При глаукоме происходит прогрессирующая селективная гибель ганглиозных клеток сетчатки (ГКС), ведущая к специфическим изменениям диска зрительного нерва (ДЗН) и характерным изменениям зрительных функций. Несмотря на множество предложенных теорий, остается неясной истинная причина избирательности и растянутости по времени (от нескольких месяцев до нескольких лет) гибели ГКС при одних и тех же клинических предпосылках.

Принято считать, что одной из главных причин развития глаукомных изменений является повышение уровня внутриглазного давления (ВГД), который превышает толерантный по отношению к структурам головки зрительного нерва. Увеличенные значения ВГД потенциально влияют на ретинальный кровоток, гемомикроциркуляцию в головке зрительного нерва и опосредованно — на функцию ганглиозных клеток и структуры ДЗН. Немаловажным является факт обнаружения в глаукомном глазу (в частности, в сетчатке, водянистой влаге, радужке) индуцируемого гипоксией фактора (HIF1α), что подтверждает роль ишемического фактора в развитии глаукомы [1]. Эти изменения имеют свои характерные черты, например сменяющиеся эпизоды ишемии и реперфузии, которые в свою очередь могут быть связаны с колебаниями уровня как внутриглазного, так и артериального давления, что в целом обусловливает хроническое течение заболевания.

ГКС, функционирующие в условиях энергетического дефицита после начала заболевания и находящиеся в одних и тех же условиях, тем не менее гибнут в разные сроки. Этот факт, не нашедший еще полного объяснения, очень важен с точки зрения нейропротекции. Существующие предположения о том, что это связано с различным рецепторным профилем ганглиозных клеток, индивидуально реагирующих на повреждающие факторы, позволяют говорить об их разной терапевтической чувствительности к ряду лекарственных средств, которые можно рассматривать как нейроретинопротекторы [2]. Существуют разные типы ГКС; например, у мыши их 25, у человека — около 20 [3]. Были показаны отличия между ГК с on- и off-центрами, которые, соответственно, более эффективно отвечают на увеличение или уменьшение интенсивности света [4].

Функциональные нарушения в ГКС начинаются задолго до клинической манифестации заболевания. Имеющиеся данные позволяют предположить, что ишемия — реперфузия — гипоксия способны активизировать астроциты и микроглию в области головки зрительного нерва и провоцировать выброс различных химических веществ, оказывающих цитотоксическое действие [5, 6]. При нарушении функции глиальных клеток сетчатки во внеклеточном пространстве вокруг них повышается концентрация потенциально токсических веществ, таких как глутамат, оксид азота, TNFα и др. [7].

Глутамат, являясь нейротрансмиттером, присутствует в центральной нервной системе в норме и взаимодействует с расположенными на поверхности клетки NMDA-рецепторами. Однако увеличение его концентрации выше пороговых значений может вызывать гибель клеток вследствие массированного поступления ионов Са²⁺ внутрь клетки с образованием избытка продуктов перекисного окисления липидов, активных форм кислорода и оксида азота, ведущих к апоптозу; такое состояние называют глутаматной эксайтотоксичностью [8, 9].

Моделируя это состояние в культуре клеток сетчатки, можно изучить чувствительность ГКС к повреждающему воздействию и оценить терапевтическую эффективность предполагаемого нейропротектора.

В качестве ретинопротектора был выбран Ретиналамин, относящийся к классу пептидных биорегуляторов. Его таргетность обусловлена источником получения материала — препарат является продуктом экстракции и последующего процессинга тканей сетчатки крупного рогатого скота. Таким образом достигается органотропность препарата. Клинический опыт применения Ретиналамина достаточно хорошо известен. При его применении отмечены положительная динамика зрительных функций, улучшение показателей электрофизиологических исследований, что позволило авторам сделать вывод о нейропротекторном действии препарата [10].

Существует несколько технологий, при помощи которых возможно получение клеток из донорского материала. Как правило, для таких работ используют выделенную сетчатку новорожденных мышей, из которой готовят первичную клеточную культуру. Дальнейшее обогащение популяции ГК возможно было произвести одним из трех наиболее распространенных способов: 1) при иммунопэннинге суспензию клеток, полученную путем ферментативной диссоциации сетчатки, помещают на чашки Петри с предварительно нанесенными на них антителами к специфическим антигенам ГКС; 2) иммуномагнитная сепарация подразумевает связывание целевых клеток с магнитными микросферами и разделение популяций в магнитном поле сепаратора; 3) флюоресцентно-активированный клеточный сортинг, как следует из названия, использует для идентификации клеточных популяций флюоресцентную метку, и на основании экспрессии соответствующего маркера проточный цитометр оставляет клетку в суспензии или удаляет ее [11—14].

Для проведения исследования нами был выбран метод иммуномагнитной сепарации, поскольку, по имеющимся данным, он обеспечивает высокую выживаемость клеток [15].

Цель исследования ― изучить терапевтическую чувствительность культуры клеток сетчатки мышей к пептидному биорегулятору Ретиналамину в условиях смоделированного глутаматного эксайтотоксического повреждения.

Клеточную культуру получали из сетчатки новорожденных мышей линии Balb/c. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с руководством «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Мышей выводили из эксперимента путем передозировки эфирного наркоза. Глаза энуклеировали, помещали в охлажденный фосфатно-солевой буфер с добавлением гентамицина (40 мкг/мл) для предотвращения микробной контаминации. Изолированные под бинокулярным микроскопом сетчатки 6 мышей помещали в ростовую среду NeuroCult («StemCell Technologies», Канада) с добавлением антибиотиков (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл). После этого переходили непосредственно к выделению клеток.

На первом этапе при помощи набора «Neural Tissue Dissociation Kit — Postnatal Neurons» («Miltenyi Biotec», Германия) клеточные пласты сетчатки были дезагрегированы и переведены в форму суспензии. Для этого ткань инкубировали со смесью ферментов при периодическом встряхивании, осторожно и многократно пипетировали и пропускали через нейлоновый фильтр для удаления больших агрегатов. После центрифугирования и удаления супернатанта с диссоциирующими агентами переходили к следующему шагу — конъюгации с иммуномагнитными метками.

Для удаления нецелевых популяций (микроглии и сосудистого эндотелия) к клеточной суспензии добавляли биотинилированные антитела для деплеции клеток, несущих маркер CD48, к которым затем вносили связывающиеся с ними магнитные антибиотиновые микросферы MACSiBeads Particles диаметром 3,3 мкм. Для селекции ГК применяли их мечение магнитными микросферами CD90.1 MicroBeads диаметром 50 нм. Иммуномагнитную сепарацию клеточных популяций производили путем их двухстадийного обогащения. На первом шаге производили негативную селекцию нецелевых клеточных популяций: из суспензии удаляли эндотелиальные клетки и микроглию, связанные с магнитными сферами MACSiBeads. После помещения в магнитное поле сепаратора MACSiMAG™ Separator они локализовались у стенки пробирки, в то время как другие популяции оставались в осадке.

Отбирая клеточный осадок, деплетировали «ненужные» клетки, оставляя обогащенную фракцию ГКС.

Вторым этапом была позитивная селекция ГК, меченных магнитными микросферами CD90.1. Для этого клеточную суспензию пропускали через элюционную колонку MS Columns, что позволяло целевой клеточной популяции, несущей маркер CD90.1, зафиксироваться внутри колонки при помещении ее в магнитное поле. При вынесении колонки из магнитного поля популяция ГКС из нее вымывалась в пробирку.

Полученные таким образом клетки высевали на чашки Петри диаметром 35 мм, покрытые комплексом внеклеточных белков Matrigel («Corning Inc.», США) и культивировали в ростовой среде NeuroCult («StemCell Technologies», Канада) во влажной атмосфере при температуре 37 °C и с содержанием 5% СО₂.

Для выяснения природы клеток по экспрессии специфических для них маркеров проводили иммуноцитохимический анализ. Для этого клетки рассеивали на чашки Петри для конфокальной микроскопии («SPL Life Sciences Co., Ltd.», Корея), покрытые Matrigel. После 2 сут культивирования их фиксировали 10% забуференным формалином (10 мин, 4 °С).

Окраску на специфический маркер ГК — глутаминсинтетазу — проводили по двухступенчатой схеме: инкубация с первичными антителами Anti-Glutamine Synthetase antibody («Abcam Plc», Великобритания) в концентрации 5 мкг/мл в течение 1 ч при температуре 37 °C и инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой («Goat Anti-Rabbit IgG H&L Texas Red, Abcam Plc», Великобритания) в разведении 1:1000 в течение 1 ч при той же температуре.

За ростом и морфологией клеток наблюдали при помощи инвертированного микроскопа Zeiss Axio Vert. A1 с флюоресцентным блоком. Фоторегистрацию выполняли при помощи цифровой фотокамеры Canon 700D. Изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения AxioVision 4.7 и программного пакета ImageJ.

Оценка цитотоксичности. Первым этапом исследования стала проверка отсутствия токсичности препарата. Для этого на тестовой культуре фибробластов кожи здорового донора третьего пассажа был проведен цитотоксический тест с последовательными разведениями Ретиналамина. Для этого клетки рассевали в 96-луночный планшет в концентрации 5000 на лунку. Спустя сутки проводили экспозицию с препаратом на протяжении 24 ч. Был исследован широкий диапазон концентраций — от 5 до 0,009 мг/мл. По результатам этой части исследований была определена концентрация Ретиналамина, равная 1,25 мг/мл, при которой зафиксирована максимальная жизнеспособность клеток.

Моделирование эксайтотоксического повреждения. После фракционирования популяций на магнитной колонке выделенные клетки сетчатки были рассеяны в равной плотности в лунки 96-луночного планшета. На 2-е сутки культивирования в 1-ю группу лунок вносили раствор глутамата натрия до конечной концентрации 20 мМ, во 2-ю группу лунок — пептидный биорегулятор Ретиналамин в концентрации 1,25 мг/мл, в 3-ю группу — совместно оба вещества. Контролем служили интактные лунки. В каждой группе было по 3 повторяющихся лунки. Время экспозиции клеток с тестируемыми субстанциями составляло 24 ч.

Жизнеспособность клеток после экспозиции оценивали колориметрическим методом с использованием реагента CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent («Promega Corp.», США). Этот тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ в живых клетках переводить соль тетразолина (MTS-(3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3 карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолиум)) в окрашенное вещество — формазан, растворимый в культуральной среде. Оптическая плотность среды после инкубации с MTS-реагентом при этом прямо пропорциональна количеству формазана и, следовательно, количеству жизнеспособных клеток.

После инкубации с препаратами культуральную среду заменяли на свежую и в каждую лунку добавляли 20 мкл MTS-реагента.

Оптическую плотность измеряли с помощью автоматического планшетного фотометра Яхонт (АО «ИЦ Буревестник», Россия) при длине волны детекции 490 нм через 4 ч инкубации с реагентом.

Количество жизнеспособных клеток рассчитывали по формуле:

где Ао — среднее значение оптической плотности в образце; Аб — среднее значение оптической плотности в бланке; Ак — среднее значение оптической плотности в контроле.

Бланкирование производили по лункам, заполненным только ростовой средой. Контролем служили лунки, в которые не вносили исследуемые растворы.

Было установлено, что полученная в результате иммуномагнитной сепарации культура является смешанной и представлена двумя клеточными популяциями — ганглиозными клетками и глиальными клетками.

На микрофотографии (рис. 1)

В культуре также присутствуют крупные распластанные клетки глиального происхождения (рис. 2).

Чтобы подтвердить предположение, что эти клетки являются клетками глиального происхождения, был проведен иммуноцитохимический анализ с использованием антител к специфическому маркеру — глутаминсинтетазе, подтвердивший наличие данного антигена (рис. 3).

Результаты определения цитотоксичности Ретиналамина (рис. 4)

Для дальнейшего тестирования препарата на культуре клеток сетчатки была выбрана концентрация 1,25 мг/мл, обеспечившая максимальную выживаемость клеток в первой серии экспериментов.

После моделирования эксайтотоксического повреждения путем добавления избыточной концентрации глутамата было зафиксировано достоверно значимое снижение количества жизнеспособных клеток в культуре, которое составило 9% от аналогичного показателя в контроле.

При совместном же внесении глутамата и пептидного биорегулятора в его конечной концентрации 1,25 мг/мл количество выживших клеток существенно возросло и составило 51,6%. Различия между показателями групп статистически значимы при сравнении с использованием критерия Стьюдента (рис. 5).

В результате исследования была получена и изучена смешанная культура клеток сетчатки, представленная двумя популяциями — ГК и глиальными клетками. На полученной культуре было смоделировано эксайтотоксическое повреждение путем создания избыточной концентрации глутамата. При совместном внесении глутамата и Ретиналамина токсическое действие первого на выделенные клетки достоверно снижается, что может свидетельствовать о высокой терапевтической (нейропротекторной) активности исследованного пептидного биорегулятора.

Наши данные соотносятся с результатами других исследований, посвященных влиянию этого пептидного биорегулятора на выживаемость и восстановление тканей глаза в экспериментах in vitro как в смешанной культуре клеток сетчатки, так и в культуре пигментного эпителия крыс линии Wistar. По данным авторов, добавление Ретиналамина приводило к достоверному увеличению митотической активности клеток в культуре, а в эксперименте с ростом клеток из экспланта сетчатки эмбриона цыпленка стимулировало этот процесс [16, 17]. На животной модели адреналининдуцируемой глаукомы было показано стимулирующее влияние Ретиналамина на пролиферативную активность ретинального пигментного эпителия, морфометрически установлено протекторное действие на ГКС, при этом эффект может быть опосредован через увеличение активности мюллеровских клеток [17—19].

Полученные в настоящем исследовании результаты представляют особый интерес в связи с тем, что являют собой попытку экспериментально смоделировать ситуацию, происходящую в сетчатке глаукомного глаза, и тем самым объясняют терапевтическую эффективность водорастворимого пептидного биорегулятора Ретиналамина, применяемого в лечении глаукомной оптической нейропатии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.А., В.Е.

Сбор и обработка материала: А.Ф., Т.Я.

Написание текста: А.Ф., Т.Я.

Редактирование: С.А., В.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Еричев Валерий Петрович — д-р мед. наук, проф., зав. отделом глаукомы

e-mail: v.erichev@yandex.ru