Иммуноферментный анализ (ИФА) иммуноглобулинов (Ig) сыворотки крови является базовым методом диагностики хронических инфекций [1—16]. Стандартный «набор инфекций» для исследований этим методом исторически восходит к скринингу при беременности на так называемый синдром TORCH (внутриутробные инфекции — токсоплазмоз, краснуху, цитомегаловирус (ЦМВ) и герпес) [11]. На данный момент диапазон обследования на хронические инфекции существенно расширился и включает с определенной вариабельностью в разных лабораториях детекцию сывороточных антител еще к Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, вирусу Эпштейна-Барр, герпес-вирусу человека 6-го типа и некоторым другим патогенам [2—5, 11, 12, 15, 16].
Вышеуказанная практика скрининга на ряд хронических инфекций была внедрена в работу профильных офтальмологических учреждений, что нашло свое отражение в многочисленных публикациях, которые имеют, на наш взгляд, одно общее упущение — результаты, полученные при обследовании больных, не сравниваются с данными группы контроля, вследствие чего действительная оценка диагностической ценности метода представляется неполной [17].
Цель работы — оценить клиническое значение данных, полученных при проведении твердофазного ИФА сыворотки крови пациентов с воспалительными заболеваниями переднего отдела глаза, в сопоставлении с аналогичными показателями у здоровых добровольцев.
Материал и методы
Проведен ретроспективный анализ результатов исследования сыворотки крови 200 пациентов с хроническими кератоконъюнктивитами и кератоувеитами с клиническими признаками герпетической или смешанной инфекционной этиологии на наличие антител к различным патогенам методом твердофазного ИФА (основная группа). В анализ включены данные 133 женщин и 101 мужчины, средний возраст составил 47,4±13,2 года. Контрольную группу составили 34 добровольца без признаков воспаления тканей глаза, средний возраст которых составил 46,7±8,3 года, Обследуемые обеих групп были сопоставимы по полу и возрасту.
Все исследования выполнены в клинико-диагностической лаборатории ФГАУ «НМИЦ «МНТК Микрохирургия глаза» им акад. С.Н. Федорова» Минздрава Российской Федерации (РФ) (зав. — Малышева З.Г.). ИФА проводили по стандартному методу с помощью наборов реагентов («ВекторБест», РФ) для иммуноферментного выявления в сыворотке крови разных Ig для этиологической диагностики следующих хронических инфекций: герпетической, хламидийной и токсоплазменной. Диагностику герпетической инфекции проводили путем определения наличия антител только к трем герпетическим вирусам — ВПГ 1-го и 2-го типов (ВПГ 1,2) и ЦМВ. Для выявления острофазных Ig класса M к ВПГ и ЦМВ использовали соответствующие наборы реагентов — «ВектоВПГ-IgМ» и «ВектоЦМВ-IgМ». Результаты анализа при превышении оптической плотности образца (измеряемой с помощью спектрофотометра) над критической считали «положительными», при обратной ситуации — «отрицательными». Для количественного выявления Ig класса G к ВПГ 1, 2 и ЦМВ использовали наборы реагентов «ВектоВПГ 1,2-IgG» и «ВектоЦМВ-IgG». Результаты исследования представлены в титрах антител, соответствующих последнему разведению исследуемого образца, при котором значение оптической плотности в соответствующей лунке планшета больше или равно критическому. Диагностику хламидийной инфекции проводили путем определения Ig классов М, A и G c помощью наборов «ХламиБест Chlamydia trachomatis-IgM», «ХламиБест Chlamydia trachomatis — IgG» и «ХламиБест Chlamydia trachomatis — IgA». Результаты оценивали как «положительные» или «отрицательные» с использованием коэффициента позитивности, рассчитанного на основании измерения оптической плотности. Активность токсоплазменной инфекции исследовали путем определения Ig классов A, M и G к Toxoplasma gondii с помощью наборов реагентов «ВектоТоксо-IgA», «ВектоТоксо-IgM» и «ВектоТоксо-IgG». Исследуемые инфекции и соответствующие наборы реагентов суммированы в табл. 1.
Порядок проведения твердофазного ИФА вне зависимости от предполагаемых инфекций и определяемых антител был следующим. Исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках стрипов, при этом искомые антитела связывались с иммобилизованными в лунках антигенами с образованием комплекса «антигенантитело». Связавшиеся антитела выявляли при инкубации с конъюгатом соответствующих моноклональных антител с пероксидазой. Количество связавшегося конъюгата определяли проведением цветной реакции с использованием субстрата пероксидазы (перекиси водорода и хромогена) тетраметилбензидина. Реакцию останавливали добавлением стоп-реагента и измеряли оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм, референс-фильтре в диапазоне 620—655 нм. Допускалось измерение при длине волны 450 нм. Интенсивность желтого окрашивания была пропорциональна концентрации определяемого Ig в анализируемом образце.
Статистический анализ проводили при помощи программного модуля SPSS Statistics с использованием непараметрических методов для сравнения между показателями групп (однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, критерий Манна-Уитни для независимых выборок).
Результаты и обсуждение
Результаты проведения ИФА были сгруппированы по конкретным инфекциям — в сравнении с результатами группы здоровых с использованием соответствующих статистических критериев.
Исходя из того факта, что IgM к ВПГ и ЦМВ имели качественный формат представления результатов, сравнительный анализ данных по этим антителам был объединен в общую таблицу. В группе пациентов с поражением глаз острофазные антитела, характеризующие обострение ВПГ и ЦМВ-инфекций, определялись лишь у 4 (2%) и 16 (8%) пациентов, в группе здоровых — ни в одном случае (табл. 2). Несмотря на тенденцию к росту частоты выявления ЦМВ-инфекции в основной группе, достоверность различий с показателями здоровых не подтвердилась (p≥0,05).
Примечание. Здесь и в табл. 4, 6: p — критерий Манна-Уитни для независимых выборок.
Результаты сравнительного анализа титров IgG к ВПГ/ЦМВ, характеризующие, как принято считать, хроническое инфицирование организма данными вирусами, представляют, на наш взгляд, особый интерес. Не могут не удивлять весьма сходные уровни Ig в обеих группах, что было подтверждено статистически (табл. 3). Последний факт, взятый в совокупности с малым процентом выявления IgM, наводит на мысль о том, что данных ИФА недостаточно для выяснения этиологии заболевания. Это, на наш взгляд, является предпосылкой для использования более информативных современных методов, таких, например, как количественная и качественная полимеразная цепная реакция (ПЦР). Кроме того, несмотря на постепенное осознание офтальмологами того, что герпетическая инфекция является совокупностью инфицирования 8 герпетическими вирусами, рутинная лабораторная практика до сих пор предполагает исследование сыворотки крови на антитела к 2—3 (как правило, ВПГ, ЦМВ и в ряде случаев — ВЭБ) герпетическим вирусам [2, 3, 5, 6, 8, 14—23].
Примечание. Здесь и в табл. 5: p — однофакторный дисперсионный анализ ANOVA.
Токсоплазменная инфекция входит в число «скрининговых» инфекций при воспалительных заболеваниях как переднего, так и заднего отделов глаза. Несмотря на то что классической формой поражения глаз при токсоплазмозе считается поражение хориоидеи и сетчатки, при кератоувеитах также наблюдается повышение титров специфических антител, что подтверждается и нашими данными. IgА к Toxoplasma gondii были выявлены у 12 и 9 человек соответственно. Несмотря на кажущуюся более высокую частоту выявления этих антител в группе здоровых (!), достоверность различий не подтверждена статистически (табл. 4). Антитела класса M к Toxoplasma gondii не были выявлены ни в одном случае — ни в основной, ни в контрольной группах (данные не приводятся). В то же время уровни IgG в основной группе были выше, чем в контрольной, почти в 3 раза (p≤0,05). Столь значительные отличия вряд ли свидетельствуют о значимости данной инфекции в развитии воспаления в переднем отрезке глаза; скорее, они могут быть следствием перекрестной активации синтеза Ig на фоне хронической инфекции (табл. 5).
Хламидия считается в настоящее время облигатным паразитом, внося свой патологический вклад в развитие различных форм поражения всех отделов глазного яблока. В нашем исследовании активность хламидийной инфекции определяли путем выявления трех видов антител к Chlamydia trachomatis — A, G и M. Несмотря на то что представленные по этим антителам результаты имели количественный формат, различие дисперсий в основной и контрольной группах, а также слишком большой разброс значений не позволили провести однофакторный дисперсионный анализ для сравнения уровней антител. Поэтому мы оценивали лишь частоту их выявления (табл. 6). Сравнительный анализ частоты выявления всех трех классов антител показал статистически значимые различия. Данный факт может свидетельствовать о важной роли активизации этой инфекции при воспалении в переднем сегменте глаза, что коррелирует с результатами, полученными нами ранее при обследовании пациентов с воспалением тканей глаза методом ПЦР [20].
Выводы
Проведенный нами сравнительный статистический анализ выявления частоты специфических иммуноглобулинов при проведении твердофазного ИФА для уточнения этиологии воспаления в переднем отделе глаза в совокупности с отечественными данными литературы отразил ряд существенных положений:
- Активность герпетических инфекций до сих пор определяется лишь в отношении отдельных типов герпес-вирусов, в большинстве случаев — ВПГ 1, 2 и ЦМВ. Согласно нашим данным, сравнительная частота выявления активных ВПГ- и ЦМВ-инфекций у пациентов с воспалительными заболеваниями переднего отдела глаза не имеет статистических различий с показателями здоровых при использовании ИФА.
- ИФА позволил выявить повышение титров IgG к токсоплазме со значимой разницей между данными пациентов и здоровых, что скорее всего может свидетельствовать о перекрестной стимуляции синтеза антител на фоне хронического воспалительного процесса.
- Существенные различия по частоте выявления всех видов антител к хламидиям позволяют предположить значительную этиологическую роль этого патогена в развитии и поддержании хронического воспаления в переднем отделе глаза.
- Твердофазный ИФА является надежным ориентировочным методом для уточнения этиологии инфекционного процесса в тканях глаза, но с учетом вариабельности силы индивидуального иммунного ответа может быть дополнен данными продукции генетического материала непосредственно самих патогенов в доступных биологических секретах методом ПЦР и ПЦР в реальном времени [17, 20, 21].
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Г.Ч., Д.М.
Сбор и обработка материала: М.М., З.М.
Статистическая обработка данных: Г.Ч., М.М.
Написание текста: Г.Ч., Д.М., Е.К.
Редактирование: Ю.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.