Среди причин неустранимой слепоты в России глаукома занимает одно из ведущих мест, превышая среднеевропейский показатель в 1,5—2 раза [1]. По результатам многоцентровых эпидемиологических исследований, за последние 5 лет удельный вес глаукомы среди причин инвалидности по зрению значительно возрос с 20 до 28%, распространенность увеличилась с 0,12 до 0,62 и более на 10 000 населения субъекта федерации в зависимости от его особенностей и возраста жителей [2]. Первичная открыто-угольная глаукома (ПОУГ) — это форма заболевания, встречающаяся наиболее часто (от 72,3 до 96,1% всех видов глаукомы) [3]. Одна из ключевых ролей на всех этапах патогенеза глаукомы принадлежит факторам роста. Эти цитокины активируют синтез экстрацеллюлярного матрикса, регулируют продукцию матричных металлопротеиназ, участвуют в процессах репарации, влияют на ангиогенез, пролиферацию и апоптоз клеток [4].

Повышенный уровень внутриглазного давления (ВГД) является одним из ведущих факторов риска прогрессирования глаукомной оптической нейропатии (ГОН) [5]. Несмотря на широкий спектр различных гипотензивных препаратов, не всегда удается добиться «давления цели», т. е. медикаментозно снизить ВГД не менее чем на 30% от исходного. В большинстве случаев (53%) глаукомы медикаментозная терапия не в состоянии управлять ВГД в течение более 4 лет [6]. Современная тактика ведения больных с глаукомой ориентирована на раннюю хирургию, обеспечивающую лучший прогноз [7]. При этом существует определенная взаимосвязь между цитокиновым профилем и течением послеоперационного периода [8].

ПОУГ является мультифакториальным нейродегенеративным заболеванием [9]. В последние годы проводятся активные исследования ПОУГ-ассоциированных генов [10]. Однако следует отметить, что большинство исследований по изучению генов предрасположенности к ПОУГ проведены за рубежом [11—13]. Единичные работы, проводимые в России, фрагментарны и посвящены оценке вовлеченности в подверженность к ПОУГ лишь генов миоцилина (MYOC), оптиневрина (OPTN), цитохрома Р450 (CYP1B1) [14, 15].

Цель исследования — выявить вовлеченность генетических полиморфизмов факторов роста в предрасположенность к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Объектом исследования послужили выборка из 162 больных (227 глаз) с ПОУГ II (56,8%) и III (43,2%) стадий с неэффективным местным гипотензивным лечением, 191 человек (382 глаза) контрольной группы и 90 больных (109 глаз) с ПОУГ II—III стадии (61,2 и 38,8% соответственно) с эффективным медикаментозным лечением, целевое ВГД у данной группы пациентов достигалось путем монотерапии препаратами первого выбора в оригинальной форме (аналоги простагландинов). Исследуемые группы были сформированы из индивидуумов русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации и не имеющих родства между собой, сроки наблюдения составили от 6 до 18 мес. Ввиду отсутствия статистически значимых отличий показателей пациентов с ПОУГ с эффективным лечением от данных группы контроля по полу, возрасту, национальности, месту рождения и отягощенности соматопатологией в дальнейшее исследование мы их не включали. В данной исследовательской работе мы изучали предрасположенность к развитию ПОУГ с резистентностью к местному гипотензивному лечению, поэтому группа контроля была сформирована из индивидуумов, у которых отсутствовали какие-либо признаки глаукомы, а также тяжелые соматические патологии, в том числе приводящие к поражениям глаз.

У большинства (84,6%) пациентов, включенных в группу с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, наследственность по глаукоме не отягощена. Критериями исключения больных из данной группы являлись антиглаукоматозное лазерное или хирургическое лечение в анамнезе, псевдоэксфолиативная, пигментная и вторичная глаукома, компенсированное ВГД на фоне монотерапии. Диагноз ПОУГ устанавливали по основным диагностическим признакам: повышенному уровню ВГД, наличию глаукоматозной экскавации диска зрительного нерва (ДЗН), характерным изменениям периферического поля зрения (ППЗ) [7]. Комплекс обследования пациентов составляли как клинические, так и инструментальные офтальмологические методы, включающие биомикроскопию, визометрию, тонометрию (тонометром Маклакова), кинетическую периметрию (согласно стандартной схемы ППЗ по 8 меридианам с интервалом в 45˚), тонографию, офтальмоскопию, гониоскопию.

Некомпенсированным считали уровень офтальмотонуса выше целевого давления для данных стадий глаукомы при использовании сочетаний гипотензивных препаратов (аналог простагландинов с фиксированной комбинацией бета-адреноблокатора и ингибитора карбоангидразы в форме оригинального лекарственного средства) [7]. Обследование проводили в офтальмологическом отделении ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница им. Святителя Иоасафа» и Медицинском центре микрохирургии глаза «Ковчег». Единицей исследования при данном анализе являлся только худший глаз, если повышенный офтальмотонус определялся на двух глазах [16].

Среди больных с ПОУГ (162 человека, 227 глаз), как и в группе контроля (191 человек, 382 глаза), распределение по полу было одинаковым (ПОУГ: женщин — 84 (51,85%), мужчин — 78 (48,15%); контроль: женщин — 98 (51,3%), мужчин — 93 (48,7%)) (р>0,05). Средний возраст пациентов с ПОУГ составил 70,53±8,43 года (изменялся от 46 до 89 лет), в контрольной группе — 69,24±10,14 года (изменялся от 40 до 87 лет) (р>0,05).

Проведен анализ вовлеченности генетических полиморфизмов факторов роста в формирование ПОУГ с некомпенсированным ВГД на фоне местной медикаментозной гипотензивной терапии.

Всем больным с глаукомой и в группе контроля проведено типирование генетических полиморфизмов цитокинов: сосудисто-эндотелиального (VEGF-A с.-958C>T), инсулиноподобного (IGF-1 c.-1410T>C), трансформирующего (TGFβ-1 c.-1347T>C), рецептора инсулиноподобного (IGFR-1 g.99181663C>T) факторов роста. Выбор данных генов для исследования обусловлен их возможной вовлеченностью в этиопатогенез ПОУГ [4, 13].

Материалом для исследования послужила венозная кровь, взятая из локтевой вены пробанда в объеме 5 мл. Геномную ДНК из периферической венозной крови выделяли фенольно-хлороформным методом [17].

Генетические полиморфизмы цитокинов анализировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе CFX96 («Bio-Rad Laboratories», USA) с использованием стандартных олигонуклеотидных зондов и праймеров для ПЦР (табл. 1), синтезированных фирмой «Синтол» (флюоресцентная детекция методом TaqMan). Генотипирование осуществляли с использованием программного обеспечения «CFX Manager».

Характер ассоциаций различных аллелей и генотипов с ПОУГ оценивали при помощи показателя отношения шансов (OR) [20]. Проведен расчет доверительного интервала (CI) для ОR-значения, в границах которого с вероятностью 95% находится показатель ОR [21].

Роль комбинаций аллелей и генотипов исследуемых полиморфных вариантов цитокинов в формировании генетической предрасположенности к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением изучена с помощью программного обеспечения «APSampler/Cygwin» [22, 23]. Для валидации найденных ассоциаций использовали точный критерий Фишера (P_f) и пермутационный анализ (P_perm) [24]. Значимыми считали различия сравниваемых частот, если P_f меньше 0,05 и P_perm равно или меньше 0,005 при условии, что значения 95% CI для OR не пересекают 1. С целью прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением использован метод математического моделирования (дискриминантный анализ) [20].

В результате изучения распределения генотипов исследуемых генетических полиморфизмов установлено, что для всех анализируемых локусов как в группе контроля, так и в группе больных с ПОУГ выполнялось равновесие Харди-Вайнберга (HWE) (p>0,05) (табл. 2).

Зафиксирована более высокая распространенность аллеля T IGFR-1 (rs 35767) (63,06%) у больных с ПОУГ по сравнению с аналогичным показателем в группе контроля, где он составил 56,02% (χ²=4,47, р=0,03, OR=1,34; 95% CI 1,02—1,76).

При проведении комплексного биоинформатического анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов установлено, что частота сочетания генетических вариантов С VEGF-A (rs 833061) и Т IGFR-1 (rs 4965425) среди больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (67,82%) выше, чем среди лиц контрольной группы (52,60%, P_perm =0,0003, P_f =0,0007).

Данное сочетание аллелей исследуемых полиморфизмов повышает риск развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением (ОR=1,90, 95% CI 1,29—2,80).

Таким образом, нами установлена вовлеченность генетических полиморфизмов С VEGF-A с Т IGFR-1 и аллеля T IGFR-1 в формирование подверженности к развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

Одним из ключевых механизмов развития ГОН является дизрегуляция кровотока зрительного нерва. В ответ на тканевую гипоксию эндотелиальные клетки секретируют проангиогенные факторы, такие как фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF-А), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) и его рецептор (IGFR-1). Этот процесс стимулирует каскад, ведущий к активации апоптоза ганглиозных клеток сетчатки [25, 26]. Следует отметить, что генетический вариант С локуса c.-958C>T VEGF-А (rs 833061) отвечает за повышенную продукцию сосудисто-эндотелиального фактора роста, приводящего к нарушению сосудистой ауторегуляции в сетчатке и зрительном нерве [27]. В соответствии с данными литературы по этому вопросу, известно, что уровень VEGF-A увеличен в плазме крови и во внутриглазной жидкости пациентов с глаукомой по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе [27]. В результате других исследований было определено, что в водянистой влаге пациентов с ПОУГ уровень IGF-1 и IGFR-1 повышен [28]. По данным ряда работ, их высокие концентрации связаны с нарушенной дренажной функцией трабекулярной сети, что обусловливает повышение уровня ВГД [29]. С помощью дискриминантного анализа разработана модель индивидуального прогнозирования риска развития ПОУГ с использованием данных о генетических полиморфизмах факторов роста с учетом более двадцати признаков, характеризующих медико-биологический и офтальмологический статус пациентов. Получены две линейные дискриминантные функции (ЛДФ), включающие следующие значимые признаки: возраст (x₁), наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз (x₂) и микрососудистых изменений в конъюнктиве (x₃), степень пигментации угла передней камеры (x₄), наличие псевдоэксфолиативного синдрома (x₅), генетический вариант по локусу VEGF-A с.-958C>T (x₆) (критерий Уилкса 0,345 при F (6,274)=86,752 и р<0,00001) (табл. 3).

Уравнение ЛДФ имеет следующий вид [20]:

D= K + b₁·х₁ + b₂·х₂ + b₃·х₃ + … + b_n·х_n,

где D — дискриминантный показатель, K — кoнстaнтa, х_i — предиктор, или независимая переменная, b_i — дискриминантный коэффициент.

Согласно полученным данным (см. табл. 3), для пациентов с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением и контрольной группы уравнения ЛДФ будут следующими:

— для включения в группу больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением:

D_p = –41,126 + 0,994·x₁ + 0,654·x₂ – 9,637·x₃ + 1,471·x₄ + 1,869·x₅ + 8,208·x₆;

— для включения в контрольную группу:

D_k = –30,164 + 0,910·x₁ – 1,009·x₂ – 6,575·x₃ – 1,561·x₄ + 0,511·x₅ + 7,094·x₆.

В вышеуказанные уравнения ЛДФ подставляются значения соответствующих показателей конкретных индивидуумов и высчитываются новые признаки D. Индивидуумы включаются в ту группу (больные или контроль), для которой полученный признак D будет наибольшим [30].

Точность распознавания индивидуумов, относящихся к группе больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, составляет 87,09%, а группы контроля — 93,29%. В среднем процент правильных дискриминаций в исследуемых группах составляет 90,42%, диагностическая чувствительность модели — 89%, диагностическая специфичность — 94%, диагностическая эффективность — 91%.

С целью проверки работоспособности модели в анализ нами были дополнительно включены 2 пациента. С помощью полученных коэффициентов дискриминантной функции, на основе значений конкретных показателей у индивидуумов определена их вероятностная принадлежность к группе больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением или к группе контроля.

У пациента А. определены следующие показатели: возраст — 64 года, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз — есть (1), микрососудистые изменения в конъюнктиве — есть (1), II степень пигментации угла передней камеры — (2), псевдоэксфолиативный синдром — нет (0), генетический вариант локуса VEGF-A с.-958C>T — СС (2).

D_p = –41,126 + 0,994·64 + 0,654·1 – 9,637·1 + 1,471·2 + 1,869·0 + 8,208·2 = –41,126 + 63,616 + 0,654 – 9,637 + 2,942 + 16,416 = 32,865 (больные с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением);

D_k = –30,164 + 0,910·64 – 1,009·1 – 6,575·1 – 1,561·2 + 0,511·0 + 7,094·2 = –30,164 + 58,24 – 1,009 – 6,575 – 3,122 + 14,188 = 31,558 (контрольная группа).

Значение нового признака D_p больше D_k, следовательно, данный индивидуум относится к группе больных с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, что подтвердилось при дальнейшем динамическом наблюдении за этим пациентом. Комбинации гипотензивных препаратов не позволяли достичь целевого уровня ВГД, вследствие чего данному пациенту была рекомендована антиглаукоматозная операция.

У индивидуума B. определены следующие показатели: возраст — 67 лет, наличие сопутствующих неинфекционных заболеваний глаз — есть (1), микрососудистые изменения в конъюнктиве — нет (0), степень пигментации угла передней камеры — 0, псевдоэксфолиативный синдром — нет (0), генетический вариант локуса с.-958C>T VEGF-A — СС (1).

D_k= –30,164 + 0,910·67 – 1,009·1 – 6,575·0 – 1,561·0 + 0,511·0 + 7,094·1 = –30,164 + 60,97 – 1,009 + 7,094 = 36,891 (контрольная группа);

D_p= –41,126 + 0,994·67 + 0,654·1 – 9,637·0 + 1,471·0 + 1,869·0 + 8,208·1 = –41,126 + 66,598 + 0,654 + 8,208 = 34,334 (больные с ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением).

Максимальное значение нового признака (D_k) выявлено в группе контроля.

Таким образом, данная прогностическая модель позволяет выявлять индивидуумов группы риска по развитию ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением. Индивидуумы этой группы требуют более частого диагностического контроля и раннего оперативного антиглаукоматозного лечения вследствие высокого риска прогрессирования заболевания.

1. Генетический вариант T IGFR-1 (OR=1,34) и сочетание генетических вариантов С VEGF-A с Т IGFR-1 (ОR=1,90) являются факторами риска формирования ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением.

2. Разработана модель прогнозирования риска развития ПОУГ с неэффективным местным гипотензивным лечением, включающая следующие предикторы: возраст, наличие сопутствующей патологии глаз, микрососудистых изменений в конъюнктиве, степень пигментации угла передней камеры, наличие псевдоэксфолиативного синдрома, генетический вариант по локусу VEGF-A с.-958C>T. Точность распознавания модели составляет 90,42%.

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки РФ «Изучение генетических факторов риска развития мультифакториальных заболеваний человека» (№ 511/2014).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.К., Е.Т., С.С., А.П., О.Б., М.Ч.

Сбор и обработка материала: М.К., Е.Т.

Статистическая обработка: М.К., Е.Т.

Написание текста: М.К.

Редактирование: М.Ч.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.