Пролиферативная витреоретинопатия (ПВР), для которой характерны формирование и сокращение фиброзных мембран в стекловидном теле, сетчатке и в субретинальном пространстве, представляет собой одну из причин осложненного течения и рецидивирования отслойки сетчатки [1, 2]. Одним из этапов этого процесса является до конца не изученная стимуляция миграции и пролиферации фибробластов и фибробластоподобных клеток в стекловидном теле. Частота ПВР варьирует от 5,1 до 17,3%, составляя в среднем 9,9% [3].

Для изучения патогенетических механизмов возможного влияния различных факторов стимуляции, а также возможностей медикаментозного влияния на развитие и течение пролиферативных процессов используются экспериментальные модели ПВР с различными механизмами индукции пролиферации. В частности, применяют введение культуры фибробластов кожи, аутологичных клеток пигментного эпителия сетчатки, плазмы с тромбоцитами, мононуклеаров крови, ферментов, избирательно разрушающих коллагены базальных мембран (диспаза), а также проведение ретинотомии с витрэктомией, криотерапии [4—8]. Как в случае естественного течения ПВР, эти модели основаны на появлении в стекловидном теле пула клеток с пролиферативным потенциалом. Тем не менее до сих пор окончательно не ясно, что является основным стимулятором ПВР среди множества факторов риска.

На экспериментальных моделях всесторонне изучены характер клеточных взаимодействий, эффекты цитокинов и хемокинов, ростовых факторов, указывающих на воспалительный характер ПВР [2, 9]. Известно, что риск ПВР увеличивается при наличии признаков увеального воспаления в предоперационном периоде у пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки [10]. В то же время остается недостаточно изученной возможность усиления пролиферации в случае наличия в структурах заднего сегмента глаза субклинического инфекционно-обусловленного хронического воспалительного процесса, хотя в предыдущих работах указывается на выявление скрытых инфекций, в частности хламидийной, в субретинальной жидкости у пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки [11]. Однако работ по исследованию влияния инфекционного фактора, в частности скрытых инфекций органа зрения, на стимуляцию и развитие ПВР нет.

Цель работы — изучить влияние хламидийной инфекции C. trachomatis на стимуляцию и развитие ПВР в эксперименте.

Дизайн исследования представлен на рис. 1.

Животные. Экспериментальное моделирование ПВР выполнено на 14 кроликах (14 глаз) породы шиншилла массой 2,5—3 кг в возрасте от 1 до 2 лет с соблюдением Стокгольмской декларации о гуманном обращении с лабораторными животными. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом. Сформированы 2 группы животных.

Опытная группа (7 животных): моделировали ПВР с ранее произведенным интравитреальным введением серовара L2 C. trachomatis.

Контрольная группа (7 животных): моделировали ПВР кроликам, которым предварительно за 8 нед в стекловидное тело вводили через плоскую часть цилиарного тела 0,1 мл транспортной среды без возбудителя.

Возбудитель и формирование опытной группы. Для моделирования хламидийного поражения органа зрения использовали серовар L2 C. trachomatis, полученный из банка культур отдела микробиологической диагностики возбудителей ООИ ФГУ «ГосНИИ военной медицины» МО Р.Ф. Возбудителя, культивированного на куриных эмбрионах, применяли в форме суспензии с фосфатно-солевым буферным раствором (pH 7,2) в концентрации 10⁷ колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл.

Для получения модели субклинического инфекционно-воспалительного процесса в заднем сегменте глаза группу животных (n=17) инфицировали путем интравитреального введения через плоскую часть цилиарного тела 0,1 мл суспензии инфекционного агента в правый глаз. Из 8 животных с минимальной клинической манифестацией хламидийного поражения в форме конъюнктивита, слабой инфильтрации стекловидного тела, проходящих в течение 8 нед, перед проведением моделирования ПВР в опытную группу включили 7 животных, а у 1 животного провели морфологическое исследование инфицированного глаза.

Модель ПВР. Все манипуляции с органом зрения, связанные с болевыми реакциями, проводили под эпибульбарной анестезией с применением 0,4% раствора оксибупрокаина (Инокаин, «Медикал Экспортс»). Перед введением инфекции кроликам опытной группы и перед моделированием ПВР у всех животных исследовали образцы соскобов с конъюнктивы методом ПЦР и венозную кровь методом ИФА на наличие хламидийной инфекции.

Моделирование ПВР проводили, выполняя 4 прокола глазного яблока инъекционной иглой 19 G через периферические отделы сетчатки в правый глаз (в нижненаружном квадранте на расстоянии 5 мм от лимба) [7].

Офтальмологическое наблюдение. Биомикроофтальмоскопия с асферическими линзами 78, 120 Д, офтальмоскопия налобным бинокулярным офтальмоскопом с фоторегистрацией изменений стекловидного тела и сетчатки, ультразвуковое исследование в B-режиме (12 МГц). Обследование производили перед инъекцией, каждые сутки после инъекции в течение 3 нед, далее еженедельно в течение 20 нед наблюдения. При градации ПВР использовали классификацию Fastenberg и соавт. [5].

Морфологические и иммуногистохимические исследования. Перед моделированием у 1 инфицированного животного с минимальными клиническими проявлениями, а также в каждой группе у 1 животного на 7-й неделе наблюдения и у всех остальных через 20 нед наблюдения производили энуклеацию после воздушной эмболизации в условиях общей анестезии. Энуклеированные глазные яблоки рассекали в сагиттальной плоскости, не допуская потери стекловидного тела, исследовали макроскопические изменения методом биомикроскопии, фотографировали макропрепараты, после чего осуществляли гистологическую проводку с заливкой материала в парафин и изготовлением серийных парных срезов толщиной 4—6 мкм по стандартному протоколу. Один из парных срезов окрашивали гематоксилином и эозином с последующей световой микроскопией (Leica MT 2500), другой — исследовали методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с использованием диагностического набора Хламискан («Лабдиагностика», Россия).

Статистический анализ проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 6.0. Для сравнения значений между группами использовали U-тест Манна—Уитни. Значимыми считали результаты при р<0,05.

Клиническое течение процесса. У 8 животных, отобранных для опытной группы, после введения возбудителей клиническое течение поражения характеризовалось отсутствием или слабой конъюнктивальной инъекцией, умеренной инфильтрацией стекловидного тела в области введения суспензии, которые затем разрешились в течение 3 нед, и до момента моделирования ПВР явных клинических признаков воспаления не было. После проведения ретинальных проколов для моделирования ПВР в 5 наблюдениях из 7 в течение 3—4 сут сохранялась умеренная перикорнеальная инъекция. В заднем сегменте глаза сетчатка вокруг места проколов была локально отслоена, у краев разрывов и в стекловидном теле от места прокола в направлении заднего полюса распространялось белесое помутнение, к которому на 5—7-е сутки присоединились элементы инфильтрации. К 12—14-м суткам наличие умеренной экссудации в стекловидном теле позволило квалифицировать поражение как витреит. На 19—24-е сутки наблюдения при сканировании в В-режиме за увеличенным и неоднородным хрусталиком на фоне прилежащих утолщенных оболочек в стекловидном теле присутствовали подвижные эхоплотные мембранные структуры, ориентированные тангенциально (пролиферативные тяжи, шварты). Совокупность изменений была расценена как ПВР на фоне инфекционно-воспалительного процесса. На 27—50-е сутки в 4 из 5 наблюдений тяжелого поражения при ультразвуковом исследовании были выявлены признаки отслойки сетчатки по типу воронкообразной с сокращением ее в сторону задней поверхности хрусталика и уменьшением в объеме стекловидного тела, при этом под отслоенной сетчаткой определяли признаки экссудативной жидкости. Выраженность инфекционно-воспалительного процесса в структурах глаза начала уменьшаться с 35—40-х суток после моделирования ПВР во всех наблюдениях.

В 2 случаях клиническая картина носила слабовыраженный воспалительный характер в форме хориоретинита без отслойки сетчатки.

В группе контроля при интравитреальном введении транспортной среды признаков воспаления не наблюдали. При дальнейшем моделировании ПВР умеренная перикорнеальная инъекция сохранялась в течение 2—3 сут, в заднем сегменте в месте проколов сетчатка была локально отслоенной, а в стекловидном теле над ней при офтальмоскопии визуализировалась взвесь плавающих помутнений. В 2 случаях в стекловидном теле на 14—40-е сутки начал формироваться подвижный волокнистый тяж, ориентированный к месту проколов в сетчатке. При дальнейшем наблюдении он уменьшился, стекловидное тело стало более прозрачным, сетчатка прилежала.

В целом пролиферативный процесс в опытной группе имел значимо более тяжелое течение (p<0,01; рис. 2).

Морфологическая характеристика выявленных изменений. У инфицированного животного с минимальными клиническими проявлениями (не включенного в опытную группу) были выявлены слабая лимфоцитарная инфильтрация преретинального витреума, а также единичные элементы лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации сетчатки без выраженных очаговых изменений (рис. 3). При иммуногистохимической окраске хламидийные включения были определены как во внутренних, так и наружных слоях сетчатки, а также в клеточных элементах у основания стекловидного тела. Плотность включений варьировала, не превышая 10—13 в поле зрения микроскопа.

Опытная группа (рис. 4). В опытной группе в структурах переднего сегмента глаза выявлена инфильтративная реакция в глазах, энуклеированных на 7-й неделе наблюдения. Морфологически основные изменения в глазах с клиническими проявлениями локализовались в заднем сегменте глаза, где в стекловидном теле и на внутренней поверхности отслоенной сетчатки визуализировались пролиферативные мембраны. В пролиферативной ткани присутствовали лимфоциты, макрофаги, фибробласты, клетки ПЭС и глии сетчатки, при этом отмечалась адсорбция клеток ПЭС, а также макрофагов и лимфоцитов на внутренней пограничной мембране сетчатки. В заднем сегменте глаза находили множественные очаги пролиферации, под которыми выявляли зоны разрушения внутренней пограничной мембраны, пролиферацию клеток ПЭС, приобретавших веретеновидную форму с гранулами пигмента в цитоплазме. Встречались очаги ПВР, где в участках клеточной пролиферации определяли волокнистые структуры, тяжи и шварты. В сетчатке, диффузно инфильтрированной лимфоцитами и макрофагами (особенно около диска зрительного нерва и в области сосудов), выявили нарушение гистоархитектоники с нарушением целостности внутренней и наружной пограничных мембран, изменением хода опорных волокон клеток Мюллера, пикноморфные изменения ядер наружного и внутреннего ядерного слоя, слоя фоторецепторов с формированием «фолдинга». Во внутренних слоях сетчатки также были выявлены элементы глиоза, особенно в местах сохранившегося витреоретинального контакта, что в целом отражало течение пролиферативного процесса. На участках отслоенной сетчатки наблюдали атрофию ПЭС, а в субретинальном пространстве — эозинофильный экссудат и лимфоцитарную инфильтрацию. В хориоидее на фоне полнокровия сосудов присутствовала обильная инфильтрация лимфоцитарными элементами.

Хламидийные включения в опытной группе методом ПИФ идентифицированы как во внутренних слоях сетчатки, так и в участках с пролиферативной тканью (см. рис. 4, г). При этом в стекловидном теле включения преобладали в участках пролиферации с макрофагами и лимфоцитами в составе пролифератов. Возбудителей выявили во всех наблюдениях опытной группы в форме крупных внутриклеточных образований (ретикулярные тельца), расположенных рядом с ядром, мелких внеклеточных образований (элементарные тельца), а также в форме внутриклеточных колоний. Распределение включений было неодинаковым, варьируя в препаратах от 1—2 до 15—20 в поле зрения микроскопа.

Группа контроля. В группе контроля в переднем сегменте глаза изменений выявлено не было. В стекловидном теле в области раневых каналов от ретинальных проколов наблюдали сформированные хориоретинальные рубцы с вовлечением преретинального слоя стекловидного тела. Вблизи внутренней поверхности сетчатки выявили слабую лимфоцитарно-макрофагальную инфильтрацию, уплотнение мембранных структур кортикальных слоев стекловидного тела и в 2 случаях — мигрировавшие в витреум клетки ПЭС с гранулами пигмента и фибробласты. В 2 случаях с клиническими признаками ПВР в единичных участках пролиферации основу пролифератов составили фибробластоподобные клетки, клетки ПЭС и макрофаги с незначительным присутствием лимфоцитов.

В эксперименте мы впервые исследовали возможность влияния субклинической интраокулярной хламидийной инфекции на развитие и течение ПВР. При этом для моделирования ПВР использовали прокол сетчатки иглой 19 G, воспроизводя открытую травму глаза с локальным нарушением целостности оболочек и выходом клеточных элементов в стекловидное тело. Риск последующего развития ПВР мы предполагали более низким, чем в стандартных моделях ПВР, поскольку проводили минимальное вмешательство и целенаправленно не вводили клеточные популяции с пролиферативным потенциалом (фибробластоподобные клетки), а в стекловидном теле оказались лишь немногочисленные клетки оболочек из места прокола и в опытной группе — возбудитель. В итоге на фоне минимальной травмы развивалась различная по тяжести пролиферативная реакция.

Наблюдаемая в эксперименте клиническая и морфологическая картина, с одной стороны, может быть отнесена к инфекционно-воспалительному процессу в стекловидном теле и оболочках по типу увеита или хронического эндофтальмита, поскольку в стекловидном теле, мембранах, швартах и слоях сетчатки уже присутствовал инфекционный агент, с другой стороны, незначительная выраженность экссудативной реакции и преобладание пролиферативной стадии не позволяют говорить о классическом варианте увеита или эндофтальмита. При этом травма, используемая для моделирования ПВР, сама по себе запускает механизмы репаративного воспаления, в то же время активизируя субклинически протекающее хроническое инфекционное воспаление в заднем сегменте глаза. Происходит своего рода взаимное отягощение на первом этапе, затем обусловленное травмой воспаление завершается, а инфекционно-воспалительный процесс продолжается, длительно поддерживая и стимулируя пролиферацию.

В целом в патогенезе воспалительных процессов при ПВР и при увеитах уже отмечены сходные механизмы. В частности, при ПВР в субретинальной жидкости идентифицированы нейтрофилы и Т-лимфоциты, а также показана продукция провоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-6, ФНО-α, хемокинов, например CCL2, CCL11, CXCL8, CXCL9 и CXCL10, стимулирующих хемотаксис иммунных клеток в очаг воспаления [12—14]. Увеиты также могут сопровождаться субретинальной инфильтрацией и пролиферацией с воспалительными клетками в составе пролиферата, а спектр продуцируемых регуляторных цитокинов, хемокинов и ростовых факторов сходен с таковым при отслойках сетчатки и ПВР [15, 16]. Таким образом, ПВР может являться вариантом заднего вялотекущего увеита, одним из этиологических факторов которого является повреждение витреоретинальных структур, а другим — наличие скрытых дремлющих инфекций в структурах заднего сегмента глаза. И если значение факторов повреждения достаточно изучено, то о возможном инфекционно-обусловленном развитии ПВР в данной работе сообщается впервые.

Имеются данные о более высоком риске ПВР при наличии экстраокулярных очагов хронических инфекций, при этом хроническое воспаление, в том числе вызванное инфекцией, до манифестации ПВР обусловливает «готовность» внутриглазных структур к пролиферативному процессу, что показано ранее в экспериментах [18, 19]. В таком случае наличие слабо выраженного хронического инфекционно-воспалительного процесса в заднем сегменте глаза (т.е. субклинический увеит) хламидийной этиологии также может служить индуктором ПВР. С этим согласуются результаты эксперимента, когда в случае травмы (проколов сетчатки) без ранее введенной инфекции раневой процесс завершался рубцеванием в пределах оболочек без выраженного включения в процессы пролиферации стекловидного тела. В то же время в опытной группе на фоне присутствия инфекции в пролиферативные процессы вовлекалось стекловидное тело с развитием выраженной ПВР. Сходный вариант течения воспалительного процесса имеет место при персистирующих хламидийных инфекциях различных локализаций, когда инфекционно-обусловленное воспаление протекает преимущественно в пролиферативной форме, обусловливая ремоделирование и фиброз тканей (например, при трахоме, заболеваниях суставов, урогенитальной патологии) [20—23]. В целом как при ПВР, так и при хламидийных инфекциях рубцевание играет важную роль в патогенезе поражения [1, 24].

Тяжелое течение воспалительного процесса при ранее произведенном введении возбудителей хламидийной инфекции в эксперименте позволяет говорить о возможном отягощении ПВР у пациентов с наличием персистирующих инфекций в заднем сегменте глаза (не только хламидийной, но и, возможно, других возбудителей вирусных и бактериальных инфекций с аналогичными хламидиям свойствами вызывать субклиническое воспаление и способностью к персистенции). Также можно предположить, что наличие инфекции C. trachomatis стимулирует ПВР при травматических и, вероятно, при регматогенных отслойках сетчатки. Антигенная стимуляция в таком случае потенцирует воспаление, а возбудитель, будучи поглощенным макрофагами, не элиминируется [24]. С другой стороны, в условиях травмы глаза возможна контаминация различными возбудителями с развитием инфекционно-воспалительного процесса. В случае хирургических вмешательств контаминация операционной раны минимальна и на первое место выходят скрытые инфекционные агенты (вирусные, бактериальные), локализованные в заднем сегменте глаза.

Ранее показано, что у 80% пациентов с регматогенной отслойкой сетчатки в СРЖ выявляется антигенный материал C. trachomatis, но частота развития ПВР не превышает 17,3% [3, 11]. То есть наличие инфекции не в каждом случае может обусловливать развитие ПВР, что также отмечается в результатах эксперимента, когда тяжесть пролиферативного процесса варьировала от незначительной до тяжелой. Можно также предположить, что реактивация хламидийной инфекции может зависеть не только от наличия воспаления, обусловленного нарушением целостности оболочек глаза, но и от особенностей взаимодействия возбудителей с иммунной системой организма.

Таким образом, хотя хламидийная инфекция сама по себе может не являться причиной развития ПВР, но как и травматическое повреждение тканей может выступать активным стимулятором пролиферативных процессов в заднем сегменте глаза и значимым фактором риска ПВР.

Инфекция C. trachomatis в случае ее локализации в заднем сегменте глаза способна стимулировать ПВР за счет хронического инфекционно-воспалительного процесса.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Э.Б., А.П.

Сбор и обработка материала: А.С., Д.М., И.Н.

Статистическая обработка: Д.М.

Написание текста: А.С.

Редактирование: Э.Б.

Конфликт интересов отсутствует.