Груша Я.О.

НИИ глазных болезней РАМН, Москва

Федоров А.А.

Московский областной НИИ акушерства и гинекологии

Prause J.U.

Институт патологии глаза, Университет Копенгагена, Frederik V’s Vej 11, 1, Копенгаген, Дания, 2100

Шептулин В.А.

ФГБУ «НИИ глазных болезней» РАМН, Россолимо ул., 11, А, Б, Москва, Российская Федерация, 119021

Экспериментально-морфологическое исследование тканей век после введения геля гиалуроновой кислоты

Журнал: Вестник офтальмологии. 2015;131(1): 69-74

Просмотров : 116

Загрузок :

Как цитировать

Груша Я. О., Федоров А. А., Prause J. U., Шептулин В. А. Экспериментально-морфологическое исследование тканей век после введения геля гиалуроновой кислоты. Вестник офтальмологии. 2015;131(1):69-74.
Grusha Ia O, Fedorov A A, Prause J U, Sheptulin V A. Histopathological study of experimental intrapalpebral injection of hyaluronic acid gel. Vestnik Oftalmologii. 2015;131(1):69-74.
https://doi.org/10.17116/oftalma2015131169-74

Авторы:

Груша Я.О.

НИИ глазных болезней РАМН, Москва

Все авторы (4)

Гиалуроновая кислота является естественным полисахаридом, образованным N-ацетил-D-глюкозамином и D-глюкуроновой кислотой. Она является важным структурным элементом кожи, подкожной жировой клетчатки и соединительной ткани, одним из основных компонентов внутриклеточного матрикса, стекловидного тела и синовиальной жидкости. Гиалуроновая кислота обладает высокой гидрофильностью, что позволяет ей поддерживать необходимую гидратацию внутриклеточного матрикса. Кроме того, она обеспечивает необходимый объем тканей, а также их стабильность и эластичность [1, 2].

Сегодня гели на основе гиалуроновой кислоты (ГГК) успешно применяются в пластической хирургии и косметологии для коррекции морщин лба, в области углов глаза, контурной пластики формы губ, носогубных складок, при наличии эстетических дефектов, связанных с дефицитом мягких тканей после травм, ранений или оперативных вмешательств. Кроме того, ГГК известны и в других областях медицины, таких как оториноларингология (при несмыкании голосовых связок), урология (при недержании мочи) и ортопедия [3—5].

В последнее время появились сообщения о первом опыте применения данных гелей в качестве малоинвазивного метода лечения пациентов с такими патологическими состояниями, как паралитический лагофтальм, ретракция нижнего века и аномалии расположения век, энофтальм. Возможности применения препарата были показаны в ряде клинических исследований [6—8]. Нами впервые было описано применение данных препаратов у пациентов с эндокринной офтальмопатией [9]. У пациентов с паралитическим лагофтальмом инъекция ГГК стала эффективной нехирургической тактикой и успешно применялась наряду с оперативным лечением [9].

Производители отмечают сохранение эффекта инъекции в среднем до 6 мес [10, 11]. Однако нами было отмечено, что у некоторых пациентов при введении препарата в верхнее веко происходит не полное исчезновение его депо. Это позволило предположить наличие некоторых морфологических особенностей при интрапальпебральном его введении. В литературе были описаны случаи длительного сохранения препарата ГГК в периорбитальной области, однако в них отсутствовали данные гистологического исследования [12—14]. На основе анализа литературных данных и результатов проведенных нами морфологических исследований можно констатировать значительное сходство структур век кролика и человека, в связи с чем проведение данного исследования на модели кролика представляется обоснованным [15—17].

Цель — оценить морфологические особенности биодеградации ГГК после его введения в верхнее веко.

Материал и методы

В пилотное проспективное несравнительное исследование были включены 7 кроликов (14 глаз) породы шиншилла (средний возраст 1,5 года, средняя масса 4 кг). Каждый кролик содержался в индивидуальной стальной клетке под контролем сотрудника вивария. Все манипуляции были одобрены локальным этическим комитетом ФГБУ «НИИ глазных болезней» РАМН. Шерсть, покрывающая верхнее веко, была удалена ножницами (рис. 1, а). Каждому кролику под местной анестезией была выполнена однократная инъекция 0,1 мл ГГК (Restylane, «Q-Med AB», Швеция) подкожно с помощью иглы 27G в центральную область верхних век.

Рис. 1. Техника инъекции ГГК в верхнее веко экспериментального животного. а — подкожно формируется депо препарата, контурирование которого маркировано чернилами; б — контурирование депо измеряется линейкой.

Restylane (Рестилайн) является стабилизированной гиалуроновой кислотой неживотного происхождения (NASHA), представляет собой 2% вязкоэластический, прозрачный, нерастворимый в воде гель с концентрацией гиалуроновой кислоты 20 мг/мл. Размер частиц геля в 1 мл препарата составляет 400 мкм, что делает использование данного препарата предпочтительным в сравнении с гелями на основе гиалуроновой кислоты животного происхождения. Применение препарата было одобрено U.S. Food and Drug Administration в 2003 г., регистрационное удостоверение РФ ФС № 2006/1113 [10].

Контурирование кожи после инъекции измеряли с помощью линейки (Geuder) (см. рис. 1, б). Животные были выведены из эксперимента сразу после инъекции, а также через 2 нед, 1, 2, 4, 6 и 9 мес, каждое животное в соответствующий срок. Образцы удаленных верхних век в растянутом виде фиксировали в течение 24 ч в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали и заключали в парафин. Срезы толщиной 4,5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (H&E), альциановым синим без MgCl2 (Ab) (окраска на несульфатированные гликозаминогликаны) и с 0,8 моль MgCl2 (Ab 0,8 моль) (окраска на сульфатированные гликозаминогликаны), реактивом Шиффа (P.A.S.) и гематоксилином, флоксином, шафраном (HPS), после чего исследовали на фотомикроскопе Leica DM2500 («Leica», Германия). Морфометрический анализ проводили с помощью программного обеспечения Leica Imaging Software («Leica», Германия) и учитывали 20 случайно выбранных параметров: толщину коллагеновых волокон, площадь и периметр структуры депо введенного препарата, диаметр и фактор формы (соответствие форме окружности (1,0)). Полученные среднеарифметические данные плюс/минус стандартное отклонение (δ) были нормально распределены и обработаны статистически с помощью SPSS версии 13,0; значения p<0,05 принимались за достоверные. Для оценки достоверности изменений был использован коэффициент корреляции Пирсона.

Результаты и обсуждение

Морфологические данные. На протяжении всего периода наблюдения введенный ГГК располагался в «ячеистой» структуре и окрашивался базофильно с помощью H&E (рис. 2, а; 3, a), слабоположительно при P.A.S реакции и в значительной степени в синий цвет при окраске Ab (см. рис. 3, б, в), но не визуализировался с помощью Ab 0,8 моль.

Рис. 2. Морфологическая картина поперечного среза удаленных образцов век кролика через 2 мес после инъекции ГГК. а — ячеистая структура депо ГГК (звездочка, H&E, шкала 1000 мкм); б — структура депо препарата под большим увеличением. Видимая граница псевдокапсулы, окружающей депо (звездочка, H&E, шкала 500 мкм); в — ячейки депо ГГК, окруженные коллагеновыми волокнами (звездочка, H&E, шкала 100 мкм). Полное отсутствие воспалительной реакции.

Рис. 3. Морфологическая картина депо ГГК при различной окраске на выбранных сроках наблюдения. 1 — 0 нед, 2 — 2 нед, 3 — 1 мес, 4 — 2 мес, 5 — 4 мес, 6 — 6 мес, 7 — 9 мес; а — депо ГГК, окраска H&E, шкала 400 мкм; б — депо ГГК, окраска реактивом Шиффа, шкала 100 мкм; в — депо ГГК, окраска альциановым синим позволяет дифференцированно визуализировать ГГК в синем цвете. Резкое сокращение количества ГГК может быть артефактом вследствие подготовки гистологического препарата, так как плотность ГГК остается практически неизменной вплоть до 9-го месяца наблюдения, шкала 100 мкм; г — структура депо ГГК, окраска HPS, коллаген окрашивается в темно-желтый цвет. Незначительное количество гигантских клеток на границе ГГК на поздних сроках введения, видимое утолщение периферических перегородок, шкала 100 мкм.

Сразу после инъекции введенный препарат располагался в субдермальном пространстве в виде островков неравномерной формы и размеров, ограниченных светлыми пространствами, и не имел четких границ с окружающими тканями. Воспалительные клеточные реакции со стороны окружающих тканей и в месте контакта с препаратом отсутствовали (см. рис. 3: 1, a—г).

Через 2 нед после инъекции приграничные ткани формируют соединительнотканные отростки в сторону депо. Эти врастания, соединяясь между собой, образуют ячейки меньших размеров на периферии и более крупных — ближе к центру. Признаки воспалительной реакции отсутствуют (см. рис. 3: 2, a—г).

Через 1 мес после инъекции ячеистая структура депо ГГК сохранена. В периферических отделах, в толще перегородок видны капилляры и фибробласты. Увеличение их толщины способствует образованию псевдокапсулы (см. рис. 3: 3, a). Наблюдается деление фибробластов и рост «дочерних». Перегородки между ячейками с заключенным в них ГГК наряду с псевдокапсулой окрашиваются в желтый цвет HPS (см. рис. 3: 3, г).

Через 2 мес после инъекции отмечается нерегулярное утолщение псевдокапсулы и периферических перегородок в связи с процессами неоколлагеногенеза. В то же время в центральной области отмечаются их истончение и разрывы, что способствует увеличению центральных ячеек депо (см. рис. 3:4, в, г). Четкие признаки биодеградации ГГК и его замещение оптически-прозрачной жидкостью не подтверждаются, так как отсутствуют изменения плотности препарата при окраске Ab (см. рис. 3: 4, г).

Через 4 мес утолщение псевдокапсулы сохраняется (см. рис. 3: 5, a), ГГК обнаруживается в практически неизмененном виде (см. рис. 3: 5, в). Тенденция к укрупнению центральных ячеек за счет истончения и разрывов соединительнотканных перегородок сохранена, толщина периферических перегородок увеличивается вследствие неоколлагеногенеза, однако по-прежнему без признаков воспаления (см. рис. 3: 5, a—г).

Через 6 мес псевдокапсула, окружающая депо, практически не изменилась в толщине (см. рис. 3: 6, a). Ячеистая структура неправильной формы, большего размера в центральной области депо по сравнению с таковым на предыдущем сроке наблюдения, однако плотность ГГК в большей степени остается неизменной при окраске Ab (см. рис 3: 6, в).

Через 9 мес наблюдаются уменьшение плотности ГГК и четко видимые оптически прозрачные пространства (см. рис. 3: 7, а). В центральной области депо отмечается слияние большей части ячеек с формированием больших «каверн», частично заполненных ГГК (см. рис. 3: 7, в). В перегородках, ограничивающих пространства с ГГК, выявляются отдельные гигантские клетки и гистиоциты, однако другие признаки воспаления отсутствуют (см. рис. 3: 7, г). На периферии депо толщина псевдокапсулы остается неизменной по сравнению с таковой на предыдущем сроке наблюдения.

Морфометрические данные. На поздних сроках наблюдения нами было отмечено, что коллагеновые волокна, ограничивающие ячейки на периферии депо, значительно утолщаются (с 26±7,4 до 91,8±30,2 мкм; p=0,02, r=0,965), в то время как в центральной области сначала незначительно утолщаются, однако со 2-го месяца наблюдения происходит их истончение с последующим разрывом некоторых из них (с 18,5±6,73 до 32,9±13 и затем до 23,2±10,2 мкм; p=0,02, r=0,040) (табл. 1). Мы также обращаем внимание на тенденцию к компенсаторному расширению центральных областей депо с увеличением среднего диаметра ячеек структуры (с 71,4±38,6∙103 до 177±103∙103 мкм2 (p=0,03, r=0,910) и с 291±77,5 до 457±127 мкм (r=0,891) соответственно); однако периферические отделы уменьшаются незначительно и остаются стабильными в течение всего срока исследования (с 45,1±22,7∙103 до 37,9±11,5∙103 мкм (p=0,03, r=0,659) и с 234±52,9 до 217±34,1 мкм; r=–0,547) (табл. 2). Фактор формы в центральных отделах достоверно увеличивался (с 1,25±0,11 до 1,36±0,11; p<0,05, r=0,945), в то время как на периферии незначительно уменьшался (с 1,31±0,11 до 1,27±0,08; p<0,05, r=–0,734).

Таблица 1. Морфометрическая оценка толщины коллагеновых волокон (в мкм) в периферической и центральной области депо ГГК (n=20)

Таблица 2. Морфометрическая оценка параметров «ячеистой» структуры депо ГГК (в мкм) в периферической (П) и центральной (Ц) области (n=20) Продолжение таблицы 2 Примечание. Dav. — средний диаметр ячеек; Fform — фактор формы.

Отмечена сильная положительная корреляция толщины коллагеновых волокон в периферических отделах депо ГГК и периметра центральных областей депо препарата (r=0,943; p<0,05). Также мы заметили выраженную положительную корреляцию между толщиной периферических перегородок депо и изменением минимального (r=0,886; p<0,05) и максимального (r=0,942; p<0,05) диаметра центральных ячеек. С другой стороны, мы наблюдали сильную отрицательную корреляцию между толщиной перегородок в центральной части и изменением периметра центральных отделов депо наряду с изменениями минимального и максимального диаметра ячеек этой области (r=–0,943, r=–0,886, r=–0,942 соответственно; p<0,05). Площадь центральных отделов ячеистой структуры находилась в сильной отрицательной корреляции с вышеуказанными тремя показателями (r=–0,943, r=–0,886, r=–0,942 соответственно; p<0,05).

ГГК, введенный подкожно в веко кролику, сохранялся на протяжении 9 мес наблюдения. Отмечалась лишь частичная его биодеградация в пределах его депо с ячеистой структурой, образованной коллагеновыми перегородками, и выраженной соединительнотканной псевдокапсулой на периферии депо. Данные изменения четко прослеживались, так как ГГК визуализировался при окраске с помощью Ab, в то время как коллаген окрашивался желтым с помощью HPS. Комбинация красителей Ab и HPS в данном случае являлась предпочтительной по сравнению с окраской по Массону. Замедленная деградация ГГК, по-видимому, связана с поздним появлением гистиоцитов и образованием псевдокапсулы. Это подтверждает ранее описанную способность к стимуляции локального неоколлагеногенеза [18].

Однако к 6-му месяцу процесс пролиферации фибробластов прекращается. По данным гистологического исследования и морфометрического анализа, соединительнотканные перегородки на периферии утолщались, в то время как в центральных отделах отмечались их истончение и разрывы, что способствовало увеличению центральных ячеек депо. Этот факт также подтверждает уменьшение фактора формы наряду с увеличением минимального (Dmin) и максимального (Dmax) диаметра центральных ячеек. Увеличение фактора формы и уменьшение минимального и максимального диаметра периферических ячеек недостоверно подтверждают сокращение псевдокапсулы, окружающей депо ГГК (см. табл. 2).

Мы обнаружили, что, хотя к 9-му месяцу наблюдения отмечалась частичная биодеградация ГГК, непосредственная плотность препарата была практически неизменна, что свидетельствует о сниженной ферментативной активности. Мы предполагаем, что депо ГГК сохраняло большую часть своего объема вследствие сохранения псевдокапсулы и низкой активности гиалуронидазы. Это также может быть связано с практически полным отсутствием воспаления. Наши предварительные результаты экспериментального исследования могут объяснять клинически наблюдаемый длительный эффект инъекции и сохранение контурирования века у пациентов с паралитическим лагофтальмом даже через 12 мес после введения ГГК. Однако для подтверждения полученных данных необходимо проведение более длительного исследования с оценкой их корреляции с клиническими результатами.

Заключение

1. ГГК, введенный подкожно в верхнее веко экспериментального животного, заключен в депо, представляющее собой «ячеистую» структуру с пространствами различной формы и диаметра. Депо окружено псевдокапсулой и содержит соединительнотканные перегородки различной толщины.

2. В течение 9 мес происходит частичная биодеградация ГГК, проявляющаяся в уменьшении его объема, однако не является полной.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Я.Г. , В.Ш., А.Ф.

Сбор и обработка материала: В.Ш., А.Ф., J.Р.

Статистическая обработка данных: В.Ш.

Написание текста: А.Ф., J.Р., В.Ш.

Редактирование: Я.Г. , А.Ф.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail