Одной из причин внезапного двустороннего снижения зрения у лиц молодого и среднего возраста являются наследственные оптические нейропатии (НОН). Их относят к группе митохондриальных заболеваний, в основе патогенеза которых лежит нарушение функции митохондрий вследствие повреждения митохондриального или ядерного генома. НОН Лебера (НОНЛ) и аутосомно-доминантная оптическая нейропатия (АДОН) — две наиболее распространенные разновидности НОН. Схожесть заболеваний заключается в селективной потере ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и раннем поражении папилломакулярного пучка, что приводит к потере центрального зрения [1].
Частота встречаемости НОНЛ варьирует от 1 случая на 31 тыс. на севере Англии, 1 — на 39 тыс. в Нидерландах до 1 на 50 тыс. в Финляндии [2—4]. АДОН развивается в 1 случае из 35 тыс. на севере Англии и в 1 — из 10—50 тыс. в Дании [5, 6]. Так как правильный диагноз при поражении зрительного нерва устанавливают не во всех случаях, представленные выше данные отражают неполную картину распространенности НОН.
Первым заболеванием, митохондриальная природа которого была подтверждена благодаря идентификации точечной мутации митохондриальной ДНК (мтДНК), стала НОНЛ [7]. В подавляющем большинстве случаев (около 95%) НОНЛ вызывает одна из трех мутаций: m.11778G>A в гене ND4, m.3460G>A в гене ND1 и m.14484T>С в гене ND6. Существует еще 11 мутаций (m.3635G>A, m.3700G>A, m.3733G>A, m.4171C>A, m.10663T>C, m.14459G>A, m.14482C>A, m.14482C>G, m.14495A>G, m.14502T>C m.14568C>T), которые признаны первичными для НОНЛ [8]. Практически каждый год открывают новые мутации мтДНК, которые получают статус кандидатных. Признание кандидатных мутаций первичными происходит только после того, как они будут обнаружены в двух и более независимых семьях с проявлениями НОНЛ. Необходимо также проведение биохимических исследований на клеточных культурах (фибробластах, цибридах) для подтверждения дефекта дыхательной цепи митохондрий, чтобы окончательно убедиться в патогенности мутации.
АДОН возникает как следствие мутации ядерных генов ОРА1 (в хромосоме 3q28—q29) или ОРА3 (в хромосоме 19q13.2—q13.3), регулирующих образование белков внутренней мембраны митохондрий, а также локусов ОРА4 (8q12.2—q12.3), ОРА5 (22q12.1—q13.1) и ОРА8 (16q21—q22).
Наличия одной только мутации мтДНК или ядерной ДНК недостаточно для объяснения неполной пенетрантности (фенотипического проявления гена в популяции) и тканеспецифичности поражения при НОНЛ и АДОН, вариабельной экспрессии (фенотипической выраженности признака) при АДОН. Многие индивиды с мутацией мтДНК являются носителями, не имеющими клинических проявлений НОНЛ, у лиц с мутацией гена ОРА1 зрительные функции страдают в различной степени, иногда пациент может не догадываться о наличии у него каких-либо изменений. Разные авторы приписывают вышеперечисленные особенности воздействию внешней среды и других генетических факторов. Существует несколько гипотез по поводу причин преимущественного поражения мужчин и неполной пенетрантности при НОНЛ, в том числе обсуждают влияние Х-хромосомы, женских половых гормонов, а также различных компенсаторных клеточных механизмов, таких как митофагия и митохондриальный биогенез [9—13]. Не установлено прямой взаимосвязи между различными мутациями гена ОРА1 и тяжестью заболевания, высказываются предположения о влиянии других ядерных генов на гибель ГКС и, следовательно, клиническую картину.
Основными патогенетическими звеньями дегенерации ГКС и зрительного нерва считают повреждение I дыхательного комплекса митохондрий, последующее увеличение активных форм кислорода (АФК) и активацию апоптоза. В последнее время активно изучают такие составляющие патологического процесса, как динамика митохондриальной сети, митофагия, митохондриальный биогенез, которые могут играть компенсаторную роль при развитии НОН.
Клеточное дыхание — это процесс переноса электронов по цепи дыхательных комплексов (электрон-транспортная сеть) внутренней мембраны митохондрий, завершающийся синтезом молекул аденозинтрифосфатсинтазы (АТФ). В ходе окислительно-восстановительных реакций, или окислительного фосфорилирования (ОФ), электроны передаются по 4 комплексам (I — NADH-CoQ-редуктаза, II — сукцинатдегидрогеназа, III — CoQН2-цитохром С-редуктаза, или комплекс bс1, IV — цитохром С-оксидаза) с участием 2 молекул-переносчиков (убихинона, или коэнзима Q, и цитохрома С), в результате накапливается трансмембранный протонный потенциал, который преобразуется на АТФ-синтазе (V комплекс) в макроэргические связи молекул АТФ, главный источник энергии в клетке.
Насчитывают около 87 белков дыхательных комплексов, из которых 13 кодируются мтДНК, а остальные — ядерной ДНК. Поэтому мутации, возникающие в обоих геномах, могут приводить к различным по степени тяжести нарушениям клеточного дыхания [14].
Дисфункция I комплекса встречается чаще других дефектов энергетического обмена митохондрий [15] и является общей для митохондриальных оптических нейропатий. Имея в составе примерно 45 субъединиц, I комплекс считается самым крупным среди дыхательных многопротеиновых комплексов, его субъединицы кодируются ядерным (38 субъединиц) и митохондриальным (7 субъединиц) геномами [16].
Исследования с различными ингибиторами I комплекса указывают на влияние трех основных мутаций (m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484T>С) на взаимодействие между I комплексом и убихиноном [1], снижающее синтез АТФ, что говорит о наличии дефекта I комплекса при НОНЛ [17]. Фибробласты кожи пациентов с мутацией гена ОРА1 имеют сниженный митохондриальный мембранный потенциал и нарушенный синтез АТФ в результате дисфункции I комплекса [18, 19]. Существование схожего биохимического дефекта ОФ при НОНЛ и АДОН было подтверждено при анализе скелетных мышц методом фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии in vivo [20, 21].
Однако дефект I комплекса не является единственным, ведущим к развитию митохондриальных оптических нейропатий. Биохимические исследования фибробластов с мутацией гена ОРА1 пациентов с АДОН выявили дефект активности одной субъединицы цитохром С-оксидазы (IV комплекс) [18].
АФК — молекулы и радикалы с высоким окислительным потенциалом, они образуются в качестве побочного продукта в процессе клеточного дыхания [22]. В клетке существует несколько источников АФК, главное место среди которых занимает дыхательная цепь митохондрий, комплексы I и III [23]. Подавляющее большинство АФК в митохондриях же и обезвреживается [24]. Количество продуцируемых АФК варьирует в зависимости от состояния клетки. При низких физиологических концентрациях они выступают необходимыми посредниками в передаче клеточных сигналов, регулируя образование и функции факторов транскрипции (p53, JAK, NF-kb, HIF-1), киназ (p38, PKA, PKC, ERK, JNK), фосфатаз (PTEN), ионных каналов и других митохондриальных протеинов, вовлеченных в апоптоз, митохондриальную динамику и биогенез [25]. При превышении некоторого предела происходит поражение молекул ДНК, белков и липидов, нарушается митохондриальный метаболизм, что приводит к клеточной дисфункции [23, 26]. Окислительное повреждение мтДНК может быть причиной увеличения частоты мутаций, ведущих к усугублению дыхательной дисфункции. Перекисное окисление липидов, в частности кардиолипина, входящего в состав внутренней мембраны митохондрий, негативно отражается на митохондриальнозависимом апоптозе, поддержании стабильности и динамике митохондрий [27]. Поэтому сохранение баланса между продукцией АФК и их ликвидацией антиоксидантными энзимами (супероксиддисмутазой, глутатионпероксидазой, пероксиредоксинами) имеет решающее значение для жизнеспособности клетки [26].
Поражение I комплекса в результате мутаций, вызывающих НОНЛ, проявляется сочетанием сниженного синтеза АТФ, нарастающего окислительного стресса и предрасположенности клеток к апоптозу [1, 28]. Увеличение продукции АФК вследствие дисфункции I комплекса наблюдали на различных гибридных клетках, несущих мутантные мтДНК, пациентов с НОНЛ [29, 30]. Нарастание окислительного стресса при АДОН было продемонстрировано на моделях дрозофил с мутацией в гене ОРА1 и мультисистемным фенотипом [31].
Снижение продукции энергии в митохондриях и окислительный стресс влияют на митохондриальные водопроницаемые поры (mitochondrial permeability transition pore, МРТР), которые ответственны за проникновение цитохрома С в цитозоль, их открытие ведет к набуханию клетки и апоптозу [32, 33].
Подвижность митохондрий определяет их взаимодействие с другими органеллами, поддержание целостности и клеточной жизнеспособности. К процессам митохондриальной динамики относят перемещения внутри клетки и взаимодействие с цитоскелетом; слияние (фузия) и разобщение (деление); движение крист (складок внутренней мембраны митохондрий) и их компонентов; формирование и дезинтеграцию митохондрий (митофагия).
Митохондриальная сеть находится в постоянном движении, которое зависит от слияния и деления митохондрий. Нарушение этих процессов несет драматические последствия для клеточного выживания. АДОН развивается в результате мутаций в гене ОРА1, кодирующем динаминзависимую ГТФазу, которая определяет митохондриальную фузию, организацию крист и контролирует апоптоз [34].
Нейроны с их длинными дендритами и аксонами имеют выраженную зависимость от митохондриальных функций, они особенно чувствительны к дефектам деления и передвижения митохондрий. Аксональный транспорт является высокоэнергозатратным процессом, митохондрия должна переместиться из тела нейрона в сетчатке к синаптическим окончаниям, которые находятся на удалении. Нарушение митохондриальных функций прерывает эффективный аксональный транспорт, в том числе и доставку митохондрий к наиболее энергозатратным частям клетки. Окислительный стресс может влиять на чувствительность клеток, таких как олигодендроциты, и нарушать миелинизацию аксонов. Какое-то время работают механизмы компенсации, выражающиеся в перестройке цитоскелета и нарастании количества митохондрий, но постепенно миелиновая оболочка истончается, увеличивается диаметр аксонов за счет их отека, происходит гибель нервных волокон [35, 36].
В процессе старения или в результате заболеваний части митохондрий, в том числе ответственные за динамику, теряют способность удовлетворять всем потребностям клетки, количество мутантных мтДНК растет в ходе репликации и под воздействием АФК. Часто происходящие процессы слияния и разобщения опосредуют элиминацию поврежденных частей митохондрий, нарушение одного из компонентов приводит к трагическим последствиям для клетки. Остановка фузии вызывает недостаточность ОФ, потерю мтДНК, нарушение подвижности митохондрий и усиление образования АФК [37—39]. Митохондриальная недостаточность, развивающаяся в результате отсутствия деления, приводит к снижению продукции АТФ, клеточной пролиферации и нарастанию аутофагии. Существует предположение, что деление митохондрий необходимо для сохранения их функционирования и поддержания клеточного гомеостаза [39].
В последнее время все больше внимания уделяется аутофагии из-за ее двойной и порой противоречивой роли в жизни клетки. Она является разновидностью программированной клеточной смерти, связанной с образованием аутофагосом, участвует в поддержании клеточного гомеостаза и получении строительного материала из старых компонентов клетки [40]. Аутофагия активируется под воздействием многочисленных стрессовых условий и необходима для выживания в них.
Разновидностью аутофагии является митофагия, выражающаяся в лизосомальной деградации поврежденных и/или нежелательных митохондрий [41]. Дисфункциональные митохондрии, например с высоким уровнем мутаций мтДНК, — первоочередная мишень для селективной аутофагии [42]. В клетке постоянно происходят процессы слияния и расщепления митохондрий. При гетероплазмии (состоянии, когда в клетке имеются и мутантные, и нормальные мтДНК) после деления митохондрий органеллы с высоким уровнем мутантных мтДНК в меньшей степени способны поддерживать мембранный потенциал и в большей степени производят АФК, следовательно, они не будут принимать участие в последующей фузии и, вероятно, подвергнутся митофагии [43, 44].
В фибробластах с мутацией гена ОРА1 пациентов с АДОН была определена повышенная чувствительность к стауроспорину, проапоптозному веществу, что связано с участием гена ОРА1 в высвобождении цитохрома С и апоптозе [34, 45].
Митохондриальный биогенез — комплексный процесс, включающий координированную экспрессию ядерных и митохондриальных генов. Так как кодирующая емкость мтДНК ограничена только 13 дыхательными субъединицами, ядерные гены нужны для ОФ, биосинтеза гема, белкового импорта, транскрипции и репликации мтДНК [46].
При митохондриальных заболеваниях нарушение в дыхательной цепи часто сочетается с увеличением общей массы митохондрий, что является компенсаторной стратегией клетки, стремящейся смягчить энергетический дефект. Митохондриальный биогенез может индуцировать повышенная продукция АФК.
Некоторая степень митохондриальной пролиферации при НОНЛ в скелетных мышцах подтверждена увеличением активности субсарколемной сукцинатдегидрогеназы [47, 48]. Более того, повышенная активность сукцинат-цитохром С-редуктазы при нормальной активности III комплекса обнаружена в клетках крови пациентов с мутацией m.11778G>A, что говорит о компенсаторном участии ядерного генома [9]. Возрастание количества копий мтДНК замечено в клетках крови у носителей мутаций m.11778G>A, m.14484T>С и у пациентов с клиническими проявлениями НОНЛ [10, 11]. Недавно было продемонстрировано, что усиление митохондриального биогенеза, запускаемого β-эстрадиолом, способно избавлять от энергетического дефекта у гибридных клеток с мутациями, обусловливающими развитие НОНЛ [12], что является правдоподобным объяснением большей заболеваемости среди мужчин. Наконец, группой авторов во главе с C. Giordano было установлено, что высокое содержание мтДНК и увеличенный митохондриальный биогенез в различных тканях отличают непораженных носителей мутации от тех, у кого есть клиническая картина НОНЛ. Это наблюдение дает убедительное объяснение неполной пенетрантности при НОНЛ [13].
Для изучения вышеизложенных патогенетических механизмов используют различные ткани организма: кровь, мышцы, кожу, а также гибридные клетки и подопытных животных, так как при НОН нарушение жизнедеятельности митохондрий имеет место не только в ГКС.
В данном обзоре мы подробнее остановимся на применении культуры фибробластов кожи пациентов с НОН, которая впервые была использована в 1992 г. [49]. Забор фибробластов может быть легко осуществлен с помощью кожной биопсии, они имеют неограниченный срок хранения, служат возобновляемым источником ДНК и рекультивируются из замороженных образцов в случае появления новых диагностических тестов. Таким образом, они являются удобной моделью для проведения цитологических и биохимических исследований в целях получения информации о функционировании отдельных компонентов дыхательной цепи, уровне продукции АТФ, состоянии мембранного митохондриального потенциала, изменениях митохондриальной динамики и митофагии [18, 19, 49—53]. Фибробласты полезны как при верификации и изучении патологических механизмов митохондриальных заболеваний, так и при оценке эффективности лечения [54], в том числе подборе индивидуальной терапии [52, 55].
B. Robinson и соавт. [49] обнаружили, что фибробласты пациентов с недостаточностью пируватдегидрогеназы, цитохромоксидазы, NADH-CoQ-редуктазы и множественными дефектами дыхательной цепи гибнут в среде с галактозой, так как в этих условиях анаэробный путь дыхания не функционирует и клетки не вырабатывают достаточного количества молекул АТФ.
Влияние 5 различных мутаций гена ОРА1 на энергетический обмен и динамику митохондриальной сети фибробластов пациентов изучали C. Zanna и соавт. [19]. В галактозной среде, несмотря на то, что фибробласты росли и поддерживали продукцию АТФ, отмечалось выраженное нарушение ее синтеза за счет дисфункции I комплекса, помимо этого, имело место шарообразное изменение структуры митохондриального ретикулума и остановка фузии в половине пораженных фибробластов. Состав дыхательных комплексов и уровень экспрессии субъединиц I комплекса были схожи с клетками контроля. При ко-иммунопреципитации отмечена прямая связь гена ОРА1 с субъединицами I, II и III, но не IV комплексов, а также с фактором индукции апоптоза [19].
Наличие митохондриального разобщения дыхания, ассоциированного со снижением продукции АТФ, у пациентов с АДОН (мутация гена ОРА1), АДОН с катарактой (мутация гена ОРА3) и НОНЛ было обнаружено при изучении их фибробластов. Несмотря на однотипные нарушения энергетического обмена при НОНЛ и АДОН, в культуре клеток кожи пациентов не наблюдалось схожих изменений митохондриальной структуры, поэтому авторы делают предположение о равноправном участии структурных и энергетических нарушений в патогенезе АДОН. В зависимости от мутации гена ОРА1 в фибробластах, выращенных в глюкозной среде, митохондриальная сеть могла быть нормальной или фрагментированной в различной степени [18].
Истинные патофизиологические механизмы, переводящие митохондриальную дисфункцию в результате мутаций, ассоциированных с НОНЛ, в избирательную гибель ГКС, остаются предметом дискуссии. В частности, обсуждается, что является более значимым в патогенезе НОНЛ: биоэнергетический дефект или хронический окислительный стресс или как комбинация обоих этих нарушений может играть роль в контексте выборочного поражения ГКС. Кажется правдоподобным, что эти механизмы ведут к изменению в мембранном потенциале митохондрий, снижая порог для открытия МРТР, регулирующих апоптоз [56].
Эффективного лечения митохондриальных заболеваний на данный момент не разработано. Единственный способ влияния на этиологию заболевания — генотерапия. При НОНЛ соответствующий ген мтДНК после реконфигурации может быть перенесен в ядерный компартмент с помощью вектора на основе аденоассоциированного вируса (adeno-associated virus). В результате клетка начинает производить нормально функционирующие белки. Впервые потенциальный положительный эффект от такого подхода был продемонстрирован на цибридах, несущих мутацию m.11778G>A [57]. Недавно были получены данные, подтверждающие длительную продолжительность генной экспрессии, надежность и безопасность генотерапии на моделях крыс и приматов с НОНЛ, фенотипически наблюдали сохранение ГКС и улучшение зрительных функций [58]. В настоящее время осуществляется набор пациентов с НОНЛ в 3 клинических исследования, находящихся в первой фазе, которые проводятся на территории Китая, США и Франции, при этом в двух из них могут участвовать только больные с мутацией m.11778G>A [59].
Более распространенной является патогенетическая терапия, которая включает в себя витамины и кофакторы (коэнзим Q10, фолиевую кислоту, витамин В
Возрастающее образование АФК — составная часть патогенеза НОН, поэтому их дезактивация является одним из методов борьбы с недостаточностью клеточного дыхания, некоторые витамины и кофакторы способны повышать антиоксидантный потенциал клетки, участвовать в удалении АФК, накопленных в митохондриях, и улучшать продукцию АТФ. Определенные положительные результаты были получены при использовании идебенона и EPI-743, короткоцепочечных аналогов убихинона, обусловливающего перенос электронов с I и II на III комплекс дыхательной цепи митохондрий и участвующего в элиминации свободных радикалов [61, 62].
На данный момент митофагию и ее инициацию все чаще рассматривают в качестве перспективного способа лечения гетероплазматических митохондриальных заболеваний, в том числе НОН. Были проведены опыты с использованием рапамицина на цибридных клетках, несущих мутацию m.11778G>A мтДНК, в ходе которых подтвердилась гипотеза о том, что усиление митофагии приводит к отсеиванию дисфункциональных митохондрий с высоким уровнем мутаций. Препарат ингибировал передачу сигнала к рецепторам мишени рапамицина млекопитающих (mammalian target of rapamycin), что вызывало слияние митохондрий с аутофагосомами, а также частичное восстановление уровня АТФ [63].
Несмотря на интенсивное изучение причин и механизмов развития митохондриальных НОН на клеточном и молекулярном уровне в последнее время, понимание взаимосвязи наследственных факторов, внешней среды и клинической картины заболевания в полной мере не ясно, остаются нерешенными вопросы компенсации генетических нарушений за счет различных клеточных механизмов, например митофагии и митохондриального биогенеза. Открытым остается вопрос возможностей профилактики и лечения данной патологии.