Хорошилова-Маслова И.П.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России

Лепарская Н.Л.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России

Алпеева Е.В.

ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН

Воротеляк Е.А.

ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН

Мелфалан при лечении пролиферативной витреоретинопатии (экспериментальное исследование)

Журнал: Вестник офтальмологии. 2020;136(4): 19-25

Просмотров : 435

Загрузок : 2

Как цитировать

Хорошилова-Маслова И.П., Лепарская Н.Л., Алпеева Е.В., Воротеляк Е.А. Мелфалан при лечении пролиферативной витреоретинопатии (экспериментальное исследование). Вестник офтальмологии. 2020;136(4):19-25.
Khoroshilova-Maslova IP, Leparskaya NL, Alpeeva EV, Voroteliak EA. Melfalan in the treatment of proliferative vitreoretinopathy (experimental study). Vestnik Oftalmologii. 2020;136(4):19-25.
https://doi.org/10.17116/oftalma202013604119

Авторы:

Хорошилова-Маслова И.П.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России

Все авторы (4)

Пролиферативная витреоретинопатия (ПВР) — сложное гетерогенное заболевание, характеризующееся формированием мембранных образований на внутренней поверхности сетчатки. Особенностью этих мембран является наличие у них контрактильных свойств, приводящих к тракционной отслойке сетчатки с потерей зрительных функций. ПВР, будучи многофакторным патологическим процессом, чаще всего возникает как осложнение при таких клинических состояниях, как регматогенная и травматическая отслойка сетчатки. Развитие ПВР после хирургического лечения отслойки сетчатки вызывает рецидивы заболевания — неприлегание сетчатки [1].

Направленность медикаментозного воздействия связана со стадийностью ПВР. Многочисленные препараты, протестированные на моделях животных и на клеточных культурах, демонстрируют свою эффективность [2], однако многие из них имеют тяжелые побочные эффекты, и лишь некоторые используются в клинической практике. Сложность заключается и в достижении терапевтической концентрации при их системном введении. Введение препаратов интравитреально не используется в клинической практике, так как существует концепция о токсическом влиянии в отношении сетчатки, а информации об интраокулярной фармакокинетике недостаточно [3, 4]. Сведения о цитопатогенезе ПВР ориентируют офтальмологов на использование патогенетической терапии на различных стадиях заболевания: стадии воспаления-альтерации, пролиферативной стадии и стадии рубцевания.

Были протестированы многочисленные препараты патогенетически ориентированного медикаментозного лечения ПВР: противовоспалительные агенты, антипролиферативные препараты, антиоксиданты. На стадии пролиферации заболевания широко изучаются применение и эффективность использования антипролиферативных препаратов, ингибирующих клеточный цикл и клеточную пролиферацию: 5-фторурацил, даунорубицин, таксол, колхицин, ретиноевая кислота, рибозимы, этопозид и др. [5—12].

Наиболее изученным препаратом для лечения ПВР является 5-фторурацил. Препарат действует на синтез ДНК, предотвращая образование тимидина. H. Borhani и соавт. [13] оценивали на модели ПВР у кроликов замедленное высвобождение препарата, заключенного в биоустройство, введенное интравитреально в концентрациях 0,5 и 1 мг. Исследования показали эффективность лечебного действия 5-фторурацила на развитие ПВР, а при большей концентрации препарата авторы отмечали предотвращение развития тракционной отслойки сетчатки в 100% случаев.

Применению 5-фторурацила 200 мг/мл и низкомолекулярного гепарина 5 ЕД/мл, добавленных в ирригационный раствор во время витреоретинальной операции, были посвящены три рандомизированных контролируемых клинических исследования [14—18].

Проведенные экспериментальные и клинические исследования по применению антипролиферативных препаратов в качестве местной и системной терапии при развитии ПВР показали наличие токсических свойств препаратов и недостаточную ингибицию пролиферативных процессов, что вызвало необходимость поиска новых лекарственных средств. Другой проблемой в лечении ПВР является способ доставки антипролиферативного препарата к патологическому очагу в заднем отрезке глаза. Наиболее адекватным способом, учитывая наличие гематоретинального барьера, является интравитреальный способ введения, позволяющий создавать терапевтическую концентрацию лекарственного вещества в заднем отрезке глаза, минимизируя системные побочные эффекты, наблюдаемые при парентеральном и пероральном введении.

В связи с этим большой интерес представляет препарат мелфалан, используемый в онкологической практике. Мелфалан является производным азотистого иприта, относится к бифункциональным алкилирующим соединениям циклонеспецифического действия. Препарат обладает противоопухолевым, алкилирующим, цитостатическим и иммунодепрессивным действием и вызывает повреждение макромолекулы ДНК, нарушает ее полимеризацию и редупликацию, способствует образованию дефектных форм ДНК и РНК и останавливает синтез белка. Препарат активен в отношении покоящихся и активно делящихся опухолевых клеток. Наиболее чувствительными фазами митотического цикла являются конец фазы G2 и переход G2-M.

Мелфалан применяли в офтальмоонкологии при лечении ретинобластомы в качестве препарата для внутриартериальной химиотерапии дополнительно к внутривенной химиотерапии, однако, несмотря на положительный эффект — резорбцию опухоли, появлялись рецидивы в виде отсевов в стекловидном теле. Введение препарата интравитреально позволило добиться полной резорбции отсевов [19—22]. В настоящее время в американских и многих европейских клиниках интравитреальное введение мелфалана входит в протокол лечения детей с двусторонней ретинобластомой [23]. Авторы отмечают, что системная химиотерапия совместно с интравитреальным введением мелфалана в дозе 20—30 мкг в 0,1 мл позволяет сохранить ребенку не только глаз, но и зрение. Но при интравитреальном введении мелфалан оказывает токсическое действние на сетчатку в дозах 20—30 мкг/мл, в результате чего развиваются атрофические процессы в сетчатке [24].

Актуальным оказалось использование этого препарата при лечении пролиферативных процессов глаза неонкологического генеза. Однако, учитывая токсические свойства мелфалана, необходимо было определить безопасную терапевтическую концентрацию препарата. Нами проведены экспериментально-морфологические исследования различных концентраций мелфалана (0,02; 0,01; 0,0075; 0,005 мг) [25]. Исследования показали появление деструктивных процессов в ретинальном пигментном эпителии (РПЭ) и атрофических процессов в наружных ядерном и плексиформных слоях сетчатки, имеющих дозозависимый характер при использовании мелфалана в дозах 0,02 и 0,01 мг. Мелфалан в дозе 0,005 мг, введенный однократно интравитреально, обладал минимальной ретинотоксичностью.

Цель исследования — изучение эффективности препарата мелфалан в качестве антипролиферативного средства при лечении пролиферативного процесса неонкологического генеза — экспериментальной ПВР.

Материал и методы

Материалом для исследования модели послужили 12 кроликов (24 глаза) породы шиншилла массой 2,5—3,0 кг, у которых моделировали ПВР на обоих глазах путем интравитреального введения через плоскую часть цилиарного тела инсулиновой иглой 32G культуры клеток гетерогенных активированных фибробластов 200 тыс. клеток в 0,1 мл из коллекции клеточных культур ИБР РАН [26]. Модель экспериментальной ПВР была разработана совместно с Институтом биологии развития, где проводилась работа по приготовлению культуры фибробластов человека. Развитие ПВР в эксперименте происходило через 1 мес и имело место в 100% случаев, оно было идентифицировано морфологически с появлением эпиретинальных мембран (ЭРМ) на внутренней поверхности сетчатки. Эволюция ЭРМ включала основные стадии ее развития, от клеточно-волокнистой до фиброзной, и модель может быть использована для объективной оценки эффективности антипролиферативных препаратов.

Лечение экспериментальной ПВР проводили через 1 день после моделирования процесса. Животные были разделены на две группы. В 1-й группе животных (6 кроликов, 6 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили мелфалан в концентрации 0,02 мг в 0,1 мл. Во 2-й группе животных (6 кроликов, 6 глаз) в правый глаз однократно интравитреально инсулиновой иглой 32G через плоскую часть цилиарного тела вводили мелфалан в концентрации 0,005 мг в 0,1 мл. Концентрация мелфалана 0,02 мг применяется онкологами для интравитреального введения при лечении ретинобластомы. Учитывая осложнения при интравитреальном введении препарата в данной концентрации, мы использовали концентрацию мелфалана 0,005 мг, которая изучена в эксперименте как наиболее безопасная [25]. Левый глаз у всех животных оставляли контрольным (без лечения). Животных наблюдали в течение 1 мес с использованием методов офтальмологического исследования — биомикроскопии и офтальмоскопии. После вывода животных из эксперимента глаза энуклеировали, фиксировали в 10% буферированном формалине и подвергали стандартной гистологической обработке. Микроскопическое исследование проводили с помощью микроскопической системы Leica (Leica Microsystems, Германия) со встроенной цифровой камерой при увеличении 200—600.

Результаты

В группе контроля в левых глазах 12 кроликов наблюдалось появление ЭРМ в виде волокнистых структур на внутренней поверхности сетчатки (рис. 1).

Рис. 1. ЭРМ (ПВР) на внутренней поверхности сетчатки при экспериментальном моделировании без лечения.

Здесь и на рис. 2—7 окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.

При исследовании 1-й группы (6 кроликов, 12 глаз) в 6 глазах, получавших лечение, отмечалось отсутствие ЭРМ. Однако доминирующими были атрофические изменения сетчатки, которые имели различную выраженность в виде преимущественно двух типов изменений.

Очаги первого типа характеризовались поражением всех слоев сетчатки с глиальным ее замещением. Отмечалось полное разрушение сетчатки, утрата ее слоистости. Сетчатка превращалась в глиальную ткань, спаянную с атрофичной хориоидеей (рис. 2).

Рис. 2. Эксперимент, 1-я группа.

Атрофический очаг сетчатки первого типа: глиальное перерождение сетчатки. Ув. 400.

Очаги второго типа характеризовались истончением сетчатки с исчезновением фоторецепторного слоя (слоя палочек и колбочек, наружного ядерного и плексиформного слоев), сохранялся лишь редуцированный внутренний ядерный слой (рис. 3).

Рис. 3. Эксперимент, 1-я группа.

Атрофический очаг сетчатки второго типа. Отсутствие фоторецепторного слоя сетчатки. Атрофия внутреннего зернистого слоя. Ув. 400.

Во всех глазах также диагностировались выраженные деструктивные процессы в РПЭ: диссоциация клеток, их миграция, оголение мембраны Бруха (рис. 4).

Рис. 4. Эксперимент, 1-я группа.

Деструкция РПЭ. Миграция клеток и очаги оголения мембраны Бруха. Ув. 400.

При исследовании 2-й группы (6 кроликов, 12 глаз) в 6 глазах, получивших лечение, микроскопически отмечалась полная редукция пролиферативного процесса, сетчатка прилежала и сохраняла свою нормальную структуру (рис. 5).

Рис. 5. Эксперимент, 2-я группа.

Сетчатка после введения 0,005 мг мелфалана имеет нормальное строение: структура сохранена, ПВР отсутствует. Ув. 200.

Грубые атрофические изменения в сетчатке (очаги первого и второго типа) отсутствовали. Однако в 5 глазах отмечались единичные дистрофические очаги, которые мы расценили как очаги третьего типа, которые характеризовались небольшим уменьшением объема наружного ядерного слоя, укорочением палочек и колбочек. При этом отмечалось полное сохранение внутренних слоев сетчатки (рис. 6).

Рис. 6. Эксперимент, 2-я группа.

Атрофический очаг сетчатки третьего типа. Уменьшение объема наружного ядерного слоя. Укорочение палочек и колбочек. Ув. 200.

Отмечались единичные деструктивные изменения в РПЭ с диссоциацией РПЭ и оголением мембраны Бруха (рис. 7).

Рис. 7. Эксперимент, 2-я группа.

Начальные изменения РПЭ: диссоциация клеток в пласте. Ув.400.

Обсуждение

Резюмируя полученные в эксперименте результаты, можно сделать заключение, что мелфалан является эффективным антипролиферативным препаратом, способствующим ингибиции пролиферативного процесса при лечении ПВР. Вместе с тем препарат обладает токсическими свойствами. Выраженность токсических осложнений зависит от концентрации препарата. Высокая концентрация, применяемая в онкологической практике (0,02 мг), вызывает распространенные атрофические изменения в сетчатке. В основе токсического действия, как показал анализ морфологического исследования, лежала атрофия преимущественно наружных слоев сетчатки: слоя палочек и колбочек, наружного ядерного и наружного плексиформного слоев, т.е. поражался фоторецепторный слой сетчатки. Известно, что функция фоторецепторного слоя тесно связана с метаболизмом РПЭ, структура которого значительно изменяется при интравитреальном введении мелфалана. Отмечались диссоциация клеток в пласте, их миграция с оголением мембраны Бруха. Фармакокинетические исследования показали, что мелфалан накапливался в РПЭ в большей концентрации, чем в сетчатке [27, 28]. Такая «тропность» мелфалана к РПЭ объясняет возникновение осложнений, связанных с изменением РПЭ и последующих нарушений функций фоторецепторов, ведущих к развитию атрофического процесса сетчатки, т. е. РПЭ является мишенью токсического действия мелфалана, выраженность которого зависела от концентрации препарата. Применение в эксперименте концентрации мелфалана 0,005 мг вызывало положительный лечебный антипролиферативный эффект на модели ПВР: не наблюдалось возникновение новообразованных эпиретинальных мембран на внутренней поверхности сетчатки, отсутствовало развитие тракционной отслойки сетчатки. Изменения РПЭ носили ограниченный характер с небольшой диссоциацией клеток, а атрофические процессы в сетчатке имели начальный характер и могут быть обратимыми.

Заключение

Проведенные экспериментальные исследования доказали эффективность антипролиферативного действия препарата мелфалан при однократном интравитреальном введении в концентрации 0,005 мг в 0,1 мл при лечении экспериментальной ПВР [29].

Использование эффективного антипролиферативного препарата во время витреоретинальной хирургии позволит снизить активность ПВР при дистрофической и травматической отслойке сетчатки, а также склерохориоретинального рубцевания при травме заднего отрезка глаза, что повысит эффективность хирургического лечения и снизит число повторных хирургических вмешательств.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И. Х.-М.

Сбор и обработка материалы: Н.Л., И.Х.-М., Е.А.

Написание текста: И. Х.-М., Н.Л.

Редактирование: И. Х.-М., Е.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

<

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail