Исмайлова У.С.

Национальный Центр офтальмологии им. акад. Зарифы Алиевой Министерства здравоохранения, ул. Джавадхана, 32/15, Баку, AZ1114, Республика Азербайджан

Мехтиев А.А.

Институт физиологии им. акад. Абдуллы Караева НАН Азербайджана, ул. Шариф-заде, 78, Баку, AZ1100, Республика Азербайджан

Исследование репаративных механизмов в сетчатке и гипоталамусе, обеспечивающих восстановление родопсина в условиях дистрофии сетчатки у кроликов

Журнал: Вестник офтальмологии. 2018;134(5): 39-47

Просмотров : 162

Загрузок :

Как цитировать

Исмайлова У. С., Мехтиев А. А. Исследование репаративных механизмов в сетчатке и гипоталамусе, обеспечивающих восстановление родопсина в условиях дистрофии сетчатки у кроликов. Вестник офтальмологии. 2018;134(5):39-47.
Ismaylova U S, Mekhtiev A A. Reparative mechanisms in retina and hypothalamus contributing to rhodopsin recovery in rabbit eyes with retinal dystrophy. Vestnik Oftalmologii. 2018;134(5):39-47.
https://doi.org/10.17116/oftalma201813405139

Авторы:

Исмайлова У.С.

Национальный Центр офтальмологии им. акад. Зарифы Алиевой Министерства здравоохранения, ул. Джавадхана, 32/15, Баку, AZ1114, Республика Азербайджан

Все авторы (2)

В настоящее время пигментная дистрофия сетчатки является тяжелой и плохо поддающейся лечению офтальмологической патологией. При этом заболевании наблюдается разрушение рецепторного аппарата сетчатки с последующей утратой зрительной функции. Некоторые исследователи считают, что этиология и патогенез пигментной дистрофии сетчатки связаны с нарушением нормального взаимодействия гипоталамуса с сетчаткой и что первопричина этой патологии обусловлена дисфункцией собственно гипоталамуса и ослаблением с его стороны трофического обеспечения сетчатки [1]. Эта точка зрения нашла экспериментальное подтверждение, в частности в исследованиях Н.А. Гаджиевой с коллегами на модели пигментной дистрофии сетчатки у кроликов, вызванной внутривенным введением монойодуксусной кислоты (МЙУК), в которых импульсная стимуляция вентромедиального ядра гипоталамуса способствовала более быстрому восстановлению амплитуды волн электроретинограмме при предъявлении вспышек света [2]. Кроме того, односторонняя электрокоагуляция супрахиазматического и супраоптического ядер гипоталамуса приводила к значительному снижению суммарной амплитуды электроретинограммы и ее компонентов (a- и b-волны) в контралатеральном глазу [3]. Указанные результаты свидетельствуют о трофическом влиянии ядер гипоталамуса на функционирование сетчатки, тогда как его ослабление приводит к значительному нарушению работы рецепторного аппарата сетчатки.

Известна группа белков-шаперонов, так называемых белков теплового шока (БТШ), с разными молекулярными массами, особенно БТШ с мол. массой 70 кДа (БТШ70), обеспечивающих поддержание нормальной конформации и функционирование белков тканей организма. Было обнаружено, что эта группа белков способствует восстановлению нарушенной конформационной укладки белков и за счет своей шаперонной активности осуществляет защиту клеток организма от таких неблагоприятных факторов, как высокая температура, гипоксия, кислое или щелочное значение рН окружающей среды, эпилептические судороги и т. д. [4, 5].

Ранее в Институте физиологии им. А.И. Караева НАН Азербайджана из головного мозга крыс был выделен серотонин-модулируемый антиконсолидационный белок (СМАБ), находящийся в прямой зависимости от уровня серотонина и реализующий его функции на внутриклеточном уровне [6]. На разных видах позвоночных было показано, что СМАБ обладает антимутагенной и антитоксической активностью к неблагоприятным факторам химической и бактериальной природы [7]. В опытах на мышах методом вестерн-блотинга было продемонстрировано, что внутрибрюшинное введение СМАБ вызывает в печени усиленный синтез БТШ70 [7].

Исходя из сказанного, целью настоящей работы явилось изучение молекулярных репаративных механизмов сетчатки и гипоталамуса в условиях экспериментальной дистрофии рецепторного аппарата сетчатки кроликов.

Материал и методы

Выделение СМАБ осуществляли из головного мозга быка, который гомогенизировали в экстрагирующем буфере, содержавшем 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,2), 0,3 М NaCl, 5 мМ ЭДТА и 0,1% тритон Х-100, в объемном соотношении ткани и буфера 1:4. Основными этапами фракционирования были: 1) осаждение сульфатом аммония в интервале 0—40% насыщения; 2) гель-хроматография на колонке (3×60 см) сефадекса G-150. Процесс отбора иммунопозитивных фракций после каждого этапа находился под контролем непрямого иммуноферментного анализа (НИФА) с применением поликлональных иммуноглобулинов к СМАБ [6]. Гомогенность выделенного белка оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле в трис-глициновой буферной системе (рН 8,3).

С целью выявления пигментной дистрофии и изменения ее тяжести под влиянием исследуемых препаратов был разработан метод определения уровня родопсина в сетчатке методом НИФА. Для этого из 35 глаз коров путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы выделили 1,6 мг родопсина [8], которые использовали для получения к нему иммуноглобулинов. Выделение сетчатки из глаз коров и все последующие операции по очистке родопсина осуществляли в затемненной комнате, освещаемой фотографическим фонарем (25 Вт) с красным светофильтром.

Иммуноглобулины к СМАБ и родопсину получали в результате 5—6-месячной иммунизации кроликов, вводя подкожно по 300 мкг очищенного белка всегда в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда («Sigma», Германия). Схема иммунизации была следующей: первые 3 инъекции с интервалом в 14 дней, затем по одной инъекции в 1 мес. Кровь забирали из ушной вены кролика через 10 дней после 3-й и следующих инъекций, выделяли сыворотку и осаждали иммуноглобулины равным объемом 100% сульфата аммония.

Уровень родопсина и БТШ70 в сетчатке и СМАБ в гипоталамусе кроликов интактной, контрольной и опытной групп определяли методом НИФА на полистироловых планшетах со средним уровнем адсорбции («Sigma», Германия) с применением поликлональных иммуноглобулинов к этим белкам. В качестве антигенов использовали суммарные белки сетчатки и гипоталамуса кроликов, которые извлекали экстрагирующим буфером (рН 7,2) и доводили до концентрации 20 мкг/мл с помощью 0,1 М буфера трис-HCl (pH 8,6). Каждую пробу дублировали трижды и по завершении реакции вычисляли среднюю арифметическую из значений трех проб. Концентрацию суммарных белков определяли по методу Бредфорд с использованием 0,01% раствора Кумасси бриллиантового синего G-250 на длине волны 595 нм. в качестве первых антител использовали кроличьи иммуноглобулины к белку СМАБ, родопсину и БТШ70, а в качестве вторых антител — козьи противокроличьи иммуноглобулины с конъюгированной пероксидазой хрена. Реакцию визуализировали с помощью субстрата пероксидазы хрена — 0,05% раствора ортофенилендиамина в 0,05 М цитрат-фосфатном буфере (pH 4,5). Реакцию останавливали 3 М раствором NaOH через 20 мин после добавления субстрата, а результаты реакции считывали в фотометре для ИФА «Molecular Devices Spectra Max 250» («MTX Lab Systems, Inc.», США) на длине волны 492 нм. Результаты исследования усредняли по группам и сравнивали по t-критерию Стьюдента.

Поликлональные антитела к СМАБ очищали из раствора иммуноглобулинов, полученных в результате иммунизации кроликов этим белком, методом аффинной хроматографии на колонке CNBr-сефарозы с предварительно иммобилизованным СМАБ. После нанесения на аффинную колонку иммуноглобулинов к СМАБ ее тщательно отмывали 20-кратным объемом 0,01 М раствора фосфатного буфера (рН 7,2) и под контролем спектрофотометра осуществляли элюцию специфически связавшихся антител хаотропным соединением — 3 М раствором роданистого калия. Элюированные антитела диализовали на холоде против забуференного 0,15 М хлористого натрия (рН 7,2) и замораживали. За один цикл с аффинной колонки элюировали до 12 мг антител (концентрацию антител определяли по методу Бредфорд).

Исследования выполнены на кроликах-самцах породы Шиншилла массой 2,2—2,6 кг, содержавшихся в условиях вивария. Все эксперименты по введению препаратов животным были выполнены в дневное время суток — между 13,00 и 16,00 ч. Пигментную дистрофию сетчатки создавали путем медленного (в течение 3 мин) однократного внутривенного введения кроликам МЙУК из расчета 26 мг на 1 кг массы животного в 2,5 мл стерильного физиологического раствора (тяжелая степень дистрофии) [2]. Сетчатку из глаз кроликов выделяли в затемненной комнате, освещенной фотографическим фонарем (25 Вт) с красным светофильтром.

Исходя из того, что исследуемые препараты вводили локально, в стекловидное тело глаза, плохо омываемое биологическими жидкостями организма и лишенное кровоснабжения, что, таким образом, исключает возможность попадания вводимых в один глаз препаратов в контралатеральный глаз, исследования в рамках каждой группы животных были выполнены на обоих глазах животных.

В 1-й серии исследований у кроликов (n=4) с помощью МЙУК создавали дистрофию сетчатки и через 12 сут животных умерщвляли и выделяли сетчатку из обоих глаз (8 глаз) и гипоталамус; в сетчатке методом НИФА определяли уровень родопсина и БТШ70, а в гипоталамусе — уровень СМАБ.

Во 2-й серии исследований были сформированы 3 группы животных: 1-я — интактная (n=4; 8 глаз), 2-я — контрольная (n=4; 8 глаз) и 3-я — опытная (n=4; 8 глаз). В контрольной группе животным вводили МЙУК и через 22 сут их умерщвляли и выделяли сетчатку из обоих глаз. У животных опытной группы также с помощью МЙУК создавали дистрофию сетчатки и через 15 сут в стекловидное тело обоих глаз вводили 150 мкл СМАБ в концентрации 1,5 мг/мл в стерильном физиологическом растворе. Через 7 сут после введения СМАБ (22-е сутки после введения МЙУК) кроликов умерщвляли, выделяли сетчатку из обоих глаз и методом НИФА определяли уровень БТШ70 в сетчатке у кроликов трех групп.

В 3-й серии исследований были сформированы 3 группы животных: 1) 1-я контрольная группа (n=4; 8 глаз); 2) 2-я контрольная группа (n=4; 8 глаз); 3) опытная группа (n=4; 8 глаз). У животных обеих контрольных и опытной групп с помощью МЙУК создавали дистрофию сетчатки, и через 15 сут в стекловидное тело обоих глаз животным 2-й контрольной группы вводили 150 мкл инактивированного СМАБ (30 мин на водяной бане при 55 °С) в концентрации 1,5 мг/мл в стерильном физиологическом растворе, а кроликам опытной группы аналогичным образом и в той же дозе вводили СМАБ. Через 7 сут кроликов умерщвляли, выделяли сетчатку из обоих глаз и методом НИФА определяли уровень родопсина.

В 4-й серии исследований были сформированы 3 группы животных: 1) 1-я контрольная группа (n=4; 8 глаз); 2) 2-я контрольная группа (n=4; 8 глаз); 3) опытная группа (n=4; 8 глаз). У животных контрольных и опытной групп с помощью МЙУК создавали дистрофию сетчатки и через 15 сут в стекловидное тело обоих глаз контрольных животных вводили кроличьи неиммунные γ-глобулины, а кроликам опытной группы — кроличьи поликлональные антитела к СМАБ. Препараты вводили в количестве 200 мкл и в концентрации 1,8 мг/мл в стерильном физиологическом растворе. Через 7 сут кроликов умерщвляли, из обоих глаз выделяли сетчатку и методом НИФА определяли уровень родопсина и БТШ70.

Полученные значения исследованных антигенов в гипоталамусе и сетчатке обоих глаз усредняли по группам животных и сравнивали по t-критерию Стьюдента.

Все серии экспериментов на животных выполняли в соответствии с требованиями Директивы Совета Европейского Сообщества (86/609/ЕЕС) и под наблюдением локального комитета по биоэтике.

Результаты

Результаты 1-й серии исследований показали, что через 12 сут после введения МЙУК животным в сетчатке отмечаются снижение уровня родопсина на 25% (0,275±0,011 и 0,206±0,007 опт. ед. в интактной и опытной группах соответственно; p<0,001) и повышение уровня БТШ70 на 47% (0,094±0,004 и 0,140±0,007 опт. ед. соответственно; p<0,001), тогда как в гипоталамусе наблюдается повышение уровня СМАБ на 22% (0,24±0,01 и 0,298±0,009 опт. ед. соответственно; p<0,01; рис. 1).

Рис. 1. Изменение уровня родопсина и БТШ70 в сетчатке и СМАБ в гипоталамусе через 12 сут после внутривенного введения кроликам МЙУК. ** — p<0,01; *** — p<0,001.

Во 2-й серии исследований было обнаружено, что на 22-е сутки после внутривенного введения МЙУК в сетчатке у кроликов контрольной группы отмечалось значительное (в 9,5 раза) снижение уровня БТШ70 (0,367±0,04 и 0,038±0,001 опт. ед. в интактной и контрольной группах соответственно; p<0,001; рис. 2).

Рис. 2. Влияние интравитреального введения СМАБ на фоне введения МЙУК на уровень БТШ70 в сетчатке у кроликов. *** — p<0,001.
В то же время интравитреальное введение СМАБ животным опытной группы на 15-е сутки после введения МЙУК приводило через 7 сут (22-е сутки после введения МЙУК) к резкому (в 23 раза) увеличению уровня БТШ70 относительно его уровня в контрольной группе (0,038±0,001 и 0,902±0,042 опт. ед. соответственно; p<0,001; рис. 2) в сетчатке.

Результаты исследования представлены в таблице.

Результаты исследования

В 3-й серии исследований было выявлено, что через 7 сут после интравитреального введения СМАБ в опытной группе животных, которым предварительно ввели МЙУК, в сетчатке не наблюдалось изменения уровня родопсина (0,255±0,01 и 0,257±0,006 опт. ед. в 1-й контрольной и опытной группах соответственно), тогда как во 2-й контрольной группе, животным которой также вводили МЙУК, интравитреальное введение инактивированного СМАБ вызывало заметное снижение уровня родопсина (0,2±0,009 опт. ед.; p<0,01; рис. 3).

Рис. 3. Влияние интравитреального введения СМАБ и инактивированного СМАБ на фоне введения МЙУК на уровень родопсина в сетчатке у кроликов. ** — p<0,01.

В 4-й серии исследований интравитреальное введение поликлональных антител к СМАБ кроликам опытной группы, предварительно получившим инъекции МЙУК, через 7 сут приводило к увеличению уровня родопсина (0,242±0,01 опт. ед.; p<0,01) и БТШ70 (0,158±0,01) в сетчатке (p<0,01; рис. 4)

Рис. 4. Влияние интравитреального введения антител к СМАБ на фоне введения МЙУК на уровень родопсина и БТШ70 в сетчатке у кроликов. ** — p<0,01.
относительно их уровня у животных 1-й контрольной (0,182±0,01 и 0,087±0,02 опт. ед.) и 2-й контрольной (0,184±0,009 и 0,113±0,006 опт. ед.) групп, которым также на фоне дистрофии сетчатки интравитреально вводили кроличьи неиммунные γ-глобулины.

Обсуждение

Полученные результаты указывают на то, что внутривенное введение животным МЙУК приводит к значительному снижению уровня родопсина в сетчатке, т. е. у животных под действием этого токсина действительно развивалась дистрофия рецепторного аппарата сетчатки [2]. При этом в ней отмечалось повышение уровня БТШ70, способного обеспечить восстановление поврежденной токсином конформационной структуры белка [9], с одновременным увеличением уровня СМАБ в гипоталамусе. Эти результаты указывают на запуск репаративных процессов в гипоталамусе и сетчатке, обусловленных дистрофическими изменениями рецепторного аппарата сетчатки.

Результаты 2-й серии исследований позволили прийти к заключению о том, что при развитии дистрофии сетчатки изменения в синтезе СМАБ в гипоталамусе первичны, а усиление синтеза БТШ70 в сетчатке вторично, поскольку введение СМАБ в стекловидное тело кроликам, предварительно получившим инъекцию МЙУК, вызывало многократное повышение уровня БТШ70 в сетчатке. Следовательно, можно сделать вывод о том, что гипоталамус осуществляет трофическое обеспечение клеток рецепторного аппарата сетчатки и в случае возникновения дистрофии в этих клетках трофическая активность гипоталамуса может значительно усиливаться. Сделанные на основании результатов выводы находятся в соответствии с ранее полученными в нашей лаборатории данными, свидетельствующими о резком снижении амплитуды суммарной амплитуды электроретинограммы и ее компонентов (a- и b-волны) в контралатеральном глазу у кролика после односторонней электрокоагуляции супрахиазматического и супраоптического ядер гипоталамуса [3]. Трофическая регуляция рецепторного аппарата сетчатки, по-видимому, может осуществляться как непосредственно серотонинергической системой гипоталамуса, так и опосредованно — за счет усиления этой системой синтеза БТШ70 в самой сетчатке.

Полученные данные согласуются с ранее полученными результатами других авторов, в которых электрическая стимуляция вентромедиального ядра гипоталамуса у кроликов со сформированной пигментной дистрофией сетчатки приводила к восстановлению ее рецепторной функции, что регистрировалось с помощью метода вызванных потенциалов на электроретинограмме в ответ на предъявление животному вспышек света [2]. Этими же авторами было продемонстрировано увеличение амплитуды электроретинограммы на световые стимулы у интактных животных после стимуляции вентромедиального ядра гипоталамуса [2], что также свидетельствует о существовании трофического обеспечения рецепторных клеток сетчатки со стороны гипоталамических ядер. В литературе существуют данные о наличии прямых ретиногипоталамических связей, способных обеспечить трофическую регуляцию рецепторных клеток сетчатки [10, 11].

Говоря о существовании трофической регуляции клеток рецепторного аппарата сетчатки со стороны гипоталамических ядер, необходимо учитывать, что в этом случае непременно должна существовать и обратная молекулярная сигнализация, с помощью которой эти ядра могут получать информацию о текущем функциональном состоянии рецепторных клеток сетчатки и соответствующим образом подстраивать свою трофическую активность под изменяющиеся синтетические потребности клеток сетчатки.

Результаты 3-й и 4-й серий исследований позволили выявить существование обратной связи сетчатки с гипоталамусом. В частности, в 3-й серии снижение уровня родопсина в сетчатке кроликов со сформированной дистрофией сетчатки на 7-е сутки после интравитреального введения инактивированного СМАБ указывает на то, что молекулы СМАБ с измененной конформацией, вероятно, конкурируют за связывание с рецепторами СМАБ в клетках сетчатки и, таким образом, препятствуют осуществлению трофического влияния СМАБ, синтезируемого в гипоталамусе и доставляемого к рецепторным клеткам, по-видимому, аксонным транспортом. Отсутствие эффектов интравитреального введения СМАБ на уровень родопсина в сетчатке относительно контрольной группы в этой серии вновь объясняется тем, что в контрольной группе уровень родопсина восстанавливался без каких-либо вмешательств извне — за счет трофического регуляторного влияния, осуществляемого гипоталамусом после повреждения молекул родопсина МЙУК.

На существование обратной связи от клеток сетчатки к гипоталамусу указывают также результаты 4-й серии исследований. Действительно, повышение уровня родопсина и БТШ70 в сетчатке у кроликов со сформированной пигментной дистрофией сетчатки под влиянием интравитреального введения антител к СМАБ свидетельствует о том, что, возможно, за счет механизмов обратного аксонного транспорта антитела к СМАБ поступают в гипоталамус и по принципу обратной регуляции инициируют в его клетках усиление синтеза СМАБ, который прямым аксонным транспортом доставляется к клеткам сетчатки и усиливает в них синтез молекул БТШ70, которые в свою очередь способствуют репарации поврежденных МЙУК молекул родопсина.

Таким образом, полученные в данном исследовании результаты указывают на существование трофического влияния, осуществляемого серотонинергической системой гипоталамуса, на рецепторные клетки сетчатки. Это влияние может реализовываться как непосредственно серотонинергической системой гипоталамуса, так и посредством усиления этой системой синтеза БТШ70 в сетчатке. При этом вероятно существование обратной исходящей из сетчатки сигнализации, с помощью которой серотонинергическая система гипоталамуса подстраивает свою трофическую активность под изменение характера функционирования рецепторного аппарата сетчатки.

Выводы

1. В модели дистрофии сетчатки отмечаются снижение уровня родопсина и повышение уровня БТШ70.

2. В модели дистрофии сетчатки в гипоталамусе наблюдается повышение уровня СМАБ.

3. Интравитреальное введение СМАБ на 15-е сутки после создания дистрофии сетчатки приводит к резкому увеличению в ней уровня БТШ70.

4. Через 7 сут после интравитреального введения инактивированного СМАБ животным с дистрофией сетчатки отмечается заметное снижение уровня родопсина.

5. Интравитреальное введение антител к СМАБ кроликам с дистрофией сетчатки через 7 сут приводит к увеличению в ней уровня родопсина и БТШ70.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: У.И., А.М.

Сбор и обработка материала: У.И., А.М.

Статистическая обработка данных: У.И., А.М.

Написание текста: У.И., А.М.

Редактирование: А.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Ариф А.Мехтиев — д-р биол. наук, руководитель лаборатории «Молекулярных основ интегративной деятельности»

e-mail: arifmekht@yahoo.com

https://orcid/0000-0002-8531-0627

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail