Кириленко М.Ю.

ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», ул. Победы, 85, Белгород, Россия, 308015

Тикунова Е.В.

ФГАОУ ВПО "Белгородский государственный национальный исследовательский университет"

Сиротина С.С.

ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», ул. Победы, 85, Белгород, Россия, 308015

Полоников А.В.

Кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск

Бушуева О.Ю.

Кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск

Чурносов М.И.

Кафедра медико-биологических дисциплин Белгородского государственного национального исследовательского университета

Изучение ассоциаций генетических полиморфизмов факторов роста с развитием первичной открытоугольной глаукомы

Журнал: Вестник офтальмологии. 2017;133(3): 9-15

Просмотров : 130

Загрузок : 5

Как цитировать

Кириленко М. Ю., Тикунова Е. В., Сиротина С. С., Полоников А. В., Бушуева О. Ю., Чурносов М. И. Изучение ассоциаций генетических полиморфизмов факторов роста с развитием первичной открытоугольной глаукомы. Вестник офтальмологии. 2017;133(3):9-15.
Kirilenko M Yu, Tikunova E V, Sirotina S S, Polonikov A V, Bushueva O Iu, Churnosov M I. Studying the association between genetic polymorphism of growth factors and the development of primary open-angle glaucoma. Vestnik Oftalmologii. 2017;133(3):9-15.
https://doi.org/10.17116/oftalma201713339-15

Авторы:

Кириленко М.Ю.

ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», ул. Победы, 85, Белгород, Россия, 308015

Все авторы (6)

Среди причин неустранимой слепоты в России глаукома занимает одно из ведущих мест, превышая среднеевропейский показатель в 1,5—2 раза [1]. По результатам многоцентровых эпидемиологических исследований, за последние 5 лет удельный вес глаукомы среди причин инвалидности по зрению значительно возрос с 20 до 28%, распространенность увеличилась с 0,12 до 0,62 и более на 10 000 населения субъекта федерации в зависимости от его особенностей и возраста жителей [2]. Первичная открыто-угольная глаукома (ПОУГ) — это форма заболевания, встречающаяся наиболее часто (от 72,3 до 96,1% всех видов глаукомы) [3]. Одна из ключевых ролей на всех этапах патогенеза глаукомы принадлежит факторам роста. Эти цитокины активируют синтез экстрацеллюлярного матрикса, регулируют продукцию матричных металлопротеиназ, участвуют в процессах репарации, влияют на ангиогенез, пролиферацию и апоптоз клеток [4].

Повышенный уровень внутриглазного давления (ВГД) является одним из ведущих факторов риска прогрессирования глаукомной оптической нейропатии (ГОН) [5]. Несмотря на широкий спектр различных гипотензивных препаратов, не всегда удается добиться «давления цели», т. е. медикаментозно снизить ВГД не менее чем на 30% от исходного. В большинстве случаев (53%) глаукомы медикаментозная терапия не в состоянии управлять ВГД в течение более 4 лет [6]. Современная тактика ведения больных с глаукомой ориентирована на раннюю хирургию, обеспечивающую лучший прогноз [7]. При этом существует определенная взаимосвязь между цитокиновым профилем и течением послеоперационного периода [8].

ПОУГ является мультифакториальным нейродегенеративным заболеванием [9]. В последние годы проводятся активные исследования ПОУГ-ассоциированных генов [10]. Однако следует отметить, что большинство исследований по изучению генов предрасположенности к ПОУГ проведены за рубежом [11—13]. Единичные работы, проводимые в России, фрагментарны и посвящены оценке вовлеченности в подверженность к ПОУГ лишь генов миоцилина (MYOC), оптиневрина (OPTN), цитохрома Р450 (CYP1B1) [14, 15].

Цель исследования — выявить вовлеченность генетических полиморфизмов факторов роста в предрасположенность к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Материал и методы

Объектом исследования послужили выборка из 162 больных (227 глаз) с ПОУГ II (56,8%) и III (43,2%) стадий с неэффективным местным гипотензивным лечением, 191 человек (382 глаза) контрольной группы и 90 больных (109 глаз) с ПОУГ II—III стадии (61,2 и 38,8% соответственно) с эффективным медикаментозным лечением, целевое ВГД у данной группы пациентов достигалось путем монотерапии препаратами первого выбора в оригинальной форме (аналоги простагландинов). Исследуемые группы были сформированы из индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации и не имеющих родства между собой, сроки наблюдения составили от 6 до 18 мес. Ввиду отсутствия статистически значимых отличий показателей пациентов с ПОУГ с эффективным лечением от данных группы контроля по полу, возрасту, национальности, месту рождения и отягощенности соматопатологией в дальнейшее исследование мы их не включали. В данной исследовательской работе мы изучали предрасположенность к развитию ПОУГ с резистентностью к местному гипотензивному лечению, поэтому группа контроля была сформирована из индивидуумов, у которых отсутствовали какие-либо признаки глаукомы, а также тяжелые соматические патологии, в том числе приводящие к поражениям глаз.

У большинства (84,6%) пациентов, включенных в группу с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, наследственность по глаукоме не отягощена. Критериями исключения больных из данной группы являлись антиглаукоматозное лазерное или хирургическое лечение в анамнезе, псевдоэксфолиативная, пигментная и вторичная глаукома, компенсированное ВГД на фоне монотерапии. Диагноз ПОУГ устанавливали по основным диагностическим признакам: повышенному уровню ВГД, наличию глаукоматозной экскавации диска зрительного нерва (ДЗН), характерным изменениям периферического поля зрения (ППЗ) [7]. Комплекс обследования пациентов составляли как клинические, так и инструментальные офтальмологические методы, включающие биомикроскопию, визометрию, тонометрию (тонометром Маклакова), кинетическую периметрию (согласно стандартной схемы ППЗ по 8 меридианам с интервалом в 45˚), тонографию, офтальмоскопию, гониоскопию.

Некомпенсированным считали уровень офтальмотонуса выше целевого давления для данных стадий глаукомы при использовании сочетаний гипотензивных препаратов (аналог простагландинов с фиксированной комбинацией бета-адреноблокатора и ингибитора карбоангидразы в форме оригинального лекарственного средства) [7]. Обследование проводили в офтальмологическом отделении ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница им. Святителя Иоасафа» и Медицинском центре микрохирургии глаза «Ковчег». Единицей исследования при данном анализе являлся только худший глаз, если повышенный офтальмотонус определялся на двух глазах [16].

Среди больных с ПОУГ (162 человека, 227 глаз), как и в группе контроля (191 человек, 382 глаза), распределение по полу было одинаковым (ПОУГ: женщин — 84 (51,85%), мужчин — 78 (48,15%); контроль: женщин — 98 (51,3%), мужчин — 93 (48,7%)) (р>0,05). Средний возраст пациентов с ПОУГ составил 70,53±8,43 года (изменялся от 46 до 89 лет), в контрольной группе — 69,24±10,14 года (изменялся от 40 до 87 лет) (р>0,05).

Проведен анализ вовлеченности генетических полиморфизмов факторов роста в формирование ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне местной медикаментозной гипотензивной терапии.

Всем больным с глаукомой и в группе контроля проведено типирование генетических полиморфизмов цитокинов: сосудисто-эндотелиального (VEGF-A с.-958C>T), инсулиноподобного (IGF-1 c.-1410T>C), трансформирующего (TGFβ-1 c.-1347T>C), рецептора инсулиноподобного (IGFR-1 g.99181663C>T) факторов роста. Выбор данных генов для исследования обусловлен их возможной вовлеченностью в этиопатогенез ПОУГ [4, 13].

Материалом для исследования послужила венозная кровь, взятая из локтевой вены пробанда в объеме 5 мл. Геномную ДНК из периферической венозной крови выделяли фенольно-хлороформным методом [17].

Генетические полиморфизмы цитокинов анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad Laboratories», USA) с использованием стандартных олигонуклеотидных зондов и праймеров для ПЦР (табл. 1), синтезированных фирмой «Синтол» (флюоресцентная детекция методом TaqMan). Генотипирование осуществляли с использованием программного обеспечения «CFX Manager».

Таблица 1. Структура олигонуклеотидных зондов и праймеров для ПЦР

Характер ассоциаций различных аллелей и генотипов с ПОУГ оценивали при помощи показателя отношения шансов (OR) [20]. Проведен расчет доверительного интервала (CI) для ОR-значения, в границах которого с вероятностью 95% находится показатель ОR [21].

Роль комбинаций аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов цитокинов в формировании генетической предрасположенности к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением изучена с помощью программного обеспечения «APSampler/Cygwin» [22, 23]. Для валидации найденных ассоциаций использовали точный критерий Фишера (Pf) и пермутационный анализ (Pperm) [24]. Значимыми считали различия сравниваемых частот, если Pf меньше 0,05 и Pperm равно или меньше 0,005 при условии, что значения 95% CI для OR не пересекают 1. С целью прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением использован метод математического моделирования (дискриминантный анализ) [20].

Результаты и обсуждение

В результате изучения распределения генотипов исследуемых генетических полиморфизмов установлено, что для всех анализируемых локусов как в группе контроля, так и в группе больных с ПОУГ выполнялось равновесие Харди-Вайнберга (HWE) (p>0,05) (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительная оценка частот аллелей и генотипов полиморфизмов факторов роста у пациентов с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением и в контрольной группе

Зафиксирована более высокая распространенность аллеля T IGFR-1 (rs 35767) (63,06%) у больных с ПОУГ по сравнению с аналогичным показателем в группе контроля, где он составил 56,02% (χ2=4,47, р=0,03, OR=1,34; 95% CI 1,02—1,76).

При проведении комплексного биоинформатического анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов установлено, что частота сочетания генетических вариантов С VEGF-A (rs 833061) и Т IGFR-1 (rs 4965425) среди больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (67,82%) выше, чем среди лиц контрольной группы (52,60%, Pperm =0,0003, Pf =0,0007).

Данное сочетание аллелей исследуемых полиморфизмов повышает риск развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (ОR=1,90, 95% CI 1,29—2,80).

Таким образом, нами установлена вовлеченность генетических полиморфизмов С VEGF-A с Т IGFR-1 и аллеля T IGFR-1 в формирование подверженности к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Одним из ключевых механизмов развития ГОН является дизрегуляция кровотока зрительного нерва. В ответ на тканевую гипоксию эндотелиальные клетки секретируют проангиогенные факторы, такие как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF-А), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) и его рецептор (IGFR-1). Этот процесс стимулирует каскад, ведущий к активации апоптоза ганглиозных клеток сетчатки [25, 26]. Следует отметить, что генетический вариант С локуса c.-958C>T VEGF-А (rs 833061) отвечает за повышенную продукцию сосудисто-эндотелиального фактора роста, приводящего к нарушению сосудистой ауторегуляции в сетчатке и зрительном нерве [27]. В соответствии с данными литературы по этому вопросу, известно, что уровень VEGF-A увеличен в плазме крови и во внутриглазной жидкости пациентов с глаукомой по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе [27]. В результате других исследований было определено, что в водянистой влаге пациентов с ПОУГ уровень IGF-1 и IGFR-1 повышен [28]. По данным ряда работ, их высокие концентрации связаны с нарушенной дренажной функцией трабекулярной сети, что обусловливает повышение уровня ВГД [29]. С помощью дискриминантного анализа разработана модель индивидуального прогнозирования риска развития ПОУГ с использованием данных о генетических полиморфизмах факторов роста с учетом более двадцати признаков, характеризующих медико-биологический и офтальмологический статус пациентов. Получены две линейные дискриминантные функции (ЛДФ), включающие следующие значимые признаки: возраст (x1), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз (x2) и микрососудистых изменений в конъюнктиве (x3), степень пигментации угла передней камеры (x4), наличие псевдоэксфолиативного синдрома (x5), генетический вариант по локусу VEGF-A с.-958C>T (x6) (критерий Уилкса 0,345 при F (6,274)=86,752 и р<0,00001) (табл. 3).

Таблица 3. Параметры линейных дискриминантных функций для пациентов с ПОУГ и контрольной группы

Уравнение ЛДФ имеет следующий вид [20]:

D= K + b1·х1 + b2·х2 + b3·х3 + … + bn·хn,

где D — дискриминантный показатель, K — кoнстaнтa, хi — предиктор, или независимая переменная, bi — дискриминантный коэффициент.

Согласно полученным данным (см. табл. 3), для пациентов с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением и контрольной группы уравнения ЛДФ будут следующими:

— для включения в группу больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением:

Dp = –41,126 + 0,994·x1 + 0,654·x2 – 9,637·x3 + 1,471·x4 + 1,869·x5 + 8,208·x6;

— для включения в контрольную группу:

Dk = –30,164 + 0,910·x1 – 1,009·x2 – 6,575·x3 – 1,561·x4 + 0,511·x5 + 7,094·x6.

В вышеуказанные уравнения ЛДФ подставляются значения соответствующих показателей конкретных индивидуумов и высчитываются новые признаки D. Индивидуумы включаются в ту группу (больные или контроль), для которой полученный признак D будет наибольшим [30].

Точность распознавания индивидуумов, относящихся к группе больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, составляет 87,09%, а группы контроля — 93,29%. В среднем процент правильных дискриминаций в исследуемых группах составляет 90,42%, диагностическая чувствительность модели — 89%, диагностическая специфичность — 94%, диагностическая эффективность — 91%.

С целью проверки работоспособности модели в анализ нами были дополнительно включены 2 пациента. С помощью полученных коэффициентов дискриминантной функции, на основе значений конкретных показателей у индивидуумов определена их вероятностная принадлежность к группе больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением или к группе контроля.

У пациента А. определены следующие показатели: возраст — 64 года, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз — есть (1), микрососудистые изменения в конъюнктиве — есть (1), II степень пигментации угла передней камеры — (2), псевдоэксфолиативный синдром — нет (0), генетический вариант локуса VEGF-A с.-958C>T — СС (2).

Dp = –41,126 + 0,994·64 + 0,654·1 – 9,637·1 + 1,471·2 + 1,869·0 + 8,208·2 = –41,126 + 63,616 + 0,654 – 9,637 + 2,942 + 16,416 = 32,865 (больные с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением);

Dk = –30,164 + 0,910·64 – 1,009·1 – 6,575·1 – 1,561·2 + 0,511·0 + 7,094·2 = –30,164 + 58,24 – 1,009 – 6,575 – 3,122 + 14,188 = 31,558 (контрольная группа).

Значение нового признака Dp больше Dk, следовательно, данный индивидуум относится к группе больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, что подтвердилось при дальнейшем динамическом наблюдении за этим пациентом. Комбинации гипотензивных препаратов не позволяли достичь целевого уровня ВГД, вследствие чего данному пациенту была рекомендована антиглаукоматозная операция.

У индивидуума B. определены следующие показатели: возраст — 67 лет, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз — есть (1), микрососудистые изменения в конъюнктиве — нет (0), степень пигментации угла передней камеры — 0, псевдоэксфолиативный синдром — нет (0), генетический вариант локуса с.-958C>T VEGF-A — СС (1).

Dk= –30,164 + 0,910·67 – 1,009·1 – 6,575·0 – 1,561·0 + 0,511·0 + 7,094·1 = –30,164 + 60,97 – 1,009 + 7,094 = 36,891 (контрольная группа);

Dp= –41,126 + 0,994·67 + 0,654·1 – 9,637·0 + 1,471·0 + 1,869·0 + 8,208·1 = –41,126 + 66,598 + 0,654 + 8,208 = 34,334 (больные с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением).

Максимальное значение нового признака (Dk) выявлено в группе контроля.

Таким образом, данная прогностическая модель позволяет выявлять индивидуумов группы риска по развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением. Индивидуумы этой группы требуют более частого диагностического контроля и раннего оперативного антиглаукоматозного лечения вследствие высокого риска прогрессирования заболевания.

Выводы

1. Генетический вариант T IGFR-1 (OR=1,34) и сочетание генетических вариантов С VEGF-A с Т IGFR-1 (ОR=1,90) являются факторами риска формирования ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

2. Разработана модель прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, включающая следующие предикторы: возраст, наличие сопутствующей патологии глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень пигментации угла передней камеры, наличие псевдоэксфолиативного синдрома, генетический вариант по локусу VEGF-A с.-958C>T. Точность распознавания модели составляет 90,42%.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки РФ «Изучение генетических факторов риска развития мультифакториальных заболеваний человека» (№ 511/2014).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.К., Е.Т., С.С., А.П., О.Б., М.Ч.

Сбор и обработка материала: М.К., Е.Т.

Статистическая обработка: М.К., Е.Т.

Написание текста: М.К.

Редактирование: М.Ч.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail