Эпителий глазной поверхности является примером первой линии защиты организма, в частности барьером между структурами глаза и внешней средой. Необходимым условием для обеспечения барьерной функции эпителиальной ткани является ее правильная организация, в значительной степени определяемая межклеточным взаимодействием и взаимодействием клеток с базальной мембраной. В норме клетки эпителия образуют между собой множество адгезивных, плотных и щелевых контактов, создаваемых за счет микрофиламентов, молекул клеточной адгезии, большинство из которых (кадгерины, ламинины, интегрины) являются Са-зависимыми трансмембранными белками.

Разнообразие элементов строения эпителиальной ткани, отвечающих за ее правильную организацию, является одной из причин сложного характера большинства известных заболеваний эпителия роговицы и разнообразия факторов, одновременно включенных в патогенетические цепочки.

В частности, синдром рецидивирующей эрозии роговицы (РЭР) — многофакторное заболевание, обусловленное нестабильностью связи эпителиального слоя клеток с базальной мембраной и характеризующееся повторяющимися эпизодами слущивания значительных по площади участков эпителия роговицы [1, 2].

Современные оптические методы прижизненной визуализации, используемые в офтальмологии (биомикроскопия, конфокальная микроскопия, оптическая когерентная томография), позволили охарактеризовать общую картину повреждений, возникающих в результате развития РЭР. На текущий момент описаны такие морфологические признаки РЭР, как неровность, приподнятость эпителия, эпителиальные микрокристы, буллы, а также изменения в строме (помутнения и клеточные инфильтраты) [3, 4].

Буллезная кератопатия (БК) — заболевание, развивающееся вследствие декомпенсации функции роговицы и характеризующееся ее стойким отеком с образованием булл в эпителиальном слое.

Совокупность признаков, выделяемых биомикроскопически, как правило, позволяет диагностировать РЭР и БК, однако для раскрытия патогенеза заболевания необходима визуализация структуры на более «тонком», субмолекулярном, уровне для оценки состояния и взаимоотношения межклеточных контактов, молекул адгезии и элементов внеклеточного матрикса и протеолитических компонентов, например матриксных металлопротеиназ (ММП).

Наиболее часто привлекаемыми методами в медико-биологических исследованиях, способными маркировать процессы на уровне биомолекул, являются высокоспецифичные иммуногистохимические методики окрашивания. Специфичность является как плюсом, так и минусом такого подхода — исследователь ограничен предполагаемым набором «целевых объектов исследования» и возможностью одновременно детектировать не более трех из них. Однако в сложных патологических процессах, к которым, несомненно, относится и патология эпителия роговицы, объектов, структурно вовлеченных в эти процессы, может быть достаточно много (см.таблицу).

Разнообразие описанных факторов, приводящих к возникновению заболевания и поддерживающих патологический процесс, находится в широком диапазоне — от генетической предрасположенности до дисбаланса MMП и других регулирующих молекул. Следовательно, для реконструкции патогенетических звеньев необходимо одновременно оценить взаимодействие клеток и компонентов внеклеточного матрикса, базальной мембраны — коллагена разных типов, ламинина, фибронектина и других, а также визуализировать микрорельеф базального слоя клеток, их якорные структуры и другие элементы межклеточных контактов — интегрины, кадгерины [12].

Предположительно, для одновременной визуализации объемной структуры образца, расположения компонентов внеклеточного матрикса и локализации ряда Ca²⁺— и АТФ-зависимых процессов на молекулярном уровне может быть применим метод лантаноидного контрастирования с последующим проведением СЭМ (рис. 1) [13].

Разнообразие Ca-зависимых процессов и локализаций Ca в белковых структурах эпителиальной ткани делает обоснованным применение изоморфного замещения Ca/Nd для контрастирования структуры роговичного эпителия.

Цель работы — оценка информативности изображений, полученных посредством визуализации структуры эпителия роговицы методом СЭМ с лантаноидным контрастированием на основе Ca/Nd изоморфного замещения в Сa-зависимых молекулярных системах.

Материал и методы

С помощью СЭМ исследовали соскобы переднего эпителия роговицы, полученные в условиях операционной у больных, страдающих РЭР (9 образцов мужчин 34—56 лет) или БК (4 образца мужчин 49—61 года), а также с кадаверных глаз без признаков офтальмологических заболеваний (5 образцов мужчин 22—49 лет).

Предварительно пациенты были обследованы стандартными офтальмологическими методами. Кроме того, проводили биомикроскопию и послойное исследование роговицы глаз (включая донорские) с помощью оптического когерентного томографа HRT II с роговичной насадкой.

В течение первых минут после забора биоптатов, когда клетки сохраняют достаточную метаболическую активность, образцы были контрастированы с использованием набора реактивов BioREE (ООО «Глаукон», Россия) по рекомендованному производителем протоколу:

1) первая промывка для удаления фосфатов с поверхности;

2) экспонирование в растворе хлорида неодима в течение 45 мин для насыщения контрастирующим веществом;

3) вторая промывка для удаления излишков растворов.

В результате контрастирования на СЭМ маркировались зоны, где кальций изоморфно заменяется на неодим, а также участки локализации энергозависимых процессов с высвобождением фосфат-аниона и последующим формированием нерастворимых фосфатов неодима [13, 14].

Подготовленные эпителиальные пласты расправляли поверх специализированной адгезивной углеродной ленты для СЭМ. Каждый образец размещали таким образом, чтобы доступными для наблюдения оказались одновременно и передняя поверхность эпителия, и базальный слой (эпителиальный пласт разрезали пополам и размещали различными поверхностями кнаружи или частично подворачивали).

Образцы размещали в камере сканирующего электронного микроскопа (EVO LS10, «Zeiss», Германия). Наблюдения вели в режиме низкого вакуума (EP, 70 Па) при ускоряющем напряжении 20—28 кВ и токе на образце 360—520 пА. Использовали катод LaB₆. Изображения захватывали в режиме детекции обратнорассеянных электронов (BSE).

Результаты и обсуждение

Во всех случаях лантаноидное контрастирование биоптатов позволило получить на СЭМ контрастные изображения с хорошо распознаваемой клеточной структурой.

В медико-биологических исследованиях наиболее распространены электронограммы, получаемые на СЭМ посредством детектора вторичных электронов. Лантаноидное контрастирование предполагает использование другого детектора — обратнорассеянных электронов. При этом получаемые изображения отличаются от привычных, так как детектируется сигнал с большей глубины образца и значительная часть объема тканей остается прозрачной для электронного пучка при высоких ускоряющих напряжениях. Формируемые изображения в некотором смысле оказываются близки к оптическим конфокальным изображениям, и для их интерпретации могут использоваться оптические термины — мутность, яркость и т. п.

Контрастность изображений, получаемых на СЭМ в режиме детекции обратнорассеянных электронов, определяется средним атомным весом каждого лежащего под поверхностью локального объема вещества образца. При этом яркие участки изображения соответствуют насыщенным тяжелыми химическими элементами структурам ткани. Оригинальный метод суправитального лантаноидного контрастирования служит для избирательного насыщения «тяжелыми» лантаноидами отдельных структур и маркирования ими некоторых цепочек клеточного обмена, что делает возможной их последующую визуализацию посредством СЭМ [13, 14].

В рамках настоящего исследования лантаноидное контрастирование биоптатов эпителия роговицы позволило при дальнейшем проведении СЭМ получить для разных состояний эпителиальной ткани (условная норма, БК и РЭР) значительно отличающиеся картины, прямо и косвенно характеризующие изменения ее ультраструктуры. При этом следует отметить высокую воспроизводимость наблюдаемых изменений. Очевидно, что паттерны на СЭМ-изображениях отражают вовлеченные в однотипные патологические процессы элементы ткани.

Способность лантаноидов включаться в цепочки кальциевого обмена и блокировать их известна [15]. Локализации, связанные с изоморфным замещением Ca/Nd, позволяют визуализировать Ca-зависимые процессы, в том числе клеточной адгезии, и ключевые типы включенных в этот процесс белковых молекул. Сюда входят два типа проявлений гетеровалентного изоморфизма: замена трех ионов кальция на два иона неодима (3Ca²⁺↔2Nd³⁺) — ситуация в структуре кадгерина; замена пары инонов кальция на ион неодима и щелочного металла (2Сa²⁺↔(Nd³⁺+Me⁺)) — описано для трансмембранных Ca-насосов. Интегрины и ламинины, являясь Ca-зависимыми белками, также вовлечены в процессы таких замен. При этом наиболее вероятная высокая локальная концентрация лантаноидов в контрастированном препарате будет связана с замещением пяти тройных сайтов Ca²⁺ в кадгеринах [16], обеспечивая наибольшую яркость клеточных контактов, в том числе десмосом на латеральной поверхности клеток.

Другая группа структурных позиций накопления лантаноидов — это результат их связывания со свободными фосфат-анионами. В этом случае лантаноиды (неодим) маркируют внутриклеточные зоны протекания активных энергозависимых процессов с потреблением АТФ и высвобождением фосфат-аниона (например, треки сборки цитоскелета, работы жгутиков, митохондрий) [17]. Выпадение и накопление взвеси простого фосфата неодима (NdPO₄) будет происходить вследствие его низкой растворимости и невозможности быть ремобилизованным системами клеточного обмена. Таким образом, яркость отдельных структур в толще клеток будет связана с активностью протекания в них обменных процессов, существовавшей на момент лантаноидного контрастирования образца [13].

Кроме этого, существует возможность неспецифического связывания лантаноидов со структурными белками внеклеточного матрикса и, соответственно, его «подсвечивания» на СЭМ-изображениях [18].

Исходя из описанных теоретических предпосылок, изображения биоптатов роговичного эпителия, полученные в настоящем исследовании, можно интерпретировать следующим образом.

СЭМ «нормального» эпителия роговицы

На сканограммах передней поверхности «нормального» роговичного эпителия контрастно выделяются границы между клетками, хорошо видна полигональная форма клеток десквамирующегося слоя (рис. 2, а). Весьма яркое свечение отдельных зон межклеточных границ показывает участки наибольшей концентрации кадгеринов и, таким образом, маркирует расположение десмосом, плотных и адгезионных контактов (указано стрелкой). Цитоплазма клеток умеренно замутнена, что говорит об активности протекавших в ней энергозависимых процессов с участием фосфат-аниона. Выделяются отдельные древовидные зоны (отмечено звездочкой), вероятно, связанные с преимущественными направлениями сборки цитоскелета. Сквозь замутненную цитоплазму видны ядра клеток. Можно отметить, что при таких условиях съемки обратное рассеяние электронов происходит не только в первом от поверхности слое клеток, но и на большей глубине, что визуально воспринимается как наложение «полупрозрачных» клеток друг на друга.

На базальной поверхности межклеточные контакты, содержащие кадгерин, светятся по всей протяженности границ клеток, что говорит о большей регулярности в их организации по отношению к переднему десквамирующемуся слою эпителия.

Черты строения роговичного эпителия, визуализируемые при применении методики лантаноидного контрастирования и СЭМ, хорошо согласуются с изображениями, получаемыми оптическими методами (выноска к рис. 2).

Базальная поверхность клеточного пласта прикрыта отделившейся вместе с образцом мембраной, которая полупрозрачна для электронов. Однако она не в состоянии полностью погасить «свечение» межклеточных границ, а всего лишь делает паттерн изображения смазанным. Структуры базальной мембраны (включая плотную пластинку) сохранены на всей наблюдаемой поверхности, что подтверждается повсеместным «облачным» свечением, вероятно, происходящим из-за неспецифического связывания коллагенов с неодимом. Схема такого разделения слоев представлена на рис. 3, а.

Сквозь базальную мембрану (БМ) просвечивают размытые полигональные границы клеток. На отдельных участках границы клеток базального слоя приобретают четкую очерченность и выглядят заметно ярче (см. рис. 2, б). Это наблюдение может иметь два принципиально разных объяснения: либо в пределах этих зон БМ истончена, либо это результат связывания с неодимом «просочившихся» с передней поверхности эпителия молекул. При этом геометрия такой трансмембранной ультрафильтрации повторяет контуры клеточных границ по всей толщине БМ (рис. 4).

Подобное объяснение представляется весьма вероятным, учитывая наличие парацеллюлярного транспорта жидкости в эпителиальной ткани [19].

СЭМ эпителия роговицы при буллезной кератопатии

При БК СЭМ-изображения эпителиального пласта со стороны передней поверхности демонстрируют сохранную архитектуру ткани на большей части площади образца. Регулярные клеточные границы на участках поверхности, не затронутых изменениями, несколько менее контрастны по сравнению с контрастностью нормального эпителия, хотя причина этого не ясна.

В предполагаемых зонах расположения булл, в которых повышенное давление привело к избыточному растяжению клеточного пласта, очертания клеток выглядят значительно ярче. Видимые границы клеток на этих участках утолщены, имеются зияния межклеточного пространства, зазубренность линий контактов и разобщенность клеток (рис. 5, а). На изображении с большим увеличением отчетливо видно двойственное строение зоны десмосомы с небольшим разобщением ответных частей одного контакта, принадлежащего двум смежным клеткам (см. рис. 5, б).

Базальный слой при БК, как правило, не перекрыт более плотными структурами. Межклеточные границы четкие, яркие (см. рис. 5, в), что косвенно свидетельствует о том, что механическое взаимодействие клеток друг с другом в пределах базального слоя не нарушено. Большие увеличения на СЭМ позволяют выявить «ворсинчатый» характер поверхности клеток базального слоя (рис. 5, г), что вероятно обусловлено наличием молекулярных ансамблей ламинина-5 (якорных филаментов), прикрепленных к клеточной мембране. По отношению к цитоплазме эти молекулярные группы с характерным строением выглядят достаточно яркими, что связано с наличием в их структуре Ca²⁺-связывающих сайтов, замещенных неодимом. Видимо, при соскабливании эпителия разделение произошло на границе светлой пластинки, причем с разрывом межмолекулярного контакта ламинин-коллаген-VII/коллаген-IV, так как молекулярные ансамбли ламинина-5 остались спаянными с клеткой. Возможность такого разделения иллюстрирует рис. 3, б. Это предположение согласуется с клиническими и морфологическими данными о формировании булл непосредственно под клеточным слоем, между ним и плотной пластинкой [11]. Представляется логичным, что при соскабливании эпителия при БК он снимается в зонах булл, включающих в себя в том числе и антиадгезивные вещества (тенасцин-С, фибриллин-1).

СЭМ эпителия роговицы при рецидивирующей эрозии роговицы

При РЭР изменения в структуре роговичного эпителия были выявлены по всей поверхности. На изображениях видны характерные ландкартообразные и фестончатые границы клеток (рис. 6, а, б). Отмечается повсеместная пятнистость передней поверхности, подчеркивающая неравномерность накопления Nd в структуре ткани, что может быть обусловлено тем, что секрет, покрывающий поверхность клеток, разрежен за счет высокой концентрации протеолитических ферментов. Можно наблюдать контрастированные ядра клеток в разреженной цитоплазме. На отдельных участках структура передней поверхности становится рыхлой, межклеточные контакты не визуализируются, а группы клеток образуют десквамирующиеся пласты. При слущивании крупных групп клеток обнаруживаются волокнистые мотивы в структуре основного вещества эпителиальной ткани, не характерные для «нормального» эпителия (см. рис. 6, в). Участки, где под поверхностным слоем обнажается слой, расположенный глубже, демонстрируют, что подобные изменения практически не затрагивают средние слои — взаиморасположение клеток подлежащего слоя близко к нормальному. Видимо, жизнеспособность клеток поверхностного слоя при РЭР снижена настолько значительно, что через поры в мембране внутренняя структура клеток контрастируется пассивно, а в тех случаях, когда целостность мембраны не нарушена, можно наблюдать цитоплазму, практически прозрачную для электронов. Ее темный фототон, без рассеяния электронов на каких-либо объектах внутри клеток, позволяет говорить о низком уровне протекавших энергозависимых процессов. В литературе также встречаются описания многочисленных отклонений в морфологии клеток роговичного эпителия при РЭР (многоядерность, сильная вариабельность размеров, кисты, вакуоли, слущивание) [20].

Со стороны базального слоя отмечаются зоны с отсутствием контрастирования неодимом межклеточных границ. Как видно на изображении (см. рис. 6, г), отделение эпителиального пласта от БМ при соскабливании происходит преимущественно без плотной ее части, хотя в некоторых случаях клеточный пласт оказался частично прикрыт веществом БМ в пределах своих контуров. На этих участках структура клеток под БМ плохо визуализировалась за счет наложения относительно яркого слоя коллагеновых волокон. Очевидно, в этой зоне отделение эпителиального пласта произошло с захватом плотной пластинки и входящих в ее состав коллагенов. Известно, что при РЭР наблюдается избыток MMП-2 [8], который приводит к деструкции коллагена IV — основного вещества БМ, что и может приводить к ее «размягчению».

Для того чтобы базальный слой клеток был покрыт отделившимся веществом плотной пластинки только на отдельных участках, при тракции должны были сформироваться поперечные разрывы вещества плотной пластинки, позволяющие частично отторгнуть ее, а частично оставить спаянной со структурами эпителия. Наиболее парадоксальное наблюдение связано с тем, что в большинстве случаев такое разделение коллагенового пласта плотной пластинки происходило по границам, согласующимся с границами вышележащих клеток базального слоя эпителия (см. рис. 6, г). Схема процесса показана на рис. 3, в. Механизм этого явления можно связать с просачиванием по межклеточному пространству в эпителии протеолитических ферментов, патологически повышенная концентрация которых описана [8]. В этом случае создается фокус концентрации MMП, что и приводит к ослаблению части БМ непосредственно под клеточными границами базального слоя эпителия. Это хорошо согласуется с предположительной схемой внутритканевого транспорта (см. рис. 4).

В тех местах, где произошло отделение БМ по светлой пластинке (см. рис. 3, в), для наблюдения доступна «ворсинчатая структура» эпителиоцитов (см. рис. 6, д). Яркость фибриллярных белковых структур (предположительно ламинина-5) на изображении определяется не только изоморфным замещением кальция, но и самой нитчатой формой. Исходя из сохранности молекулярных ансамблей якорных белков, можно предположить, что слабое сцепление с плотной пластинкой в этом случае обусловлено несостоятельностью якорных фибрилл коллагена VII [8].

Выводы

1. Лантаноидное контрастирование биоптатов эпителиального слоя роговицы для проведения СЭМ позволяет визуализировать особенности строения эпителиальной ткани при различных патологических состояниях.

2. На основе механизма Ca/Nd изоморфизма можно оценить структурную позицию большинства белковых молекул, участвующих в Ca-зависимых процессах, формирующих клеточную адгезию.

3. На основании данных о распределении неодима в структуре базальной мембраны описан механизм локального воздействия веществ на плотную пластинку в проекции клеточных границ базального слоя, возникающий при однонаправленной ультрафильтрации.

4. Полученные результаты подтверждают данные о несостоятельности якорного комплекса адгезии при развитии РЭР.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.Н., А.С.

Сбор и обработка материала: С.Т., И.Н., А.С.

Статистическая обработка: И.Н.

Написание текста: С.А., И.Н., А.С.

Редактирование: С.А., А.Ф.

Конфликт интересов отсутствует.