Саакян С.В.

ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва

Цыганков А.Ю.

ФГБУ "Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца" Минздрава России

Амирян А.Г.

ФГБУ "Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца" Минздрава России

Склярова Н.В.

ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19, Москва, Российская Федерация, 105062

Залетаев Д.В.

Лаборатория молекулярной генетики человека НИИ молекулярной медицины Первого московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Выживаемость при увеальной меланоме: роль молекулярно-генетических факторов

Журнал: Вестник офтальмологии. 2016;132(1): 3-9

Просмотров : 122

Загрузок :

Как цитировать

Саакян С. В., Цыганков А. Ю., Амирян А. Г., Склярова Н. В., Залетаев Д. В. Выживаемость при увеальной меланоме: роль молекулярно-генетических факторов. Вестник офтальмологии. 2016;132(1):3-9.
Saakian S V, Tsygankov A Iu, Amirian A G, Sklyarova N V, Zaletaev D V. Role of molecular and genetic factors in survival from uveal melanoma. Vestnik Oftalmologii. 2016;132(1):3-9.
https://doi.org/10.17116/oftalma201613213-9

Авторы:

Саакян С.В.

ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва

Все авторы (5)

Увеальная меланома (УМ) — наиболее распространенная первичная внутриглазная злокачественная опухоль во взрослой популяции [1, 2]. Отмечены также отдельные случаи развития УМ у детей и подростков [3, 4]. Около 50% больных с УМ умирают в результате метастатической болезни. Эта пропорция оставалась неизменной в течение всего прошлого столетия [5]. В 1996 г. G. Prescher и соавт. [6] выявили выраженную взаимосвязь между полной потерей (моносомией) хромосомы 3 в опухоли и смертью пациентов от метастатической болезни. В дальнейшем это было подтверждено другими исследователями вне зависимости от используемой методики генотипирования при определении статуса хромосомы 3 [7—11]. Удвоение хромосомы 8q усиливает прогрессирование опухоли при моносомии хромосомы 3, но не при дисомии хромосомы 3. В УМ хромосомные перестройки в коротком плече хромосомы 1 обнаруживаются примерно у трети пациентов и сходны по структуре с нарушениями, обнаруживаемыми в меланоме кожи [12]. Отмечено, что наличие перестроек в коротком плече хромосомы 1 в меланомах является признаком опухолевого прогрессирования. T. Häusler и соавт. [13] обнаружили статистически значимую (р=0,0001) корреляцию между делецией короткого плеча хромосомы 1 и моносомией 3.

В исследованиях, посвященных изучению профиля экспрессии генов (GEP), показано, что существует два разных класса УМ, ассоциирующихся со статусом хромосомы 3 и витальным прогнозом [14, 15]. Согласно данным L. Worley и соавт. [16], GEP можно рассматривать как более точный критерий при прогнозировании метастазов по сравнению с моносомией хромосомы 3 при его определении методом сравнительной геномной гибридизации или флюоресцентной гибридизации in situ. К одним из изучаемых генов относится RASSF1A, характерный для меланомы кожи. Метилирование RASSF1A показано и для клеточных линий УМ (91%), и в выборке из 39 первичных УМ с частотой 50% [17]. RASSF1A располагается в локусе p21.3 хромосомы 3, наиболее часто повреждаемой в клетках УМ, и является регулятором клеточного цикла; снижение его экспрессии нарушает контроль клеточного цикла в фазе G1/S, он является супрессором циклина D, гиперэкспрессия которого приводит к функциональной инактивации RВ, что вызывает прогрессирование УМ [18].

Выраженная ассоциация молекулярно-генетического профиля УМ с метастатической болезнью способствует развитию данного вида диагностики, и в ряде исследований показано, что большинство пациентов хотят знать риск развития у них метастазов вне зависимости от того, насколько эффективно и доступно их лечение [19—21]. К практической значимости молекулярно-генетических исследований следует отнести возможность проведения адъювантной терапии УМ, так как в такие исследования могут быть включены пациенты с высоким риском развития метастазов [19]. В связи со значимостью определения молекулярно-генетических аберраций для прогнозирования УМ нами была поставлена цель — проанализировать выживаемость группы пациентов с УМ и ее корреляцию с такими изменениями, как моносомия хромосомы 3, делеция короткого плеча хромосомы 1 и метилирование гена RASSF1A.

Материал и методы

Характеристика клинического материала. Обследованы 104 пациента с УМ, пролеченных в период 2005—2007 гг. Возраст пациентов составил 22—84 года (в среднем 53,7±12,2 года). Женщин было 66 (63,4%), мужчин — 38 (36,6%). Срок наблюдения составил 41—84 мес (60,9±8,8 мес).

У 101 (97,1%) пациента проведена энуклеация, у 3 (2,9%) — по показаниям выполнена блокэксцизия опухоли. У 4 (3,9%) больных энуклеации предшествовало органосохраняющее лечение (курс брахитерапии с применением Ru/Rh офтальмоаппликаторов).

В зависимости от локализации выделяли меланому цилиохориоидальной зоны — 26 (25%) пациентов, хориоидеи — 67 (64,4%), радужки — 4 (3,85%) и иридоцилиохориоидальной зоны — 7 (6,7%) пациентов.

Образцы тканей. После энуклеации пораженного глаза биопсийный материал опухоли и относительно неповрежденной хориоидеи, а также образцы периферической крови (консервант — 0,5 М раствора ЭДТА) сохраняли при –20 °С. Для исследования образцов тонкоигольной аспирационной биопсии материал собирали с цитологических препаратов.

Геномную ДНК из образцов опухолей, условно интактной хориоидеи и периферической крови выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенолхлороформной экстракцией. При выделении ДНК из цитологических препаратов собранный со стекла материал обрабатывали лизирующим буфером, содержащим протеиназу К, и полученный лизат использовали в качестве матрицы для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Потерю гетерозиготности в хромосомных районах 1p36, 1р31.3, 3p25.3, 3p21.3, 3p14.2, 3q12, 3q26.3, 3q28 идентифицировали с использованием высокополиморфных маркеров D1S243, D1S2145, D1S1635, D1S407, D1S3669, D1S438, D3S1038, D3S1317, D3S1568, D3S966, D3S1300, D3S1234, D3S2459, 16xTG_3q26.31, D3S3520, D3S2398. Контролем служила ДНК лейкоцитов периферической крови.

Для определения метилирования СpG-островков промоторных областей генов применяли метод метилчувствительной ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали ДНК из клеток УМ, предварительно гидролизованную рестриктазами HpaII (для гена RASSF1A).

Диспансеризация больных УМ. Диспансерное наблюдение осуществляли в соответствии с приказом № 135 Минздрава Р.Ф. от 19.04.1999 1 раз в 3 мес в течение первого года, затем один раз в 6 мес в течение второго года, в дальнейшем — 1 раз в год во взрослом консультативно-поликлиническом отделении МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца. Пациенты, которые по различным причинам не могли приехать на контрольный осмотр, сообщали о себе по телефону, факсу и через родственников путем передачи справок от онкологов и офтальмологов с места жительства. Часть данных получена путем запросов в департаменты здравоохранения по месту жительства пациентов.

Статистический анализ проводили с применением точного критерия Фишера и его значимости. Для исследования выживаемости пациентов после лечения использовали статистический метод множительных оценок Каплана—Мейера, а для оценки различия между двумя выборками — двухвыборочный критерий Уилкоксона (Манна—Уитни) и регрессионную модель Кокса. Для анализа полученной информации все наблюдения разделены на 2 типа: цензурированные (незавершенные), в которых исход не наступил на момент окончания исследования (пациенты живы) либо пациенты выбыли из исследования (в том числе смерть от других причин), и нецензурированные (завершенные), при которых зафиксирована смерть пациента от метастатической болезни. Расчеты проводили в пакетах программ для Windows (Microsoft Excel, Statistica 10.1).

Результаты и обсуждение

В период с октября 2005 г. по ноябрь 2007 г. в отделе офтальмоонкологии и радиологии МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца проведена 101 энуклеация и 3 блок-эксцизии УМ с последующим патогистологическим и молекулярно-генетическим исследованием во всех изучаемых случаях. Долгосрочное наблюдение пациентов (5 лет и более) проведено во всех случаях. На основе результатов проведенного молекулярно-генетического анализа все пациенты разделены на 3 группы: 1-я группа — пациенты с моносомией хромосомы 3 (n=45, 43,3%), 2-я группа — с делецией короткого плеча хромосомы 1 (n=30, 28,8%) и 3-я группа — с метилированием гена RASSF1A (n=23, 22,1%). Группы сравнения составили пациенты без исследуемых аберраций. В 11,5% случаев (n=12) мы отмечали наличие у пациента как моносомии хромосомы 3, так и делеции короткого плеча хромосомы 1. В 5,8% случаев (n=6) выявлены одновременно моносомия хромосомы 3 и метилирование гена RASSF1A. Сочетание делеции короткого плеча хромосомы 1 и метилирования гена RASSF1A обнаружено у 9 (8,7%) из 104 исследуемых. Наконец, сочетание трех молекулярно-генетических аберраций выявлено у 2 (1,9%) пациентов. У 29 (27,9%) человек не выявлено ни одной из исследуемых аберраций.

Для каждой группы приведены клинические и патоморфологические характеристики (см. таблицу). Статистически значимые (p<0,05) ассоциации удалось выявить при сопоставлении пациентов из группы моносомии хромосомы 3 и гистологических типов опухоли, причем для данной группы характерно преобладание прогностически наименее благоприятных типов — смешаноклеточного и эпителиоидно-клеточного (77,8%). Анализ ассоциаций гистологических типов УМ с опухолями из групп 1p и RASSF1A не выявил значимых различий между типами У.М. Также в группе моносомии хромосомы 3 выявлена ассоциация с вовлечением цилиарного тела в опухолевый процесс, что расценивается как неблагоприятный фактор, ухудшающий витальный прогноз [22]. Так, в данной группе мы наблюдали больше половины (51,1%) пациентов с цилиохориоидальной и иридоцилиохориоидальной локализацией УМ, что представляется значимым по сравнению с группами 1p, RASSF1A, а также общей когортой пациентов, где преобладали новообразования хориоидальной локализации без вовлечения цилиарного тела (p=0,038). В группе пациентов с делецией короткого плеча хромосомы 1 выявлена значимая ассоциация с экстрабульбарным ростом опухоли, одним из наиболее неблагоприятных прогностических факторов, увеличивающих вероятность развития метастатической болезни [23]. По нашим данным, выживаемость в группе делеции короткого плеча хромосомы 1 не отличалась от общей выживаемости, в связи с чем данная ассоциация может носить случайный характер.

Клинико-морфологические характеристики пациентов, вовлеченных в исследование Примечание. * — ассоциации статистически значимы (p<0,05).

Смертность от метастатической болезни составила 30,8% (n=32) (рис. 1). Живые на момент исследования (n=65, 62,5%) и умершие по другим причинам (n=7, 6,7%) составили 69,2% от общего количества пациентов в исследуемой группе. Средний срок наблюдения в общей группе пациентов составил 60,1±9,3 мес, при этом средняя продолжительность жизни пациентов от ликвидационного хирургического лечения до гибели вследствие метастатической болезни — 62,9±10,1 мес. Следует отметить, что в исследование вошли пациенты с «большими» УМ (средняя высота опухоли — 9,3±2,7 мм, диаметр основания — 15,7±3,6 мм). Таким образом, наши данные по общей выживаемости согласуются с данными других авторов, изучавших данный вопрос [24].

Рис. 1. Общая онкологическая выживаемость пациентов.

Отдельный интерес представляло изучение кумулятивной доли выживших в группе с моносомией хромосомы 3 (n=47) по сравнению с группой сравнения (n=57) (рис. 2, а). Анализ полученных данных показал, что в группе моносомии хромосомы 3 смертность от метастатической болезни превысила выживаемость (53,2% против 46,8%, p=0,002), что свидетельствует о значимой роли моносомии хромосомы 3 в выживаемости пациентов с У.М. Аналогичные данные приводят зарубежные авторы [13, 15, 20]. В группе сравнения выживаемость составила 87,7%, а смертность — 12,3%, что более чем в 4 раза ниже, чем в группе моносомии хромосомы 3. Таким образом, нами подтверждена ассоциация моносомии хромосомы 3 со сниженной выживаемостью при УМ.

Рис. 2. Ассоциация выживаемости пациентов со статусом хромосомы. а — при моносомии хромосомы 3; б — при делеции короткого плеча хромосомы 1.

Анализ выживаемости в группах с делецией короткого плеча хромосомы 1 (n=30) и в группе сравнения (n=74) показал, что смертность в группе 1p составила 36,7%, а в группе сравнения — 28,4% (см. рис. 2, б). Различия в выживаемости в двух подгруппах статистически не значимы (p=0,064). Схожие данные получены при сопоставлении пациентов из группы с метилированием RASSF1A (n=23) и группы сравнения (n=81) (смертность 26,1 и 32,1% соответственно; рис. 3). Однако следует отметить, что в отличие от группы с делецией короткого плеча хромосомы 1 данные различия статистически достоверны (p=0,037 по регрессионной модели Кокса), что может свидетельствовать о более благоприятном характере течения опухолевого процесса в новообразованиях с метилированием гена RASSF1A.

Рис. 3. Ассоциация выживаемости пациентов с метилированием гена RASSF1A.

В группе пациентов с сочетанием моносомии хромосомы 3 и делецией короткого плеча хромосомы 1 (n=12) смертность составила 75%, что значительно превышает общую онкологическую смертность (p=0,001). При сочетании моносомии хромосомы 3 и метилирования гена RASSF1A (n=6) мы выявляли смертность в 2/3 случаев, т. е. в 67% (p=0,03), а при сочетании делеции короткого плеча хромосомы 1 и метилирования гена RASSF1A (n=9) — в 22,2% случаев (p=0,068). Из двух пациентов, имевших все три молекулярно-генетические аберрации, один умер от метастатической болезни через 51 мес после проведенного лечения.

Таким образом, делеция короткого плеча хромосомы 1 не оказывала существенного влияния на выживаемость пациентов с УМ, а метилирование гена RASSF1A ассоциировано с благоприятным витальным прогнозом. Сочетание нескольких молекулярно-генетических изменений значимо ухудшало выживаемость пациентов.

Выводы

1. Изучено распределение частоты таких молекулярно-генетических изменений при УМ, как моносомия хромосомы 3, делеция короткого плеча хромосомы 1 и метилирование гена RASSF1A, а также их ассоциация с клинико-морфологическими параметрами УМ.

2. Показана статистически значимая ассоциация моносомии хромосомы 3 со смешаноклеточным и эпителиоидно-клеточным типом УМ, вовлеченностью в процесс цилиарного тела, а также ассоциация делеции короткого плеча хромосомы 1 с наличием экстрабульбарного роста опухоли.

3. Изучена общая 5-летняя выживаемость пациентов и смертность в результате метастатической болезни в группе «больших» УМ.

4. Показана достоверная ассоциация моносомии хромосомы 3 со сниженной выживаемостью пациентов, а метилирования гена RASSF1A — с улучшением витального прогноза.

5. Сочетание двух и более молекулярно-генетических изменений ухудшает выживаемость пациентов с УМ.

6. Выявленные особенности могут быть использованы для прогнозирования течения УМ у пациентов при выполнении энуклеации, блок-эксцизии опухоли, тонкоигольной аспирационной биопсии, а также для проведения в перспективе адъювантной терапии УМ у пациентов с высоким риском развития метастатической болезни.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.С., Д.З.

Сбор и обработка материала: А.Ц., Н.С., Д.З.

Статистическая обработка данных: А.А., А.Ц.

Написание текста: А.Ц., Н.С.

Редактирование: С.С., А.А.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail