Новообразования кожи отличаются от новообразований других локализаций прежде всего тем, что располагаются поверхностно, а значит, доступны прямому осмотру. Отчасти поэтому и описаны они были более трех тысяч лет назад [1]. Не придерживаясь четкой классификации, древние авторы все же упоминали ряд признаков, которые и в наши дни ассоциируются со злокачественным процессом, например бугристый вид, темный цвет, неровная граница, язвенный дефект, боль. И если первоначально оценку этим и другим признакам можно было дать только качественную, то со временем стали появляться и количественные методы — от простых (измерение размеров новообразования) до сложных (например, автоматизированная компьютерная обработка дермоскопических изображений [2—4]).
Одной из самых значимых характеристик опухоли, в том числе опухоли кожи, являются ее границы. Помимо первичной диагностики они также задействованы в определении стадийности процесса, планировании объема лечения и последующей оценке его результатов [2—7]. От правильности предоперационного определения истинных границ опухоли зависит радикальность ее удаления и вероятность рецидива [7—9]. На сегодняшний день существует множество инструментальных методов исследования, которые в той или иной степени решают эту задачу, причем выбор зависит от того, о каких границах мы говорим — поверхностных или глубоких. Для уточнения поверхностных границ, помимо визуального осмотра, в основном используют дермоскопию [2—4, 10, 11]. Такие методы, как флуоресцентная визуализация [12—14], спектроскопия [15, 16] и спектрофотометрия [17], отличаются тем, что могут дать представление не только о поверхностных границах, но и о профиле глубоких границ в проекции кожи. И, наконец, толщина опухоли и собственно глубокие границы входят в компетенцию более сложных и дорогостоящих методик: УЗИ [17—19], конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [20], отражательной конфокальной микроскопии [21], оптической когерентной [22, 23] и компьютерной томографии [24].
В ФГБНУ «НИИ глазных болезней» вот уже 10 лет немалое внимание уделяют анализу флуоресцентных изображений, которые в отличие от рутинной фоторегистрации содержат информацию не столько о взаиморасположении изучаемых объектов, сколько о характере их взаимодействия [25—27]. Оригинальный метод изучения неиндуцированной аутофлуоресценции биологических тканей, а также способ определения вероятностных оптических границ новообразований были разработаны нами еще на ранних этапах проекта [14]. К настоящему моменту собрано достаточно практического материала, чтобы продолжить углубленное изучение медико-биологических основ феномена флуоресценции новообразований. В связи с этим была сформулирована цель данного исследования — сопоставить гистологические границы новообразований кожи периорбитальной области с их аутофлуоресцентными границами, проводимыми на основе анализа спектров неиндуцированной аутофлуоресценции протопорфирина IX (ППIX).
Материал и методы
В группу исследования вошли 8 пациентов с новообразованиями кожи век, периорбитальной области и смежных областей (бровной и скуловой) в возрасте от 54 до 88 лет. Все обследования и операции проводили в соответствии с этическими нормами Хельсинкской декларации 1975 г. и ее пересмотренного варианта 2000 г.
Размер новообразований варьировал от 2 до 8 мм. Клинически все новообразования имели признаки базально-клеточного рака кожи (БКР) и располагались на относительном удалении (не менее 5 мм) от таких структур, как край века, медиальный и латеральный кантусы, крыло носа, и др., где рельеф поверхности мог бы затруднить прямой осмотр и фоторегистрацию (рис. 1). Критериями исключения служили выраженные вторичные изменения (изъязвления или роговые чешуйки, закрывающие более 50% поверхности новообразования), предыдущие вмешательства, в этой зоне, включая облучение, а также применение мазей, поскольку во всех этих случаях аутофлуоресцентная картина сильно искажается.
Рис. 1. Вид новообразования, включенного в исследование (отмечено стрелками).
Далее пациентам проводили аутофлуоресцентную диагностику (АФД) по стандартной методике (без применения индукторов флуоресценции) с обработкой изображений в программе «Канцерплот» (ФГБНУ НИИГБ, регистрационный номер 2007613931 от 14.09.07). Технически способ получения и анализа флуоресцентных изображений достаточно прост и не требует больших материальных затрат. В максимальном варианте он предполагает создание специальной регистрирующей установки с набором светофильтров, зоны пропускания которых соответствуют основным флуорофорам кожи, однако возможен и более экономичный вариант с бытовым фотоаппаратом с подходящими характеристиками светочувствительной матрицы (в нашем случае — Canon EOS 350D, Япония). Прочее оборудование: светопоглощающий стенд, две люминесцентные лампы с максимумами возбуждающего излучения 390, 415 и 433 нм (Uniel, Россия) и персональный компьютер. В зависимости от расположения и размера новообразования съемку производили при помощи фотощелевой лампы (Haag-Streit, Швейцария) или со штатива.
Дальнейшая обработка полученных изображений включает несколько этапов: 1) определение коэффициента пролиферации; 2) построение вероятностных оптических границ новообразования; 3) расчет коэффициента размытости границ новообразования.
На первом этапе программа задействует принцип дифференциального спектрального анализа, согласно которому в любой точке изображения с координатами x, y определяется долевое участие красного канала (R%) по формуле: R%x,y=Rx,y/(Rx,y+Gx,y+Bx,y)×100%, где Rx,y, Gx,y, Bx,y — яркость красного, зеленого и синего канала в указанной точке. Долевое участие красного канала в общем спектре флуоресценции несет информацию о пролиферативной активности ткани в каждой точке исследуемой области и обозначается нами как «показатель пролиферации». Для оценки пролиферативной активности новообразования в целом мы высчитываем дельту пролиферации (ΔR) — разность значений показателя пролиферации для новообразования (Rtum) и прилежащих участков кожи (Rnorm) (рис. 2, а, б).
Вторым этапом производят оценку аутофлуоресцентных границ новообразования. Для этого исследователь выбирает два участка интереса: в пределах опухоли и в пределах здоровых тканей, после чего программа строит синтетическую функцию распределения удельной яркости красного канала fmodel для некой гипотетической области, где половину площади занимает новообразование, а половину — здоровая ткань (рис. 2, в, г):
,
где fmodel — синтетическая функция распределения, ntum — количество пикселей изображения, принадлежащих опухоли, nnorm — количество пикселей изображения, принадлежащих здоровым тканям, ftum(B) — функция распределения яркости красного канала для выбранного участка опухоли, fnorm(B) — функция распределения яркости красного канала для выбранного участка здоровых тканей (фон).
Затем происходит сканирование изображения на предмет соответствия локальных функций распределения f(B) синтетической функции fmodel. Совокупность вероятностей прохождения границы в каждой точке изображения составляет оптическое поле, описываемое гладкой трехмерной функцией. При программной визуализации разным значениям функции вероятности присваиваются разные оттенки серого (рис. 2, д). Для удобства восприятия программа переносит полученные вероятностные границы на исходное изображение (рис. 2, е).
Рис. 2. Этапы обработки аутофлуоресцентного изображения (скриншоты).
а—б — построение изолиний, очерчивающих области со сходным значением показателя пролиферации; в — выбор референтных зон (в пределах опухоли и в пределах прилежащих здоровых тканей); г — момент перед началом сканирования изображения для определения метаболических границ новообразования; звездочкой отмечена модельная функция распределения яркости красного канала для гипотетической области, наполовину занятой опухолью и наполовину здоровой тканью; д — поле вероятности прохождения метаболической границы опухоли (светлые оттенки — максимальная вероятность, темные — минимальная); е — вероятностные метаболические границы опухоли, перенесенные на исходное аутофлуоресцентное изображение.
Третий этап — расчет коэффициента «размытости» границ новообразования Kdith как усредненной обратной величины к вероятности прохождения границы опухоль/здоровая ткань в каждой точке:
,
где Kdith — коэффициент «размытости» границ новообразования, P — вероятность прохождения границы опухоль/здоровая ткань в каждой точке, n — количество точек, принадлежащих границе.
По завершении всех процедур обработки аутофлуоресцентных изображений исследователь должен был выбрать наиболее четко прочерченный участок вероятностной границы длиной не менее 5 мм в пределах хирургических отступов, рекомендованных для данного типа новообразований.
В день операции на кожу пациента кожным маркером наносили линию, показывающую прохождение вероятностной границы в выбранном месте. Затем в операционной хирург наносил радионожом насечку (глубиной около 2 мм) по указанной линии, после чего выполнял собственно радиоэксцизию новообразования со стандартным отступом в 3 мм. Удаленный фрагмент помещали в 10% раствор нейтрального формалина и передавали в патоморфологический кабинет.
Из образца ткани готовили парафиновые срезы, проходящие перпендикулярно плоскости насечки (рис. 3) толщиной 4—8 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином. Гистологические препараты исследовали и фотографировали на световом микроскопе Leica DM 2500.
Рис. 3. Схема приготовления препарата для последующего патоморфологического исследования.
Результаты
На АФД все новообразования проявили себя как умеренно пролиферирующие: дельта пролиферации ∆R во всех случаях составила от 3 до 8% (по данным предыдущих исследований, в норме долевое участие красного канала варьирует между соседними участками здоровой кожи в пределах 3—4%) (см. таблицу). Коэффициенты «размытости» границ Kdith лежали в диапазоне от 0,9 (низкая «размытость») до 1,69 (умеренная «размытость»). Для определения вероятности злокачественности мы применяли произведение дельты пролиферации на коэффициент «размытости» границ новообразования. Все результаты выше 5,5 (6 случаев) классифицировались как потенциально злокачественные. В двух случаях произведение показателей было меньше, чем 5,5.
Клинико-демографическая характеристика пациентов
| № пациента | Пол | Возраст | Локализация новообразования | Размер, мм | ∆R,% | Kdith | ∆R·Kdith | Гистологический диагноз |
| 1 | Ж | 62 | Верхнее веко | 2*3 | 6,20 | 1,31 | 8,12 | Солидный БКР |
| 2 | Ж | 67 | Нижнее веко | 3*4 | 7,80 | 1,80 | 14,04 | Солидный БКР |
| 3* | Ж | 81 | Периорбитальная область | 3*4 | 6,30 | 1,10 | 6,93 | Солидный БКР |
| 4* | М | 66 | Переносица | 6*5 | 6,20 | 1,24 | 7,69 | Солидный БКР |
| 5* | М | 78 | Периорбитальная область | 3*3 | 3,10 | 1,16 | 3,59 | Сенильный кератоз |
| 6 | Ж | 54 | Бровная область | 8*5 | 3,10 | 1,71 | 5,3 | Солидный БКР |
| 7 | М | 79 | Скуловая область | 4*4 | 3,90 | 1,60 | 6,24 | Солидный БКР |
| 8 | Ж | 88 | Нижнее веко | 5*4 | 6,20 | 2,10 | 13,02 | Солидный БКР |
Примечание. * — клинические примеры.
При патоморфологическом исследовании БКР солидного типа был выявлен в 7 случаях. Одно новообразование было идентифицировано как предраковое, а именно сенильный кератоз. Удаление всех новообразований было проведено в пределах здоровых тканей.
Хирургическая насечка во всех случаях злокачественного процесса располагалась в пределах гистологически неизмененных тканей, не накладываясь на опухолевый комплекс, но и не удаляясь от него более чем на 1 мм (рис. 4, в, е, и). Между краем опухолевого комплекса и насечкой ткань не имела переходных изменений.
В одном случае узлового БКР (пациент 3) мы обнаружили, что часть опухолевого комплекса со стороны насечки была прикрыта здоровым эпидермисом, что делало визуальную границу данного образования меньше гистологической (рис. 4, а—в и рис. 5). Флуоресцентные границы при этом отстояли на 0,5 мм от самой удаленной точки зоны скрытого роста.
В случае, идентифицированном как сенильный кератоз (пациент 5), насечка также располагалась на удалении не более 1,0 мм от гистологической границы патологического процесса, причем половина этого расстояния на поверхности была заполнена обильными кератиновыми массами (рис. 4, ж—и).
Рис. 4. Клинические примеры.
а — пациент 3, 81 год, БКР кожи периорбитальной области (3×4 мм, T2M0N0), аутофлуоресцентное изображение с нанесенными вероятностными метаболическими границами новообразования; б — предоперационное макрофото, видна отметка кожным маркером; в — патоморфологический препарат, окраска гематоксилином и эозином, стрелкой отмечено расположение хирургической насечки; г — пациент 4, 66 лет, БКР кожи переносицы (6×5 мм, T2M0N0), аутофлуоресцентное изображение с нанесенными вероятностными метаболическими границами новообразования; д — предоперационное макрофото, видна отметка кожным маркером; е — патоморфологический препарат, окраска гематоксилином и эозином, стрелкой отмечено расположение хирургической насечки; ж — пациент 5, 78 лет, сенильный кератоз периорбитальной области (3×3 мм), аутофлуоресцентное изображение с нанесенными вероятностными метаболическими границами новообразования; з — предоперационное макрофото, видна отметка кожным маркером; и — патоморфологический препарат, окраска гематоксилином и эозином, стрелкой отмечено расположение хирургической насечки.
Рис. 5. Макропрепарат БКР с зоной скрытого роста (пациент 3).
Отмечено расстояние от хирургической насечки до края опухолевого комплекса и до визуальной границы опухоли.
Обсуждение
По последним данным ВОЗ, в мире сохраняется тенденция к росту заболеваемости как меланомой, так и эпителиальными злокачественными новообразованиями, с преимущественным поражением лиц старше 65 лет [28, 29]. В ряде стран, в том числе в России, немеланомные опухоли кожи заняли первое место по распространенности среди злокачественных образований [30]. Как и прежде, они на 75% представлены БКР, который наиболее часто поражает область головы и шеи, особенно лицо [7, 9].
Флуоресцентная диагностика (ФД) обязана своим появлением тому факту, что ткани человека содержат множество природных флуорофоров, метаболизм которых может меняться в течение жизни и при различных заболеваниях. Так, при опухолях происходит накопление ППIX, красное свечение которого впервые наблюдал A. Policard в 1924 г. [31]. Повышенная пролиферация клеток опухоли сопряжена с повышенным метаболизмом, необходимостью привлечения из окружающих тканей дополнительных объемов веществ-предшественников и соединений, обеспечивающих энергообеспечение метаболических процессов. В этом аспекте новообразование подобно губке, впитывающей необходимые вещества, значительно обедняя при этом окружающие ткани [32]. Накопление интересующего нас ППIX — непосредственного предшественника гема — сопровождается (более того, обусловливается) выраженным дефицитом тканевого железа внутри опухоли и вокруг нее (рис. 6). При этом в первую очередь расходуются запасы внутриклеточного железа патологически измененных клеток, а затем обедняется пул внеклеточного железа окружающей ткани, причем зона такого обеднения никогда не будет четко очерченной. Объяснить это можно следующим образом. Предположим, что некое новообразование находится частично в рыхлой ткани, а частично — в более плотной, скорость диффузии в которой в два раза ниже. В этом случае компоненты, необходимые для жизнедеятельности клеток опухоли, будут быстрее и легче диффундировать в сторону новообразования со стороны более рыхлой ткани, обкрадывая соседние здоровые клетки, которые со временем начнут испытывать аналогичный недостаток ресурсов. В практическом плане это значит, что ППIX может накапливаться не только в опухолевых клетках, но и соседних здоровых клетках, испытывающих дефицит железа, необходимого для завершения биосинтеза гема.
Рис. 6. Принципиальная схема биосинтеза гемм [44].
Из вышесказанного следуют выводы: 1) границы новообразования, определяемые по данным ФД, можно (и следует) считать метаболическими границами процесса; 2) метаболическая граница такого типа всегда будет немного шире, чем гистологическая, особенно со стороны более рыхлых (а значит, имеющих больший риск прорастания опухоли) прилежащих тканей. Справедливо будет заметить, что понятие метаболической границы не следует связывать исключительно с ППIX, поскольку в принципе она может быть построена по любому метаболиту, как внеклеточному, так и внутриклеточному, принадлежащему собственно опухоли или существующему в околоопухолевом пространстве.
Отдельного пояснения заслуживает участие толщины новообразования в формировании конечной картины флуоресценции исследуемой области. Известно, что взаимодействие любого излучения с биологической тканью подразумевает его частичное рассеяние и поглощение, причем величина потерь полезного сигнала меняется под влиянием многих факторов, как то: длины волны данного излучения, пройденного им расстояния, а также состава ткани и содержания в ней меланина [33—34]. Так, у пациентов со светлой кожей остаточные 37% возбуждающего излучения с длинной волны, например, 400 нм регистрируются на глубине всего 90 мкм, в то время как при длине волны 450 нм этот показатель сразу возрастает до 150 мкм [34]. Контрастность же «красной» флуоресценции протопорфирина IX, проходящей путь в обратном направлении, т.е. из глубины ткани к ее поверхности, по нашим оценкам, снижается вдвое каждые 800 мкм. В общем случае, несмотря на затухание, периферическая граница новообразования остается флуоресцентно контрастной и доступной для определения до глубины 600—1800 мкм в зависимости от метаболической активности измененных клеток. Таким образом, данный метод хоть и не может быть использован для поиска «нижней» границы опухоли, однако способен выявить зоны скрытого роста под слоем визуально здоровых тканей.
На начальном этапе становления ФД (и вплоть до недавнего времени) не существовало технической возможности оценить слабую нативную аутофлуоресценцию ППIX у большинства новообразований, поэтому онкологическое направление ФД получило развитие только после появления так называемых индукторов флуоресценции. Их применение и сейчас более чем оправдано в случаях, когда флуоресцентная диагностика предваряет фотодинамическую терапию (ФДТ), а также интраоперационно во время вмешательств на головном мозге, желудке, органах грудной клетки и др. [35—37].
В практике, не подразумевающей дальнейшее проведение ФДТ, использование индукторов не представляется нам целесообразным в связи с вероятными местными и системными побочными эффектами. Кроме того, по нашим наблюдениям, системная или локальная индукция флуоресценции способна искажать действительные флуоресцентные границы вследствие наложения геометрии распределения и доставки индуктора на собственную геометрию опухоли. Это отчасти подтверждается исследованием, описанным C. Fritsch и T. Ruzhika, в рамках которого было проведено тщательное сравнение гистологических границ 20 БКР с флуоресцентными границами, определяемыми после обработки кожи 20% метиловым эфиром 5-аминолевулиновой кислоты (Metvix, PhoroCureASA, Осло, Норвегия) [38]. В 90% случаев границы флуоресценции были значительно шире гистологических (+0,05—3,2 мм). При этом они подчеркивают, что после нанесения фотосенсибилизатора и до момента проведения ФД следует выжидать 5 ч. Меньшее (равно как и большее) время накопления ассоциируется, по их данным, со снижением точности конечного результата. К иному выводу пришли El. K. Hoshy и соавторы, которые проводили исследование в группе из 27 пациентов с БКР кожи лица и обнаружили опухолевые комплексы в большинстве гистологических срезов (55,5% случаев), соответствующих флуоресцентной границе новообразований [39]. Из этого они сделали вывод, что ФД может использоваться лишь как предварительный этап перед удалением новообразования по Mohs. Впрочем, эти данные вызывают большие сомнения, поскольку, во-первых, ФД проводили слишком рано (через 3 ч после нанесения ALA-содержащего препарата), а, во-вторых, авторы не располагали какими-либо объективными критериями определения границ флуоресценции ППIX и руководствовались исключительно собственным визуальным восприятием. Данное обстоятельство еще раз подчеркивает первостепенную важность выбора надежного метода программной обработки изображений при проведении ФД.
Большинство используемых сегодня алгоритмов определения границ новообразований на изображениях, полученных с использованием индукторов флуоресценции, построено на вычислении цветового градиента, а также градиента яркости между здоровой тканью и наиболее измененными участками в пределах новообразования. Необходимым условием для этого является достаточная контрастность сигнала изучаемого вещества, которая, собственно, и достигается путем индукции. Что же касается слабого сигнала нативной неиндуцированной флуоресценции ППIX, то, как мы уже говорили, обычными методами он не может быть эффективно выделен среди прочих оптических сигналов ткани. При этом часть сигнала может абсорбироваться пигментами и гемоглобином, а часть рассеиваться и переизлучаться протеинами. Предложенное нами решение данной проблемы [14] основано на использовании принципа самоподобия, который подразумевает, что за истинное положение метаболической границы новообразования принимается совокупность точек изображения, для ближайшего окружения которых распределение относительной яркости флуоресценции ППIX максимально подобно синтетической функции, равно характеризующей статистические особенности флуоресценции опухоли и неизмененной ткани. В этом случае необходимость вычленять слабый сигнал флуоресценции ППIX и вводить искусственные градиенты полностью исчезает. Такое определение границ проявляет свойство инвариантности и не требует участия исследователя, кроме этапа разметки фотографии, благодаря чему вклад субъективного фактора при работе с изображением сводится к минимуму.
Важность объективного предоперационного определения границ новообразования невозможно переоценить, особенно в тех случаях, когда опухоль затрагивает сложные для реконструкции структуры, например внутренний угол глазной щели или край века. В литературе нет единого мнения относительно оптимальных хирургических отступов даже при первичном узловом БКР, не говоря уже об инфильтративной и склерозирующей формах, рецидивных опухолях и др. Так, по утверждению отечественных специалистов, отступ должен составлять в среднем 5 мм от видимой границы очага [7, 40]. Но даже при этом отмечается возможность рецидива, которая выше при рецидивных опухолях, поражениях большого размера (>10 мм), а также при локализации опухоли на коже носа, век и ушных раковин. При рецидивных опухолях рекомендуется соблюдать хирургический отступ 6 мм и более. Сходные цифры можно встретить и в зарубежной литературе. Британская академия дерматологов сообщает, что трехмиллиметровые отступы при удалении небольших (<20 мм) новообразований с четкими визуальными границами обеспечивают отсутствие рецидива в 85% случаев, более широкие отступы (4—5 мм) повышают процент безрецидивных случаев до 95%, а при первичных опухолях склерозирующего типа отступ должен быть увеличен до 15 мм [41]. Однако нередко необходимость таких обширных резекций ставится под сомнение. Например, M. Bisson и соавторы высказывались за уменьшение отступов до 3 мм [42] для небольших базалиом с четкими видимыми границами, а P. Simone и соавторы и вовсе не обнаружили рецидивов ни у одного из своих 57 пациентов с узловым БКР (размером 4—15 мм) через 36 мес после операции, выполненной с малым отступом — всего 2 мм [43].
Следует пояснить, что для большинства локализаций вопрос возможного уменьшения хирургических отступов не стоит так остро, поскольку широкое удаление не влечет за собой никаких последствий, кроме уверенности в отсутствии резидуальных очагов опухоли. Однако при расположении опухоли на лице и, в частности, на веках, акценты смещаются вследствие возможного нарушения нормального функционирования век после широко выполненной резекции со сложной реконструкцией, а это, в свою очередь, несет угрозу состоянию глаза и качеству зрения. Мы считаем, что аутофлуоресцентные границы новообразований могли бы быть использованы для обоснования решений в подобных случаях.
Заключение
На примере узлового БКР кожи лица впервые наглядно продемонстрировано соотношение гистологических и аутофлуоресцентных границ опухоли, полученных без использования индукторов флуоресценции. Во всех случаях аутофлуоресцентная граница была шире гистологической, не удаляясь от нее, однако, более чем на 1 мм. Аналогичный результат, полученный у пациента с сенильным кератозом, подтверждает, что метод успешно работает не только при злокачественных, но и при доброкачественных новообразованиях. Что касается выявленного нами умеренного расширения аутофлуоресцентных границ относительно гистологических, то данное обстоятельство видится нам преимуществом метода, поскольку нивелирует необходимость дополнительно отступать от аутофлуоресцентных границ во время операции.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Н.К., И.Н.
Сбор и обработка материала: Н.К., Д.И., А.Ф.
Статистическая обработка данных: Н.К.
Написание текста: Н.К., И.Н., А.Ф.
Редактирование: Я.Г., И.Н., Д.И.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.