Аветисов К.С.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Бахчиева Н.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней», ул. Россолимо, 11, А, Б, Москва, Россия, 119021

Аветисов С.Э.

ФГБУ "Научно-исследовательский институт глазных болезней" РАМН, Москва

Новиков И.А.

Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России, Москва, Россия

Головченко А.В.

кафедра глазных болезней ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, ул. Трубецкая, 8, стр. 2, Москва, 119991, Российская Федерация

Шитикова А.В.

Международная школа «Медицина Будущего» ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, ул. Трубецкая, 8, стр. 2, Москва, 119991, Российская Федерация

Атомно-силовая микроскопия в исследовании структур переднего сегмента глаза

Журнал: Вестник офтальмологии. 2020;136(1): 103-110

Просмотров : 351

Загрузок : 8

Как цитировать

Аветисов К. С., Бахчиева Н. А., Аветисов С. Э., Новиков И. А., Головченко А. В., Шитикова А. В. Атомно-силовая микроскопия в исследовании структур переднего сегмента глаза. Вестник офтальмологии. 2020;136(1):103-110.
Avetisov K S, Bakhchieva N A, Avetisov S É, Novikov I A, Golovchenko A V, Shitikova A V. Atomic force microscopy in the study of anterior eye segment structures. Vestnik Oftalmologii. 2020;136(1):103-110.
https://doi.org/10.17116/oftalma2020136011103

Авторы:

Аветисов К.С.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН

Все авторы (6)

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) – метод сканирующей зондовой микроскопии с высоким (субмикронным) разрешением, который применяют для оценки морфологических особенностей поверхности объекта, а также для исследования механических свойств органических и неорганических материалов. Метод АСМ был разработан в 1986 г. группой ученых (Герд Биннинг, Кельвин Куэйт, Кристофер Гербер) с целью совершенствования и устранения недостатков его предшественника – сканирующего туннельного микроскопа.

Главными преимуществами АСМ стали возможность исследования не только проводящих, но и непроводящих тел, а также определение трехмерного рельефа поверхностей. Кроме этого, использование данного метода существенно изменило уровень визуализации и позволило проводить исследования на субнанометровом уровне, чего не позволяли технические характеристики имеющихся на тот момент микроскопов.

Исходя из этого, АСМ довольно быстро нашла применение в разных областях исследований, включая физические и биологические науки, инженерию и т. д. [1–3]. При этом согласно данным 2010 г. количество публикаций, в которых в той или иной мере применяли АСМ для исследования структур глаза, за предшествующие 15 лет увеличилось в незначительной степени, что может свидетельствовать о возможном нереализованном потенциале АСМ в этой области [3].

Одно из главных преимуществ АСМ, в частности, при изучении биологических материалов, связано с возможностью проведения исследования не только в воздушной, но и в жидкой среде, т. е. в условиях, максимально приближенных к физиологическим.

В отличие от электронной микроскопии при проведении АСМ какой-либо специальной подготовки образца (маркировка, фиксация или нанесение какого-либо покрытия) не требуется. АСМ позволяет получить топографическую характеристику поверхностей в разрешениях, недостижимых для оптического микроскопа, – боковое разрешение АСМ ограничено лишь размером и формой наконечника и обычно составляет порядка нескольких нанометров, а разрешение по высоте – приблизительно 1 Å и ограничено только электронным и тепловым шумами в системе.

Таким образом, визуализация с высоким разрешением позволяет идентифицировать особенности молекулярного масштаба в реальном времени и в естественной для образца среде. При этом можно проводить сравнительные исследования изображения объекта при различных патологических состояниях на уровне молекулярных перестроек [3].

Принцип АСМ основан на взаимодействии заостренной иглы (зонда), находящейся на кончике балки (кантилевера), с поверхностью образца за счет сил притяжения и отталкивания различной природы, которые в свою очередь зависят от расстояния между иглой и поверхностью образца.

Во время этапа захода поверхность исследуемого образца взаимодействует с кончиком через силы Ван-дер-Ваальса. Притягивающие силы вызывают отклонение кантилевера по направлению к поверхности препарата. Однако, когда кантилевер вступает в контакт с поверхностью, увеличивающиеся противодействующие силы отталкивают его (так называемый эффект Паули). Отклонение кантилевера изменяет направление лазерного пучка, отраженного от его поверхности, и регистрируется приемником, что позволяет точно измерять степень отклонения кантилевера (метод обнаружения оптического луча).

Кантилевер подвергается воздействию сочетания вдавлений и отклонений, обусловленных мягкостью исследуемого материала: чем жестче материал, тем сильнее отклоняется кантилевер и меньше давит на него. Отклонение кантилевера пропорционально силе, с которой зонд АСМ давит на предмет. В соответствии с контактной механической моделью Снеддона взаимоотношение «сила – вдавление» – это функция модуля эластичности (модуля Юнга). Таким образом, принцип оценки механических свойств биологического объекта принципиально отличается от традиционных подходов, предполагающих проведение испытаний на растяжение и деформацию образцов.

Взаимодействие с образцом происходит благодаря физическим силам атомов – эти силы условно можно разделить на притягивающие и отталкивающие. Их соотношение зависит от того расстояния, на котором находится зонд по отношению к исследуемой поверхности. Чем ближе зонд, тем сильнее отталкивающие силы. Исследование может быть выполнено либо в контактном режиме, либо в полуконтактном (режим постукивания). Соответственно, при контактном режиме наконечник находится в постоянном контакте с поверхностью образца, в то время как при полуконтактном кантилевер колеблется, совершая растровое сканирование с меньшей силой по краям образца, в результате чего его потенциальное повреждающее действие минимизируется. Именно поэтому полуконтактный режим чаще применяют при исследовании мягких материалов.

АСМ может быть использована как для топографической визуализации морфологических особенностей образца, так и для измерения его ригидности, т. е. механических параметров. Топографическое изображение получают путем растрового сканирования поверхности объекта в режиме постоянной силы. Лазерный луч отражается от верхней поверхности кантилевера, и небольшие отклонения последнего от его равновесного положения регистрируются с помощью фотодиодного детектора, чувствительного к перемещению. С помощью таких АСМ-изображений можно выявлять присутствие разных объектов на поверхности (компоненты матрикса, волокна коллагена, клетки), а также определять шероховатость – меру неровности поверхности в нанометровых масштабах.

Механические свойства измеряют с помощью силовой спектроскопии (также называемой наноиндентированием) [4, 5]. Силовые кривые АСМ, получаемые в ходе эксперимента, представляют зависимость силы от глубины вдавливания индентора в исследуемый материал. Такие кривые можно использовать для измерения механических параметров, таких как модуль Юнга (упругости), который является мерой жесткости материала или его тенденции к упругой деформации под действием приложенного усилия или адгезии.

Кроме того, силовые кривые могут быть получены в пределах заданной площади сканирования для создания силовой карты поверхности. С их помощью можно соотнести полученную неоднородность значений в механических свойствах образца с топографической картиной и выявить возможную корреляционную связь.

Возможности АСМ могут быть существенно расширены за счет интеграции с другими оптическими и спектроскопическими технологиями, в частности, Рамановской спектроскопией, микроскопией по методу светлого поля, сканирующей конфокальной лазерной микроскопией, поверхностной интерференционной микроскопией, флуоресцентной микроскопией полного внутреннего отражения, микроскопией визуализации времени жизни флуоресценции [6–11].

Применение АСМ в офтальмологии предполагает два основных направления в соответствии с классическим анатомическим делением глазного яблока на передний и задний сегменты. В настоящем обзоре представлены результаты опубликованных работ, в которых АСМ использовали для анатомо-функционального изучения структур переднего сегмента глаза.

Достаточно большой по объему блок исследований связан с применением АСМ-технологий для оценки морфологических и биомеханических особенностей различных отделов хрусталика. Интерес к данной проблеме, с одной стороны, продиктован необходимостью дальнейшего изучения процессов катарактогенеза, а с другой – анатомо-функциональной значимостью капсулы хрусталика в механизме аккомодации и современной факохирургии.

Капсула хрусталика – наружная мембрана, в основном состоящая из коллагена IV типа, трехмерные взаимно пересекающиеся волокна которого обеспечивают ее прочность, упругость и эластичность. Форма хрусталика в процессе аккомодации определяется эластичностью капсулы, адекватными биомеханическими параметрами и согласованной работой поддерживающего и мышечного аппарата. Что же касается факохирургии, то от прочностных свойств капсулы хрусталика во многом зависит возможность адекватного проведения ряда технологических этапов микроинвазивной факоэмульсификации – наиболее распространенного вида оперативного вмешательства в офтальмохирургии.

В работе A. Antunes и соавторов на основе АСМ были измерены биометрические параметры (длина и ширина) волокон в ядерных и кортикальных слоях фиксированного хрусталика кролика – наиболее распространенной экспериментальной модели в офтальмологии [12]. В другом исследовании эти же авторы в эксперименте на собаках выявили нарушение структуры эпителия хрусталика в процессе катарактогенеза [13].

В ряде исследований акцент был сделан на оценку состояния формирующего поры в клетках хрусталиковых волокон мембранного протеина аквапорина 0 (ранее обозначаемого как МIP или MP26) в норме и процессе катарактогенеза [14–16]. В работах были использованы образцы, подготовленные из кортикальных масс «катарактальных» хрусталиков человека и прозрачных хрусталиков овцы и быка.

Авторы допускают возможность равноценного сравнения данных моделей из-за высокой степени сходства между аквапоринами 0 человека и овцы (92,4 и 98,9% идентичности соответственно) и между аквапоринами 0 человека и крупного рогатого скота (92,0 и 98,5% идентичности соответственно). С помощью АСМ было выявлено, что в «прозрачных» хрусталиках аквапорины формируют соединенные между собой решетки – тетрамеры, окруженные коннексонами, а в «катарактальных» эти соединения нарушены. Авторами были обнаружены отдельные тетрамеры аквапоринов без связанных с ними коннексонов, что предположительно отрицательно влияет на межклеточный транспорт и способствует образованию катаракты.

В серии исследований на основе АСМ были изучены морфологические и биомеханические особенности капсулы хрусталика человека и экспериментальных животных.

V. Sueiras и соавторы проанализировали особенности структуры передней капсулы хрусталика 6 кадаверных глаз человека, 4 – обезьян Cynomolgus, 7 – свиней (возраст доноров и экспериментальных животных 44–88; 4,83–8,92 и менее 0,5 лет соответственно) [17]. Исследования проводили без удаления капсулы, т. е. in situ. Для этого «целые» хрусталики помещали в гель из агара таким образом, чтобы передняя поверхность образцов оставалась интактной.

АСМ проводили в контактном режиме, после полного погружения образца в специальную жидкую среду. Интегрированная программа анализа предполагала расчет межфибриллярного расстояния, диаметра волокна и шероховатости поверхности. Во всех случаях была выявлена высокоупорядоченная волокнистая структура передней капсулы с межфибриллярным интервалом 1,08±0,25; 1,80±0,39 и 0,68±0,25 мкм для хрусталика человека, обезьяны и свиньи соответственно. Диаметр волокна колебался в пределах 50–950 нм и в среднем был сопоставим в группах исследования (339; 397 и 306 нм соответственно). Капсулы хрусталика человека и обезьяны оказались более «шероховатыми», чем аналогичные образцы свиньи.

В другом исследовании по аналогичному методу авторами были изучены возрастные изменения передней капсулы 8 кадаверных хрусталиков человека (возраст доноров 30, 36, 44, 53, 55, 71, 79 и 88 лет соответственно) [18]. Протокол АСМ был дополнен стереометрическим и так называемым фрактальным анализом с возможностью получения 29 различных цифровых параметров. Выявлена высокоорганизованная сотовая структура передней капсулы. Межфибриллярный интервал и диаметр фибрилл в среднем составил 0,82±0,35 мкм и 282±111 нм соответственно. Возрастные изменения проявлялись дезорганизацией структуры и увеличением межфибриллярного интервала (т.е. пористости); при этом диаметр волокон практически не менялся. Кроме того, отмечено возрастное уменьшение шероховатости передней капсулы.

Исходя из этого, с оговоркой, касающейся ограниченности материала, авторы делают вывод о существенных возрастзависимых изменениях капсулы, в основном обусловленных увеличением и нерегулярностью именно пористости капсулы вследствие изменения таких компонентов капсулы, как ламинин, коллаген IV, XV и XVIII, энтактин/нидоген, перлекан, аргин. Уменьшение шероховатости поверхности капсулы, возможно, связано с ее утолщением и увеличением межфибриллярного интервала.

N. Ziebarth и соавторы c помощью АСМ исследовали эластичность 18 свежеэнуклеированных цельных хрусталиков обезьян Cynomolgus [19]. Образец для исследования представлял помещенный в балансированный солевой рaствор комплекс «хрусталик – зонулярные связки – цилиарное тело – склера», полученный из энуклеированных глаз после удаления роговицы, радужки, склеры и стекловидного тела.

Модуль Юнга, рассчитанный на основе соотношения усилие/вдавление, в среднем составил 1720±880 Па (диапазон 409–3210). Эти результаты сопоставимы с ранее представленными данными, полученными в результате динамических механических испытаний хрусталиков молодых людей. По мнению авторов, в перспективе АСМ может быть использована для селективной количественной оценки эластичности капсулы, кортикальных слоев и ядра хрусталика (включая возрастные изменения).

В другом исследовании были проанализированы возрастные изменения капсулы хрусталика приматов на основе АСМ [20]. Материал включал полученные ex vivo центральные фрагменты передней камеры хрусталика: 18 образцов человека, 9 – обезьян Cynomolgus и 8 – павианов (возраст доноров в диапазоне 33–79; 5,9–8 и 2,8–10 лет соответственно). Испытания в указанных группах были проведены в сроки до 12 (4,6±3,2), 2 (0,7±0,7) и 2 (1,1±0,4) дней после забора соответственно.

До проведения экспериментов глаза хранили при температуре 4оС. Учитывая возможное влияние на результаты АСМ слоя эпителия, выстилающего внутреннюю поверхность капсулы, его удаляли путем пятиминутного выдерживания в растворах трипсина и ЭДТА (0,1 и 0,02% соответственно). Модуль Юнга рассчитывали с помощью кривых усилие/вдавление с использованием модели Снеддона для конического индентора.

Модуль Юнга передней капсулы хрусталика обезьяны и павиана в среднем составил 33,7±33,1 (9,19–117) и 33,3±16,7 (13,1–62,4) кПа соответственно. Этот показатель для образцов человека в возрастных диапазонах до 45; 45–70 и старше 70 лет в среднем был равен 28,7±6,7 (21,5–36,3); 47,7±10,4 (31,1–62,0) и 86,5±37,6 (39,6–131) кПа соответственно.

Несмотря на ограниченность и неоднородность материала, авторами сделаны следующие основные выводы: отсутствие связи между результатами АСМ и временем исследования после смерти донора, сходная эластичность передней капсулы хрусталика у молодых людей и обезьян, а также возрастное увеличение «жесткости» капсулы человека.

В небольшом по объему исследовании (4 центральных фрагмента передней капсулы хрусталика, полученных в процессе проведения микроинвазивной факоэмульсификации по поводу катаракты) (средний возраст пациентов 75,25±4,03 года) было изучено влияние силы воздействия кантилевера (2; 5; 10; 20 и 30 нН) на образец в процессе определения эластичности последнего [21].

С целью оценки воспроизводимости результатов для каждого уровня силы воздействия проводили пять последовательных измерений. Выявлено, что значение модуля Юнга зависит от уровня нагрузки. Наиболее однородные результаты были получены при силе воздействия 10 и 20 нН (коэффициенты вариации 12,4 и 11,7% соответственно).

Как известно, в хирургии зрелых и врожденных катаракт для улучшения визуализации и облегчения манипуляций с передней капсулой хрусталика используют специальные красители.

C. Haritoglou и соавторы с помощью АСМ оценили изменения механических свойств передней капсулы после ее окрашивания бриллиантовым синим, индоцианином зеленым и трипановым синим [22]. Непосредственно после интраоперационного забора исследовали 15 образцов. Каждый из образцов делили на 7 клиновидных частей: 3 – в течение 1 мин окрашивали указанными выше красителями, 3 после окрашивания дополнительно подвергали иллюминации с помощью стандартного источника света, имитируя освещение операционного микроскопа, 1 оставляли интактной в качестве контроля.

После окрашивания бриллиантовым синим, индоцианином зеленым и трипановым синим отмечено достоверное увеличение модуля Юнга в 1,61±0,15; 1,63±0,22 и 1,23±0,11 раза соответственно. Дополнительное освещение приводило к дальнейшему увеличению жесткости приблизительно в 1,2 раза. Две особенности метода работы осложняют перенос полученных данных в клинику: в реальной практике время взаимодействия ПКХ с красителем, как правило, не превышает 15–20 с, а время иллюминации, наоборот, бывает существенно более продолжительным.

В достаточно сложном по дизайну исследовании проанализированы морфологические и биомеханические характеристики полученных интраоперационно центральных фрагментов передней капсулы хрусталика [23]. Каждый из 8 фрагментов ПКХ делили на две равные части и помещали в балансированный солевой раствор: одну в неизмененном виде, а вторую – после обработки 2% раствором повидон-йода для удаления эпителиальных клеток с внутренней стороны капсулы. Затем каждый из образцов вновь делили на две части для исследования в гидратированных и дегидратированных условиях. С помощью АСМ определяли модуль Юнга с наружной и внутренней стороны ПКХ.

При световой и сканирующей электронной микроскопии как в гидратированных, так и дегидратированных условиях в образцах после обработки повидон-йодом не было выявлено эпителиальных клеток на внутренней стороне ПКХ, которая была достоверно менее шероховатой (на 353,8 нм), чем в необработанных образцах. Наружная поверхность ПКХ после обработки, наоборот, оказалась более шероховатой (на 382,06 нм).

При отсутствии эпителиальных клеток модуль Юнга, определяемый как с наружной, так и с внутренней поверхности КХ, оказался выше на 69,60 и 69,45 кПа аналогичных показателей неизмененной К.Х. Кроме этого, следует отметить, что независимо от метода подготовки образцов модуль Юнга передней поверхности КХ был больше, чем задней (в пределах 143,2–143,6 кПа). Остается открытым вопрос о возможном влиянии повидон-йода на эластичность образцов.

В исследовании R. Lua и соавторов изучена структура и механическая стабильность края передней капсулы хрусталика человека после ранее проведенной в процессе микроинвазивной факоэмульсификации мануальной и фемтолазерной капсулотомии (34 и 18 образцов соответственно, полученных ex vivo у доноров в возрасте от 58 до 87 лет) [24].

Для удаления клеточных элементов с внутренней поверхности капсулы все образцы в течение 5 мин промывали 2% раствором «Triton X-100». Механическую стабильность края передней капсулы оценивали с помощью АСМ на основе метода конечных элементов и 3D-модели атомно-силовых изображений, а особенности структуры – с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии.

Край образцов ПКХ после мануальной капсулотомии был гладким, правильной клиновидной формы, в то время как после фемтолазерной – зазубренным, с углублениями, в среднем равными 5,48±2,27 мкм. С помощью АСМ выявлено, что мануальный метод капсулотомии обеспечивает большую устойчивость края капсулы к механическим напряжениям и, соответственно, меньшую склонность к радиальным разрывам по сравнению с фемтолазерной. Компьютерное 3D-моделирование показало, что после мануальной капсулотомии нагрузка распределяется равномерно вдоль всего ровного края капсулы, в то время как в «зазубренном» после фемтолазерного воздействия крае имеют место фокусы высокой нагрузки, что делает капсулу более склонной к разрывам.

С точки зрения переноса полученных в данном исследовании результатов непосредственно в клиническую практику вызывает сомнение необходимость обработки образцов капсулы для удаления клеточных элементов. С одной стороны, «естественные» пограничные бесклеточные зоны у края капсулы в результате мануальной и фемтолазерной капсулотомии имеют определенные различия: в первом случае эта зона имеет ширину, сопоставимую с диаметром всего одного эпителиоцита (в среднем 11,9±3,8 мкм), а во втором – увеличивается в зависимости от мощности лазерного излучения (до 15,9±3,73 – 35,6±14,8 мкм) [25]. С другой – в сравнительных исследованиях, предполагающих анализ не абсолютных, а относительных показателей, основное значение имеют стандартные условия проведения тестов.

В работе J. Maier и соавторов на основе АСМ и сканирующей электронной микроскопии были проанализированы морфологические особенности края центральных фрагментов передней капсулы хрусталика человека, удаленных интраоперационно после различных методов капсулотомии [26]. В 10 случаях использовали фемтолазерную капсулотомию с мощностью импульса 15 мДж, в 10 – 5 мДж, в 6 – мануальный метод с помощью капсулорексисного пинцета (подготовка включала часовое пребывание образцов в формалине). В процессе исследования использовали т.н. TUNEL-анализ, АСМ и сканирующую электронную микроскопию.

На основе TUNEL-анализа гибель клеток (cell death) у края капсулы была выявлена во всех трех группах – в наибольшей степени при применении фемтолазерной капсулотомии в режиме высокой (15 мДж) энергии. После мануальной капсулотомии зона измененных клеток располагалась только у периферического края капсулы, а после фемтолазерной – вдоль всей демаркационной линии. По данным АСМ, диаметр лазерного пятна соответствовал запланированному, а при сканирующей микроскопии более ровный край отмечен при мануальном методе капсулорексиса.

В другой серии исследований на основе АСМ были изучены структурные и биомеханические особенности роговицы в «норме» и после различных вмешательств.

Выявлены морфологические особенности влияния на состояние эпителия роговицы относительного положения, адгезии, миграции и пролиферации клеток [27–29]. Согласно субмикронным данным АСМ боуменова и десцеметова мембраны роговицы имеют схожие расположение волокон и неровности, а также поры с разными размерами. При этом элементы передней пограничной мембраны менее плотно упакованы, а задняя пограничная мембрана более компактна, в первую очередь, из-за меньшего размера пор [30]. Очевидно, именно этим обстоятельством объясняется существенная разница в величине модуля эластичности передней и задней пограничных мембран по данным силовой АСМ: 7,5±4,2 и 47,6±16,5 кПа соответственно, при максимальной глубине вдавления менее 2 мкм [31].

Другие результаты вязкоупругих свойств передней пограничной мембраны были получены M. Lombardo и соавторами в эксперименте на четырех свежих деэпителизированных роговицах человека без признаков патологических изменений (средний возраст доноров 68,5±6,0 года) [32]. Измерения проводили в жидкой среде в режиме силовой спектроскопии и диапазоне глубины вдавления 1,0–2,7 мкм. Отмечены выраженные вязкоупругие свойства передних слоев роговицы – величина модуля упругости находилась в диапазоне 1,14–2,63 МПа. Указанные различия, по мнению авторов, объясняются отсутствием существенного влияния передней пограничной мембраны на эластичность поверхностных слоев роговицы вследствие малой толщины (менее 0,5 мкм).

При АСМ роговицы после эксимерлазерной фотоабляции на изолированных глазах человека и свиньи выявлено нарушение регулярности поверхностных слоев [33, 34]. При этом Боуменова мембрана оставалась «гладкой» (smooth), а поверхностные слои стромы шероховатыми. В зоне низкотемпературного лазерного воздействия на роговицу имела место дезорганизация коллагеновых волокон без явлений денатурации [35].

В другом исследовании с помощью АСМ было изучено влияние красителя на эластические свойства Десцеметовой мембраны роговицы [36]. Каждую из 10 роговиц, полученных из глазного банка, делили на две половины, одну из которых обрабатывали трипановым синим. Выявлено снижение эластичности и, как следствие, повышение жесткости окрашенных образцов по сравнению с контрольными (модуль эластичности 10,5±1,4 и 5,8±0,8 кПа соответственно).

Еще одно направление применения АСМ связано с оценкой биомеханических изменений роговицы в результате кросс-линкинга, предполагающего воздействие ультрафиолетового излучения на деэпителизированную роговицу после инстилляций раствора рибофлавина.

В эксперименте на 16 изолированных свиных глазах (8 – основная группа, 8 – контрольная) с помощью АСМ были проанализированы изменения эластичности поверхностных слоев роговицы [37]. Выявлено статистически достоверное увеличение среднего показателя модуля Юнга в зоне кросс-линкинга (т.е. снижение эластичности и повышение жесткости) по сравнению с контрольными образцами и задними интактными слоями роговицы.

В другой работе в качестве материала использовали 7 донорских роговиц человека, полученных из глазного банка: 5 образцов исследовали после кросс-линкинга, выполненного стандартным методом (рибофлавин + ультрафиолетовое излучение), а 2 – после химического кросс-линкинга с применением 2,5% раствора глутаральдегида [38]. Химический метод был использован в качестве контрольного, как обеспечивающий, по мнению авторов, связи между белками in vitro.

Увеличение модуля Юнга и снижение гистерезиса было достоверно более выражено при химическом кросс-линкинге по сравнению со стандартным (1,5–2 и 2,6–3,5; 1,1–1,5 и 0,9–1,5 соответственно).

В исследовании J. Dias и соавторов на основе АСМ были изучены биомеханические свойства 40 роговиц свиньи, которые были разделены на 4 равнозначные группы: контрольную и после применения трех разных методов кросс-линкинга (УФА-облучение мощностью 3 мВт/см2 и экспозиции 30 мин; УФА-облучение мощностью 30 мВт/см2 и экспозиции 3 мин; погружение поверхности роговицы в 1% раствор генипина на 4 ч соответственно) [39]. Выраженное в различной степени увеличение эластичности и снижение вязкости имело место после апробированных методов только в поверхностных, толщиной около 200 мкм слоях стромы.

Результаты приведенных выше исследований свидетельствуют о том, что индуцированные кросс-линкингом биомеханические изменения ограничены только передней стромой роговицы и не распространяются на более глубокие слои. Исходя из этого, правомерным выглядит терминологическое уточнение: обозначать метод как «corneal cross-linking» вместо изначально предложенного «corneal collagen cross-linking» [40].

Возможности одновременного топологического и силового анализа материала с помощью АСМ были использованы при изучении муцинов – высокомолекулярных гликопротеинов, содержащих кислые полисахариды и являющихся важной составляющей поверхности глаза [41–43]. Выявлена гетерогенность размеров и жесткости полимеров, которая проявляется в трех основных вариантах: 1) жесткие и растянутые; 2) длинные, утолщенные и извитые; 3) короткие, тонкие и извитые.

Таким образом, основной научно-исследовательский потенциал АСМ связан с возможностью одновременного анализа структурных и биомеханических особенностей биологических образцов. В первом случае – на субмикронном уровне с высоким разрешением, во втором – с приложением минимальных силовых нагрузок. Дороговизна и затратность обслуживания оборудования для АСМ ограничивает количество центров, располагающих этой технологией. Исходя из этого, более широкое, с учетом указанных преимуществ, использование АСМ в исследованиях офтальмологического профиля возможно только на уровне интеграции и междисциплинарного подхода к решению актуальных научных проблем.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Аветисов К.С. – канд. мед. наук, ст. науч. сотр. отдела факохирургии и интраокулярной коррекции, e-mail: avetisov.k.s@gmail.com, https://orcid.org/ 0000-0001-9195-8908

Бахчиева Н.А. – аспирант ФГБНУ НИИ ГБ, e-mail: notabene92@mail.ru, https://orcid.org/ 0000-0001-7573-0073

Аветисов С. Э. – академик РАН, профессор, научный руководитель ФГБНУ НИИ ГБ, зав. кафедрой глазных болезней, e-mail: info@eyeacademy.ru, https://orcid.org/ 0000-0001-7115-4275

Новиков И.А. – старший научный сотрудник, e-mail: i, 0000-0003-4898-4662

Головченко А. В. – аспирант кафедры глазных болезней ФГАОУ ВО ПМГМУ им. И.М. Сеченова, e-mail: stasie264@yandex.ru, https://orcid.org/ 0000-0002-1648-3057

Шитикова А. В. – студент 5-го курса международной школы будущего «Медицина будущего», e-mail: alina1med@mail.ru, https://orcid.org/ 0000-0001-8249-9703

Автор, ответственный за переписку: Аветисов Константин Сергеевич – e-mail: аvetisov.k.s@gmail.com, https ://orcid.org/ 0000-0001-9195-8908

Литература

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail