильной) и снижалась четкость границ микробных клеток, что является микроскопическими признаками их дегенерации [18]. Подобные изменения обычно наблюдаются при действии на бактерии света УФ-спектра. Например, в работе P. Gamalier и соавторов показаны микроскопические и ультраструктурные признаки повреждения бактериальных клеток под действием ультрафиолета: нарушение формы и удлинение клеток, разрушение клеточной стенки, конденсация цитоплазмы [19]. Однако в нашем исследовании излучение УФ-спектра вызывало менее выраженные изменения на сканограммах микроорганизмов по сравнению с зеленым излучением. Данное наблюдение может быть следствием двух факторов: применения УФ-излучения с длиной волны более 320 нм и отсутствия фотосенсибилизатора. Все диапазоны УФ-излучения вызывают изменения морфологии микроорганизмов, при этом наибольшее повреждающее действие оказывает излучение с длиной волны 302 нм [20]. Но даже при облучении светом такого диапазона у некоторых видов бактерий развиваются адаптивные процессы, защищающие их от повреждающего воздействия ультрафиолета [21]. Свет с длиной волны, превышающей 320 нм, оказывает значительно более слабое действие на микробные клетки. Тем не менее описаны случаи, когда в присутствии фотосенсибилизатора действие света с длиной волны 365 нм подавляло рост таких клинически значимых микроорганизмов, как Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, однако было неэффективно в отношении Candida albicans [22].
В исследованиях, проводимых в последние годы, показано, что повреждающее действие на микроорганизмы, помимо УФ-света, оказывают некоторые виды излучения видимого диапазона (фотодинамическая инактивация). Считается, что необходимым компонентом для осуществления фотодинамической инактивации микробных клеток является фотосенсибилизатор. В частности, степень инактивации бактерий (снижения количества жизнеспособных клеток) зеленым светом прямо пропорциональна концентрации фотосенсибилизаторов — эритрозина и красителя Rose Bengal [23]. M. Maclean и соавторы в 2008 г. продемонстрировали возможность повреждения бактерий видимым излучением без использования фотосенсибилизатора [24]. В данной работе исследована степень инактивации S. aureus при действии света с разными длинами волн видимого диапазона. Было выявлено, что инактивация микроорганизмов происходила под действием излучения с длиной волны в диапазоне 400—500 нм, при этом максимальная инактивация достигалась при облучении светом с длиной волны 405 нм. Воздействие светом с длиной волны более 500 нм не вызывало инактивации S. aureus.
Позднее этой же группой исследователей была продемонстрирована инактивация других клинически значимых бактерий под действием света с длиной волны 405 нм: количество жизнеспособных грамположительных микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes) снижалось практически до нуля после 120 мин экспозиции. Для инактивации грамотрицательных бактерий (Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae) требовалась более длительная экспозиция — 350 мин [25]. Действие излучения с данной длиной волны на клетки грибов не исследовалось.
В нашей работе показано, что под действием излучения зеленого спектра, даже в отсутствии фотосенсибилизатора, относительная активность метаболизма в микробных клетках (как в бактериях P. aeruginosa и S. aureus, так и в грибах C. albicans) снижалась в большей степени, чем под действием излучения с другими длинами волн (в том числе и 430 нм). Полученный результат и его отличия от результатов, описанных в других работах по фотодинамике, может быть обусловлен особенностями метода исследования. Стандартными методами, обычно применяемыми для оценки действия разных спектров света на микроорганизмы, являются подсчет жизнеспособных микробных клеток — колониеобразующих единиц, исследование подвижности и термогенеза (для оценки активности метаболизма), изучение целости клеточных структур и активности ферментов, определение количества внутриклеточных молекул ДНК и АТФ [26]. При применении СЭМ с предварительным контрастированием лантаноидами активность метаболизма микроорганизма определяется на основании активности обмена фосфорных соединений, которая не оценивалась ранее в исследованиях по фотодинамике. Однако метод СЭМ с предварительным контрастированием обладает важным преимуществом — он позволяет оценивать одновременно два параметра состояния микроорганизма: морфологию и активность метаболизма. Для полной характеристики действия зеленого излучения на микробные клетки необходимо исследование облученных микроорганизмов дополнительными методами.
Выводы
1. Метод сканирующей электронной микроскопии с лантаноидным контрастированием позволяет оценивать жизнеспособность и функциональное состояние клеток микроорганизмов на основании определения их морфологических характеристик (формы и размера) и функциональных показателей (общей метаболической активности, активации эффлюкс-систем).
2. При исследовании облученных культур Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans методом сканирующей электронной микроскопии (с лантаноидным контрастированием) показано повреждающее действие светового и УФА-излучений на клетки микроорганизмов. Наибольшей антимикробной активностью обладало излучение зеленого спектра с длиной волны 500 нм. Это проявлялось снижением общего уровня метаболической активности с 40—63 до 26—37 усл. ед. (Staphylococcus aureus (p<0,01), Pseudomonas aeruginosa (p<0,01) и Candida albicans (p<0,05)), а также ростом доли клеток с активными эффлюкс-системами в 2 раза (в культуре Staphylococcus aureus). Этот факт в дальнейшем может послужить основой для разработки метода лечения инфекционных кератитов с применением зеленого света в офтальмологии.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Е.К., И.Н
Сбор и обработка материала: И.Н., Б.Я.
Статистическая обработка данных: И.Н., Б.Я.
Написание текста: Ю.Б., Е.К., Б.Я.
Редактирование: Е.К., И.Н.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.