Митохондриальные заболевания — гетерогенная группа заболеваний, основной особенностью которых является дисфункция работы электротранспортной цепи митохондрий, приводящая к снижению митохондриального мембранного потенциала, росту продукции активных форм кислорода (АФК), снижению выработки клеточной энергии — аденизинтрифосфата (АТФ) и др.

Это группа редких метаболических заболеваний, вместе с тем суммарная частота в популяции, по различным данным, доходит до 1:5000 случаев. Клинически митохондриальные болезни могут проявляться нарушением работы различных органов и систем с преимущественным поражением тканей с высокой метаболической активностью (нервной и мышечной систем, печени) [1].

К одной из самых частых митохондриальных патологий относятся наследственные оптические нейропатии (НОН). Наиболее распространены наследственная оптическая нейропатия Лебера (НОНЛ), причиной которой являются мутации в митохондриальной ДНК (мтДНК), а также аутосомно-доминантная оптическая нейропатия (АДОН), обусловленная мутациями в ядерной ДНК (яДНК).

НОНЛ стала первым наследственным заболеванием с подтвержденной митохондриальной природой благодаря исследованиям группы ученых под руководством D. Wallace, которые в 1988 г. обнаружили точковую мутацию мтДНК у пациента с этой патологией [2]. У 90% пациентов с подтвержденным диагнозом НОНЛ встречается одна из трех наиболее частых мутаций — m.11778G>A в гене ND4, m.3460 G>A в гене ND1 и m.14484T>С в гене ND6. На сегодняшний день, согласно списку из международной базы данных митохондриального генома человека MITOMAP, еще 15 мутаций (m.14568C>T, m.14502T>C, m.14495A>G, m.14482C>G, m.14482C>A, m.14459G>A, m.13051G>A, m.10663T>C, m.10197G>A, m.4171C>A, m.3733G>A, m.3700G>A, m.3697G>A, m.3635G>A, m.3376G>A) признаны первичными для НОНЛ. Это точковые мутации мтДНК, нарушающие работу I комплекса дыхательной цепи митохондрий. Кроме того, в базу внесены 18 кандидатных мутаций (m.3472T>C, m.4025C>T, m.5244G>A, m.4640C>A, m.10237T>C, m.11253T>C, m.11696A>G, m.14596G>A, m.12811T>C, m.12848C>T, m.13637A>G, m.13730G>A, m.14279G>A, m.14325G>C, m.14498T>C, m.9101T>C, m.9804G>A, m.14831G>A), список которых регулярно расширяется [3]. Статус первичной получает кандидатная мутация, подтвержденная как минимум у 2 пациентов, не связанных родством по материнской линии [4].

АДОН (болезнь Кьера, ювенильная атрофия зрительного нерва) — на сегодняшний день считается наиболее часто встречающейся из всех наследственных оптических нейропатий. У мужчин и у женщин АДОН выявляется с одинаковой частотой 1:30 000—1:50 000 [5]. Впервые АДОН описана датским офтальмологом Poul Kjer в 1959 г. на примере 19 семей из Дании [6]. Однако мутации гена OPA1 яДНК, ассоциированные с АДОН, идентифицированы только в 2000 г. [7, 8]. Первым обнаруженным геном, ассоциированным с АДОН, был ген OPA1, расположенный в длинном плече хромосомы 3 (3q28—3q29). Приблизительно у 60% пациентов с АДОН обнаруживается мутация в гене OPA1, однако этот показатель может быть различным в разных странах. На сегодняшний день описано 280 мутаций в гене OPA1, а также открыты новые, ассоциированные с АДОН мутации в генах ОРА3 (19q13.2—13.3), регулирующих образование белков внутренней мембраны митохондрий, а также локусов ОРА4 (8q12.2—q12.3), ОРА5 (22q12.1—q13.1), ОРА8 (16q21—q22) [9].

Несмотря на то что первичные мутации, ассоциированные с НОНЛ и АДОН, различны, патогенез этих заболеваний, характеризующийся нарушением функциональных процессов в митохондриях, очень похож.

Митохондрии — независимые двумембранные органеллы, находящиеся в цитозоле всех эукариотических клеток, за исключением эритроцитов. Их основной функцией является выработка АТФ путем окислительного фосфорилирования [10]. Однако в митохондриях также происходит множество не менее важных для клетки процессов, таких как бета-окисление жирных кислот, метаболизм аминокислот, цикл трикарбоновых кислот, метаболизм биотина, синтез гема, цикл мочевины, синтез пуринов и пиримидинов и др.

В клетках млекопитающих содержится различное число митохондрий — от нескольких сотен до многих тысяч, в зависимости от метаболической потребности ткани, подверженности оксидантному стрессу и другим патологическим условиям. Каждая митохондрия содержит в среднем от 2 до 8 копий кольцевой мтДНК, которая представляет собой короткую двуцепочечную молекулу, состоящую из 16 569 пар нуклеотидов и содержащую гены, кодирующие субъединицы дыхательной цепи митохондрий, транспортные РНК митохондрий, митохондриальные рибосомальные субъединицы, субъединицы цитохрома b [11].

Возможности репарации мтДНК изучены не до конца, однако пока они признаются меньшими по сравнению с репаративной системой в ядре клеток. Отсутствие классических гистонов, полицистронность, а также близкая расположенность к источникам АФК делают мтДНК особенно подверженной мутациям [12].

Одной из функций митохондрий является клеточное дыхание. Дыхательная (или электротранспортная) цепь митохондрий состоит из пяти ферментативных комплексов. В комплексе I (NADH-дегидрогеназа) происходит окисление NAD-Н, два электрона переносятся на убихинон (коэнзим Q), а 4 иона Н⁺ — из матрикса в наружное пространство внутренней митохондриальной мембраны. Комплекс II (сукцинатдегидрогеназа) не осуществляет переноса протонов, но благодаря этому комплексу в дыхательную цепь входят дополнительные электроны за счет окисления сукцината. Комплекс III (цитохром С-редуктаза) переносит электроны с коэнзима Q на цитохром С, а 2 иона H⁺ — на наружную поверхность внутренней митохондриальной мембраны. Комплекс IV (цитохром C-оксидаза) принимает 4 электрона с 4 молекул цитохрома С и переносит их на кислород, осуществляя также транспорт 4 ионов H⁺ на наружную поверхность внутренней митохондриальной мембраны. Комплекс V (фермент АТФ-синтаза) состоит из большого количества белковых цепей, образующих две группы: группу F_o, выполняющую каналообразующую функцию и обеспечивающую переход протонов H⁺ в матрикс, и группу F₁, выполняющую каталитическую функцию. Именно данная группа, используя энергию протонов, синтезирует АТФ [13].

Большинство мутаций, характерных для НОНЛ, нарушает работу I комплекса электротранспортной цепи митохондрий. В результате накапливающиеся электроны покидают дыхательную цепь и реагируют с кислородом, образуя АФК, такие как супероксид- анион (O₂), который затем под действием митохондриального фермента марганец-супероксид дисмутазы (MnSOD) переходит в перекись водорода (H₂O₂). А перекись водорода в свою очередь может образовывать гидроксильный радикал (ОН). В норме в митохондриях также происходит продукция АФК, а их накопление регулируется антиоксидантными механизмами. Более того, есть предположения, что свободные радикалы участвуют в некоторых процессах жизненного цикла клетки, таких, например, как апоптоз. При избыточном накоплении АФК могут оказывать негативное влияние на клетки организма, в частности повреждать железосерные центры дыхательных ферментов в комплексах I, II и III, а также ферментов цикла Кребса, таких как цис-аконитаза, что приводит к нарушению продукции и дефициту АТФ. Вследствие особенностей строения мтДНК сама по себе очень уязвима при избыточном взаимодействии с АФК, что приводит к накоплению крупных нуклеотидных делеций, а перекисное окисление липидов может повреждать мембраны митохондрий [2, 13].

Ткань сетчатки обладает огромной метаболической активностью, поэтому особенно чувствительна к данным изменениям и уязвима. Описанные процессы окислительного стресса приводят к характерному для НОН повреждению и истончению слоя ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и клинической манифестации заболевания.

Основным компенсаторным механизмом при поражении ГКС вследствие митохондриальных дефектов является митохондриальный биогенез [14]. Впервые термин «митохондриальный биогенез» использован в 1961 г. американским ученым J. Holloszy, описавшим процесс увеличения количества митохондриальных копий в клетках скелетных мышц с целью выработки большего объема АТФ в условиях повышенной потребности тканей в энергии при спортивных нагрузках [15]. Процесс поддержания количества митохондриальных копий в клетке контролируется механизмами биогенеза и деградации митохондрий. Форма митохондрий может меняться в результате процессов фузии (слияния) и разобщения (деления), которые являются частью жизненного цикла митохондрий. Если митохондрия повреждается, она делится, а затем уничтожается в результате митофагии. В здоровой клетке функционирование этих процессов помогает поддерживать постоянное необходимое для энергетического обеспечения ткани количество митохондриальных копий, а также избирательно уничтожать поврежденные органеллы. Однако в условиях окислительного стресса процессы удаления мутировавших копий могут нарушаться. В ответ на эти изменения клетка отвечает усиленной активацией биогенеза — компенсаторным увеличением количества копий мтДНК [16].

В условиях дефицита энергии и окислительного стресса в клетке активируется ряд сигнальных агентов (киназ), таких как 5’АМФ-активируемая протеинкиназа (АМФК), кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа (CaMK), p38 MAPK (митогенактивируемая протеинкиназа) и NAD-зависимая деацетилаза, запускающие транскрипционный каскад.

АМФК — клеточная протеинкиназа, регулирующая внутриклеточный энергетический метаболизм, в особенности в условиях острого энергетического дефицита. В результате активации АМФК при повышенном потреблении энергии в клетках блокируется синтез жирных кислот и усиливается их окисление. Активация сигнальных киназ в свою очередь инициирует уже имеющийся в клетке белок-коактиватор PGC-1α, которому принадлежит наиболее важная роль в регуляции процессов митохондриального биогенеза. Активированный PGC-1α переносится в ядро, где коактивирует ряд транскрипционных факторов, таких как ядерный респираторный фактор 1-го и 2-го типов NRF-1 и NRF-2, эстрогенсвязанный рецептор ERR-α, рецепторы, активируемые пролифераторами пероксисом PPAR-α и PPAR-γ, которые в свою очередь способствуют экспрессии транскрипционного фактора, А митохондрий Tfam. Tfam инициирует процессы транскрипции и репликации мтДНК. Помимо этого, предполагается, что PGC-1α может образовывать комплексы с митохондриальными транскрипционными факторами (Tfam-1, Tfam-2), что также инициирует экспрессию мтДНК [17]. Другими словами, результатом сложного каскада реакций, включающего в себя скоординированную активность митохондриального и ядерного геномов, является репликация молекулы мтДНК.

Успешную активацию митохондриального биогенеза частично пытаются связать с феноменом неполной пенетрантности, характерной для НОНЛ [18]. Известно, что только у некоторых обследуемых, связанных родством по материнской линии, с лабораторно подтвержденными мутациями в мтДНК развивается клиническая симптоматика заболевания [19]. Таким образом, наличие мутаций митохондриальной ДНК является важным аспектом, но недостаточным для развития НОНЛ, а пенетрантность заболевания может разниться в семьях с одной и той же мутацией или даже в пределах одной семьи, где некоторые могут всю жизнь оставаться носителями, а у других, наоборот, развивается клиническая симптоматика [20].

При исследовании различных тканей с высокой метаболической активностью, полученных от пациентов с подтвержденным диагнозом НОНЛ (скелетная мышца, периферическая кровь, посмертные образцы ткани зрительного нерва), обращало на себя внимание существенное увеличение количества митохондриальных копий у носителей НОНЛ с лабораторно подтвержденными мутациями, но без клинических симптомов по сравнению с заболевшими пациентами и пациентами контрольной группы.

Предположительно способность к успешной компенсаторной активации митохондриального биогенеза и увеличению количества митохондриальных копий определяет пожизненное носительство или, наоборот, предрасположенность к развитию заболевания [21, 22]. A. Bianco и соавторы создали модель для наблюдения за количеством мтДНК, которая учитывает 3 группы индивидуумов с приблизительным уровнем митохондриальных копий в клетке периферической крови 155±24, 301±63 и 612±14. Эти популяции разделены на контрольную группу, носителей и пораженных с приблизительным порогом 500 копий мтДНК, отделяющим носителей от пораженных. Проведен логистический регрессивный анализ, согласно результатам которого вероятность носительства без дальнейшего развития клинической симптоматики при количестве копий мтДНК больше 600 равнялась 100%, в то время как при количестве копий меньше 300 такая вероятность практически стремилась к нулю. У женщин кривая вероятности несколько отличалась от таковой у мужчин: при определенном количестве копий мтДНК вероятность носительства у них была значительно выше по сравнению с мужчинами (p<0,01), что коррелировало с данными о значительно более низком уровне риска развития заболевания у женщин [21].

Следует отметить, что в исследовании L. Iommarini и соавторов, оценивающих митохондриальную копийность, как у пациентов с НОНЛ, так и у пациентов с АДОН в образцах крови и тканей с высокой метаболической активностью отмечались более высокие показатели митохондриальной копийности по сравнению с контрольной группой. Исследователи высказали предположение, что это может быть связано с активацией компенсаторных механизмов у пациентов с выявленными мутациями [22].

В настоящее время предложена теория о благоприятной роли женских половых гормонов эстрогенов в развитии клинической симптоматики НОН [23]. Эстрогены известны своим мощным антиоксидантным действием [24]. При серии лабораторных исследований посмертных образцов тканей зрительного нерва обнаружено, что β-субъединицы рецепторов к эстрогенам находятся в митохондриях ГКС. При воздействии на клетки-гибриды с помощью антагониста рецепторов к эстрогенам ICI 182780 повышалась продукция АФК, что вело к снижению мембранного потенциала митохондрий, высокому уровню апоптоза, снижению жизнеспособности клеток по сравнению с клетками-гибридами контрольной группы. При применении 17β-эстрадиола описанные выше негативные эффекты в значительной мере уменьшались, а также повышалась активность антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы II [25, 26].

Аналогичные результаты получены при использовании фитоэстрогенов в комбинации с 17β-эстрадиолом. Фитоэстрогены (генестиен, даидзеин и др.) обладают высокоселективным действием на β-субъединицы рецепторов к эстрогенам, что является немаловажным, так как при воздействии на α-субъединицы отмечался ряд нежелательных побочных эффектов: гинекомастия и снижение либидо у мужчин, высокий риск развития рака молочной железы и рака шейки матки у женщин. При селективном блокировании β-субъединиц рецепторов к эстрогенам компенсаторные эффекты в виде снижения количества АФК и активации митохондриального биогенеза исчезали, в то время как при блокировании α-субъединиц рецепторов к эстрогенам описанные эффекты сохранялись. Исследования проводились на трансмитохондриальных клеточных гибридах (цибридах) [27].

Кроме указанных изменений, при применении 17β-эстрадиола и фитоэстрогенов отмечались активация собственного митохондриального биогенеза, а также небольшое, но статистически значимое увеличение энергетической мощности клетки.

В настоящее время широко обсуждается роль внешних факторов в развитии клинической симптоматики НОНЛ. В частности, помимо митохондриальных мутаций, наиболее явными триггерами развития НОНЛ считаются курение и употребление алкоголя [20]. Кроме прямого токсического действия на нервные волокна посредствам угнетения I комплекса дыхательной цепи митохондрий, никотин блокирует активацию митохондриального биогенеза, снижая компенсаторные возможности клеток и провоцируя развитие окислительного стресса [28]. Схожий патогенез обнаруживается при употреблении алкоголя и наркотических веществ, а также некоторых лекарственных препаратов. По данным ряда исследований, наибольшей токсичностью обладают антиретровирусные и противотуберкулезные препараты [29, 30].

Наибольшей активностью среди препаратов для антиретровирусной терапии отличаются нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ) — зидовудин, фосфазид, ламивудин, абакавир, принцип действия которых заключается в ингибировании обратной транскриптазы — ключевого фермента ВИЧ. Однако, помимо воздействия на обратную транскриптазу, НИОТ специфично угнетают активность содержащейся в митохондриях ДНК-полимеразы-γ (POLG), фермента, необходимого для репликации мтДНК, ингибируя таким образом процессы митохондриального биогенеза [31, 32].

Наиболее высокой активностью в отношении микобактерий туберкулеза характеризуются препараты гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК): изониазид, рифампицин и этамбутол [33]. Этамбутол является металлохелатором, который может нарушать функции металлсодержащих ферментов митохондрий, таких как медьсодержащая цитохром С оксидаза IV комплекса дыхательной цепи митохондрий и железосодержащая НАДН-оксидоредуктаза I комплекса, что негативно сказывается на процессах окислительного фосфорилирования [34, 35].

Однако следует отметить, что при регулярном приеме нейротоксичность проявляют и многие другие лекарственные препараты широко распространенных групп, например некоторые антибиотики, противоэпилептические препараты, а также аспирин [36]. Важным негативным фактором является контакт с пестицидами или цианидами в анамнезе [37].

На сегодняшний день существует несколько способов определения количества митохондрий в клетке. Так, используют метод окрашивания специфичными красителями, например MitoTracker, с последующим анализом полученных образцов с помощью трансмиссионно-электронной и флюоресцентной микроскопии. Метод используется для визуализации митохондрий в клетках [38]. Новым способом оценки жизненного цикла митохондрий является определение специфического генетически кодируемого белка MitoTimer — мутантной формы красного флюоресцентного белка, который по мере созревания изменяет свой цвет с зеленого на красный [39]. Еще один способ представляет собой определение активности митохондриальных ферментов, например цитратсинтазы, в лизатах клеток. Дыхательную функцию митохондрий оценивают с помощью метода респирометрии, а также путем измерения активности отдельных комплексов дыхательной цепи митохондрий методом флюориметрии [40]. С помощью данных методов можно выявить не только снижение работы комплексов, например комплекса I при НОНЛ и АДОН, но и компенсаторную активацию комплекса II, часто обнаруживаемую в условиях гипоксии, а также при дефектах комплекса I [41].

Для оценки митохондриального биогенеза используют методы количественной оценки мтРНК и уровня митохондриальных белков, а также митохондриальных транскрипционных факторов [42]. Однако при выполнении большинства из описанных методов для получения статистически значимых результатов при анализе РНК, белков или энзимов требуется либо рост клеточных культур in vitro, либо большое количество тканей или клеток, сохраняемых в определенных условиях, что не всегда представляется возможным в ходе исследования. В последнее время особое внимание уделяется методу количественной оценки мтДНК. Для этого оценивается соотношение копий митохондриального генома к ядерному геному. В проводимых ранее исследованиях применял??я метод саузен-блоттинга, однако на сегодняшний день более широко распространен метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. В основе метода лежит количественный анализ продуктов ПЦР путем определения их во флюоресцентном свете в ходе процесса амплификации. Анализ проводится в закрытой реакционной среде [43, 44].

Помимо измерения копийности мтДНК, в качестве теоретической оценки резистентности к развитию заболевания предложено определять уровень биомаркеров — фактора роста фибробластов 21 (FGF-21) и ростового фактора дифференцировки 15 (GDF-15) для подтверждения наличия митохондриальной патологии и установления степени выраженности процесса. Оба фактора являются сывороточными биомаркерами повреждения митохондрий. FGF-21 — гормоноподобный цитокин, который секретируется в основном в печени, адипоцитах и поджелудочной железе, участвует в процессах липидного и углеводного обменов [45]. По данным ряда исследований, концентрация FGF-21 повышается в сыворотке крови у пациентов с дисфункцией I комплекса дыхательной цепи митохондрий; повышение концентрации прямо пропорционально выраженности патологического процесса [46]. Отмечается специфичность FGF-21 для митохондриальной патологии с преимущественной вовлеченностью скелетных мышц [45]. GDF-15 является цитокином семейства трансформирующего фактора роста β — TGF-β. Он, подобно FGF-21, секретируется печенью, поджелудочной железой, а также легкими, плацентой и предстательной железой. Участвует в клеточном ответе на процессы острого воспаления и опухолевого роста. Повышение его уровня в сыворотке определяется у пациентов с кардиоваскулярными поражениями, при которых этот цитокин вырабатывается в кардиомиоцитах в ответ на ишемию, нитрозативный или окислительный стресс. По данным одного из исследований, у пациентов с подтвержденными митохондриальными заболеваниями c преимущественным поражением нервно-мышечного аппарата сывороточная концентрация GDF-15 была в 11 раз выше по сравнению со здоровыми пациентами, а также с пациентами, имеющими патологию тех же органов и систем, но без митоходриального генеза [47]. Сравнительный анализ специфичности и чувствительности двух биомаркеров выявил, эти показатели выше у GDF-15, что обусловлено специфичностью FGF-21 для митохондриальных заболеваний с преимущественным поражением скелетных мышц, в то время как концентрация GDF-15 повышается при любой митохондриальной патологии вне зависимости от клинического фенотипа [47].

Изучение компенсаторных механизмов при наследственных оптических нейропатиях дает возможность прогностической оценки вероятности развития клинической симптоматики и течения заболевания. Следует отметить возрастающий научный интерес к данным заболеваниям и необходимость детального изучения ряда аспектов для формирования более точных диагностических и терапевтических стратегий.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Шеремет Н.Л. — д-р мед. наук, ведущий научный сотрудник отделения клинических исследований в офтальмологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»; e-mail: sheremet_n@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-4597-4987

Андреева Н.А. — канд. мед. наук, научный сотрудник отдела клинических исследований в офтальмологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»; e-mail: natalia.hanakova@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-7329-5725

Шмелькова М.С. — аспирант отделения клинических исследований в офтальмологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»; e-mail: masha-1204@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-4731-638X

Цыганкова П.Г. — канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории наследственных болезней обмена веществ ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова»; e-mail: polgamma@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-3998-3609

Автор, ответственный за переписку: Шмелькова Мария Сергеевна — e-mail: maria.s.shmelkova@gmail.com; https://orcid.org/0000-0003-4731-638X