Роговица является наиболее иннервируемой тканью в организме человека, в которой на 1 мм2 поверхности приходится 7000 ноцицепторов [1—3]. Анатомия и физиология роговичных нервов привлекают внимание ученых еще с момента открытия этих нервов в зоне лимба Шлеммом в 1831 г. [4]. В последнее время возрос интерес к особенностям строения нервов роговицы в связи с их важной ролью в процессе поддержания нормального состояния глазной поверхности, а также — с возможностью использования в качестве доступного диагностического метода изучения нервов при полинейропатии, связанной с развитием сахарного диабета [4]. Несмотря на то что число публикаций, посвященных данной проблеме, весьма велико, большинство вопросов, касающихся строения и физиологии нервов роговицы, остаются неясными.
Как известно, большинство нервов роговицы представлены чувствительными волокнами, берущими свое начало от глазной ветви тройничного нерва, — длинными цилиарными нервами [5]. В передней части стромы роговицы из кольцевидного нервного сплетения в области лимба ветви нервов расходятся, теряя миелиновую оболочку и формируя субэпителиальное нервное сплетение. При этом ход нервных волокон ориентирован параллельно коллагеновым фибриллам стромы, а общее направление нервов на поверхности глаза в общем можно определить как радиальное [2]. Далее аксоны, лишенные шванновских клеток, выходят из этого сплетения через мембрану Боумена и формируют сначала суббазальное, а затем интраэпителиальное нервные сплетения [1]. Безмиелиновые нервные волокна (С-волокна) являются более тонкими (их диаметр составляет в среднем от 0,2 до 2 мкм) по сравнению с миелиновыми, А — волокнами, диаметр которых изменяется в диапазоне 1—5 мкм. Данные нервные С-волокна известны как ноцицепторы, отвечающие за чувствительность к болевым и температурным стимулам, рассмотреть их удается только при использовании специальной аппаратуры.
Более толстые миелиновые волокна бывают частой находкой при офтальмоскопии роговицы, имея при этом вид тонких ветвящихся белесоватых нитей, исходящих из области лимба. Для их выявления необходимо пользоваться широким углом биомикроскопии, при этом в глубоких слоях стромы нервы обычно не видны. Каждое нервное волокно имеет радиальное направление и лежит в одном слое роговицы. По мере удаления от лимба нервные стволы постепенно истончаются. Многие из них дихотомически, а иногда и трихотомически ветвятся под острым углом. Нервные стволы в отличие от сосудов никогда не анастомозируют. На месте разветвлений некоторых стволов бывают видны скопления нервного вещества в виде нежных перепонок или узелков [6].
Выявлено, что ход нервных стволов суббазального нервного сплетения ориентирован сначала в направлении 9—3 часов, затем после бифуркации волокон занимает направление 12—3 часов и, наконец, после последней бифуркации снова занимает положение 9—3 часов и не зависит от уровня локализации нервного ствола в роговой оболочке. Таким образом, ход этих нервов имеет радиальное (височно-назальное) направление [3].
Иннервация роговицы осуществляется также за счет ветвей симпатической нервной системы, берущих свое начало из шейного ганглия, и парасимпатической нервной системы, ветви которой начинаются из цилиарного ганглия [7]. Однако последнее утверждение, справедливое для роговиц кроликов и кошек, на данный момент не до конца изучено на человеческом глазу.
Биохимический состав нервов роговицы весьма разнообразен. Так, роговичными чувствительными нервами в окружающее пространство экспрессируется большое число биологически активных нейрохимических веществ. В составе некоторых нервных волокон обнаруживается преимущественно субстанция Р (SP) и/или кальцитонин ген-связанный пептид CGRP [8], а также гипофизарный аденилатциклазаактивирующий пептид (PACAP) и нейропептид со сложной структурой, схожей с вазоактивным интестинальным пептидом (VIP) [9]. Некоторыми нервами осуществляется экспрессия галанина [10], в связи с чем очевидно предположить, что нервы, отвечающие за экспрессию галанина или SP и CGRP, будут отличаться друг от друга.
С определенной долей вероятности можно утверждать, что ряд чувствительных нервов роговицы вообще не осуществляет экспрессию нейропептидов. Большинство из таких непептидергических нервов выделяют глюкоконъюгат, связывающий изолектин I-B4, и содержат в своем составе нейронспецифический фосфатазный энзим — фторидустойчивую кислую фосфатазу [11]. Ученым еще предстоит выяснить, влияет ли наличие свойств пептидергичности (способности экспрессировать нейропептиды) на электрофизиологические свойства и трофические функции чувствительных волокон роговичных нервов.
Большинство роговичных нервов, обладающих симпатической иннервацией, имеют в своем составе норадреналин, серотонин и/или нейропептид Y (NPY). Биохимический состав парасимпатических нервов представлен вазоактивным интестинальным пептидом (VIP), мет-энкефалином (опиодный фактор роста), нейропептидом Y (NPY), а также галанином [12].
При использовании иммуногистохимических и радиоиммунологических методов диагностики ученым удалось выделить в составе нервных волокон роговицы, помимо перечисленных выше нейропептидов, холецистокинин, мозговой натрийуретический пептид, вазопрессин, нейротензин и бета-эндорфин [13]. Однако процентное соотношение и количество экспрессируемых нейропептидов, а также место их локализации на уровнях чувствительных или двигательных волокон остается до сих пор неизвестным. В целом на сегодняшний день известно о наличии 17 разнообразных нейропептидов и нейротрансмиттеров, входящих в состав роговичных нервов.
В исследованиях на крысах была предпринята попытка обнаружения зависимости изменений нейропептидного состава нервов роговицы от стадии развития сахарного диабета [14]. Однако по результатом исследований значительной разницы в уровнях концентрации субстанции Р, кальцитонин ген-связанного пептида и вазоактивного интестинального пептида у крыс контрольной группы и группы с индуцированным диабетом выявлено не было. При этом отмечено, что уровень вышеуказанных нейропептидов, измеряемых в радужке, существенно вырос (с 38 до 256%) в группе крыс с сахарным диабетом.
С возрастом значительно уменьшается плотность нервных волокон, при этом происходит резкое снижение числа центральных эпителиальных нервных терминалей, а также значительное увеличение наличия нервных фибрилл неправильной формы, расположенных под базальным слоем роговицы [4]. В настоящем обзоре представлены данные, касающиеся методов исследования нервов роговицы, и возможности оценки состояния нервов роговицы в ранней диагностике диабетической полинейропатии.
Ранее в качестве методов изучения роговичных нервов использовали световую и электронную биомикроскопию, а также иммуногистохимические методы c применением «золотого хлорида» и ацетилхолинэстеразы, осуществляемые ex vivo на трупных роговичных препаратах [1, 3, 15, 16]. В последние годы в клинической практике используют новый неинвазивный метод прижизненной конфокальной биомикроскопии роговицы, при котором достаточно четко можно оценить состояние ее нервов [17—28].
В 1955 г. для визуализации клеток головного мозга аспирантом Гарвардского университета М. Минским (Minsky) был изобретен и опробован конфокальный микроскоп, однако доработать и применить метод непосредственно в офтальмологической практике удалось ученым Вилсону и Шеппарду (Wilson, Sheppard) в 1984 г. и Хиллу, Мастерсу и Таеру (Hill, Masters, Thaer) в 1994 г. [29] уже в качестве аппарата HRT со специальной роговичной насадкой.
Бесконтактный конфокальный принцип исследования основан по типу работы обычного микроскопа, с той лишь разницей, что в аппарате имеются условия совпадения апертуры осветителя и апертуры самого микроскопа. Местоположение апертуры, оптически сопряженное с фокусом, как раз отражено в термине «конфокальный».
Конфокальный микроскоп создает четкое изображение образца, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Это достигается путем отрезания апертурой фонового света, идущего из глубины образца, т. е. того света, который не попадает на фокальную плоскость объектива микроскопа. В результате изображение получается с контрастом лучшим, чем в обычном оптическом микроскопе. Изображение представляет собой двумерную (2D) картину, во время проведения исследования в течение 14 с получается 350 снимков, которые сохраняются автоматически во встроенной базе данных.
Принцип действия HRT-аппарата основан на излучении лазерной системой когерентного света, проходящего сначала через одну апертуру, являющуюся сопряженной с фокальной плоскостью, а затем через второе отверстие (пинхол), расположенное в фотоумножителе. Лазерный луч, преломляемый дихроичным зеркалом, проходит вдоль образца в заданной фокальной плоскости. Вторичная флюоресценция, испускаемая из отдельных точек образца (в одинаковой фокальной плоскости), направляется к детектору (фотоумножителю) через это же дихроичное зеркало и фокусируется как конфокальная точка. При этом система устраняет свет от всех участков образца, кроме находящегося в фокальной плоскости [30].
Однако и метод конфокальной биомикроскопии не лишен недостатков, к которым, в частности, можно отнести: 1) маленький размер исследуемой зоны, составляющий 440×330 мкм, с толщиной слоя сканирования в 5 мкм, что, в свою очередь, ведет к недостаточной информативности; 2) проведение исследования только по одной из осей координат (6—12 часов) и только строго от верхушки роговицы, в то время как ход нервных волокон ориентирован по меридиану 9—3 часа [31, 32]; 3) невозможность визуализации нервных ветвей и терминалей размером менее 0,5 мкм в диаметре. Последнее утверждение справедливо и для более современного HRT-аппарата (Heidelberg Retina Tomograph с использованием специальной роговичной насадки Rostock Cornea Module) [4].
Конфокальная биомикроскопия дает возможность в режиме реального времени без предварительной подготовки визуализировать нервные сплетения. При этом в норме можно обнаружить длинные, параллельно идущие тяжи или пучки нервов, хорошо контрастирующие на фоне непрозрачного темного фона [33—35]. В качестве критериев оценки нервов роговицы можно использовать такие показатели, как общее число, распределение в толще роговицы, расстояние между близлежащими нервными стволами, диаметр и расстояние до поверхности глаза [1]. Нашими учеными-офтальмологами в качестве оценочных критериев были предложены плотность, ширина, извилистость, рефлективность, ориентация и ветвление [36].
Ученым из Австралии Натаном Эфроном (Nathan Efron) была выдвинута гипотеза о возможности применения конфосканирующего микроскопа в оценке состояния нервов роговицы у пациентов с сахарным диабетом. Опыт использования конфокальной микроскопии в Медицинской школе Университета Манчестера доктором Малик (R. Malik) [37, 38] (длительностью более 8 лет) доказал, что этот метод можно использовать в качестве ранней диагностики изменений в нервах роговицы, появляющихся при развитии диабетической полинейропатии. Ученому удалось выявить статистически значимую корреляцию между стадией развития диабетической полинейропатии и изменением в структуре нервов роговицы, а именно — коэффициентом извитости [37]. Примечательно, что в проводившемся исследовании не выявлено значимых изменений в нервах роговицы в зависимости от возраста, «стажа заболевания» и уровня гликемии в крови.
В исследованиях было отмечено, что плотность корнеальных нервных волокон не изменяется у больных с сахарным диабетом без диабетической полинейропатии, тогда как при диабетической полинейропатии в зависимости от стадии тяжести заболевания отмечено уменьшение определяемого показателя на 22,5% — при асимптоматической стадии, на 32,5% — при симптоматической и на 62,5% — при стадии тяжелых осложнений [39]. Также сделано важное заключение о наличии статистически значимой корреляции между формой диабетической ретинопатии и морфологическими изменениями корнеальных нервов у больных с диабетической полинейропатией [39, 40]. Очевидно, что у пациентов с диабетической полинейропатией, перенесших какие-либо заболевания, затрагивающие роговую оболочку или после проведения оперативных вмешательств на глазу, восстановления чувствительности роговицы будет добиться сложнее, чем у пациентов без данной патологии [40].
Сахарный диабет является значимой медико-социальной проблемой, представляя собой одну из основных причин смертности и инвалидизации населения во всем мире [41, 42]. Так, каждый год фиксируется около 6 млн случаев заболеваемости этим неизлечимым недугом [42, 43]. По данным Международной федерации диабета, сахарным диабетом страдают более 250 млн человек в мире. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения, к 2025 г. число пациентов, страдающих сахарным диабетом, составит 7% населения планеты.
Диабетическая полинейропатия является самым частым и наиболее ранним хроническим осложнением сахарного диабета, в некоторых случаях возникающим еще до установления диагноза основного заболевания [43]. Эпидемиологические исследования показали, что вероятность диабетической нейропатии варьирует от 5 до 100% [44]. Столь большая вариабельность данных объясняется использованием диагностических методов с разной степенью их специфичности и чувствительности, а также отсутствием согласованных и стандартизованных критериев диагностики. Диабетическая нейропатия (полинейропатия) наряду с ангиопатией нижних конечностей играет ведущую роль в процессе развития «диабетической стопы» (дистальная диабетическая полинейропатия) — грозного и опасного осложнения, нередко приводящего к ампутации нижней конечности [45, 46]. Выявлено, что от 40 до 70% всех нетравматических ампутаций стоп проводят пациентам, страдающим сахарным диабетом, поэтому очень важна ранняя диагностика диабетической полинейропатии, а также своевременное начало проведения необходимого лечения [47].
Клинически дистальная диабетическая полинейропатия определяется наличием признаков нарушения функции периферических нервов у больных сахарным диабетом. Поражение периферической нервной системы обусловлено комплексом метаболических и сосудистых нарушений. При дистальной диабетической полинейропатии имеет место поражение сосудов, питающих нервные волокна, а именно — поражение сосудов микроциркуляторного русла (vasae nervorum, vasae vasorum) [48]. Для диагностики диабетической нейропатии используется ряд методик с помощью теста с монофиламентами, неврологического и электрофизиологического исследования [49]. Однако все эти методы позволяют оценить поражения крупных, А — нервных волокон, тогда как при дистальной диабетической полинейропатии повреждаются в первую очередь мелкие С-волокна. Вклад субъективного компонента в оценке результатов исследования диабетической полинейропатии слишком велик. В ряде исследований, проводимых под руководством доктора Malik, было показано, что в тестах, осуществляемых для проверки болевой и температурной чувствительности, весьма сложно определить точную принадлежность нервных волокон к тонким миелиновым или безмиелиновым [50].
Разрушение мелких волокон можно выявить при биопсии кожи, поэтому данный метод является наиболее информативным для ранней диагностики полинейропатии. Однако, как уже было отмечено ранее, в качестве альтернативы возможно применение неинвазивного метода ранней диагностики — конфокальной биомикроскопии роговицы. Использование метода конфокальной биомикроскопии роговицы позволяет определить поражение периферической нервной системы при нарушениях углеводного обмена еще на доклинической стадии. Это особенно важно, так как эффективность медикаментозного лечения напрямую зависит от его своевременного начала [51, 52].
Учитывая важность и актуальность затронутой проблемы, необходимо ее дальнейшее изучение и развитие, а полученные данные нуждаются в детальном исследовании.