Киселева Т.Н.

отделение ультразвука ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца», Москва, Россия

Чудин А.В.

ФГБУ "Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца" Минздрава России

Рамазанова К.А.

ФГБУ "Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца" Минздрава России

Методы исследования микроциркуляции глаза у экспериментальных животных

Журнал: Вестник офтальмологии. 2014;130(5): 100-103

Просмотров : 135

Загрузок : 6

Как цитировать

Киселева Т. Н., Чудин А. В., Рамазанова К. А. Методы исследования микроциркуляции глаза у экспериментальных животных. Вестник офтальмологии. 2014;130(5):100-103.
Kiseleva T N, Chudin A V, Ramazanova K A. Methods of ocular microcirculation assessment in experimental animals. Vestnik Oftalmologii. 2014;130(5):100-103.

Авторы:

Киселева Т.Н.

отделение ультразвука ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца», Москва, Россия

Все авторы (3)

В настоящее время существует широкий спектр методов исследования кровотока в сосудах глаза. Изучение состояния гемодинамики глаза в эксперименте необходимо для более детального понимания патогенеза сосудистых заболеваний сетчатки и зрительного нерва, оценки влияния различных препаратов и методов лечения на кровоток глаза.

Одним из наиболее распространенных методов для оценки микроциркуляции у экспериментальных животных является флюоресцентная ангиография (ФАГ), которая нашла широкое применение в офтальмологии для исследования ретинальной циркуляции при диабетической ретинопатии, тромбозах центральной вены сетчатки и ее ветвей, дистрофических, сосудистых и онкологических заболеваний глаз. Метод применяется для определения участков повышенной сосудистой проницаемости, ишемии, дефектов пигментного эпителия, неоваскуляризации и других сосудистых нарушений в реальном времени, что позволяет оценить не только качество созданной модели, но и эффективность последующего лечения.

Модель оценки ретинального кровообращения на крысах является оптимальной для изучения ретинальной микроциркуляции, поскольку у других животных (кролики, морские свинки) ретинальные сосуды развиты слабо и кровоснабжение глаза осуществляется преимущественно из системы хориоидальных сосудов.

У крысы, как и у человека, отмечается преобладание ретинального кровотока, за счет которого осуществляется питание большей части сетчатки. Известно, что основная причина сосудистых заболеваний глаза - нарушение кровообращения в ретинальных сосудах, поэтому наилучшим объектом для моделирования ишемического поражения сетчатки является крыса.

Ряд авторов применяли ФАГ для изучения формирования лазериндуцированной хориоидальной неоваскулярной мембраны и оценки степени ликеджа сосудов [1]. C. Sun и соавт. [2] в модели ретинальной окклюзии ветви центральной вены сетчатки применяли ФАГ для оценки степени выраженности окклюзии сосудов. В ходе исследования авторами подтверждена эффективность системной терапии миноциклином в качестве нейропротектора, уменьшающего постишемическое воспаление и потерю ганглиозных клеток.

В работе на модели лазериндуцированной ишемии у кроликов Р.А. Гундорова и соавт. [3] использовали ФАГ для подтверждения степени ишемии сетчатки. В эксперименте через 20 мин и на 3-и сутки после индукции ишемии авторы наблюдали выраженную диффузию красителя из магистральных ретинальных сосудов, обусловленную значительным повреждением эндотелия. В модели ишемической оптической нейропатии, не связанной с артериитом у грызунов, H. Chuman и соавт. [4] отмечали дефект заполнения в сосудах хориоидеи и диска зрительного нерва (ДЗН) на ранних стадиях и гиперфлюоресценцию со значительным снижением числа перфузируемых капилляров на диске на поздних стадиях ангиографии.

R. Wang и соавт. [5] предложили модель передней ишемической нейропатии у крыс с использованием фотодинамического эффекта. После внутривенного введения деривата гематопорфирина и облучения сосудов криптоновым лазером 647 нм через 2 ч у животных развивалась ишемия переднего отдела зрительного нерва. С помощью ФАГ была установлена информативность разработанной модели ишемической нейропатии.

Сканирующая лазерная офтальмоскопия (СЛО) с красителями обеспечивает возможность регистрации изображения глазного дна в реальном времени при использовании низких уровней освещения. В сочетании с красителями (акридиновый оранжевый, ангиография с меченным флюоресцеином изотиоцианатом, флюоресцеином натрия, карбоксифлюоресцеином, индоцианином зеленым), методика позволяет регистрировать движение лейкоцитов на глазном дне in vivo и таким образом исследовать циркуляцию лейкоцитов при нарушении ретинального или хориоидального кровообращения.

В исследовании по количественному анализу динамики лейкоцитов в ретинальных сосудах у крыс N. Lu и соавт. [6] оценивали время полного восстановления скорости движения лейкоцитов в микрососудах после 5-минутной ишемии, вызванной клипированием зрительного нерва вместе с центральной веной сетчатки. Использование акридинового оранжевого в качестве красителя при лазерной офтальмоскопии позволило авторам определить скорость потока лейкоцитов в прекапиллярных артериолах, капиллярах и посткапиллярных венулах. Полное восстановление скорости наступало в течение 80 мин реперфузии, однако скорость потока лейкоцитов в артериолах отличалась от таковой в венулах. Несмотря на краткосрочность ишемии, восстановление скорости кровотока в капиллярах на 50% происходило через 5 мин.

Индоцианин-зеленая ангиография (ИЦЗА) - метод оценки хориоидального кровообращения. При проведении ИЦЗА краситель почти на 98% связывается с белками плазмы, что уменьшает его выход через фенестры капилляров сосудистой оболочки. Флюоресценция индоцианина происходит в длинноволновой зоне спектра (835 нм). Принцип этого метода аналогичен ФАГ и может проводиться одновременно с ней или последовательно. Методика в сочетании с СЛО используется в эксперименте у крыс для оценки динамики хориоидальной циркуляции. Визуализация гиперфлюоресцирующих точек (лейкоцитов) по ходу сосудов происходит через несколько минут после внутривенного введения индоцианин-зеленого (ИЦЗ). Для подсчета флюоресцирующих лейкоцитов используется компьютерный анализ изображений кадр за кадром. N. Matsuda и соавт. [7] предложили использовать методику для прижизненного подсчета лейкоцитов в хориоидальных сосудах. C. Lee и соавт. [8] в эксперименте на кошках использовали комбинацию ИЦЗА со СЛО и ФАГ для исследования эффекта аргонлазерного воздействия на хориоидальную циркуляцию. Подобное исследование с помощью сканирующего лазерного офтальмоскопа и ИЦЗ красителя было выполнено I. Takasu и соавт. [9] на обезьянах и пигментированных кроликах, при этом вводили не чистый краситель, а центрифугированные аутологичные лейкоциты, прокрашенные ИЦЗ.

Оборудование для ФАГ, ИЦЗА, СЛО включает лазерные сканирующие конфокальные офтальмоскопические системы с возможностью ретиноангиографии и томографии. В настоящее время для этих исследований широко используют гейдельбергский ретинальный ангиограф (HRA), комбинированную систему Spectralis HRA+OCT (Heidelberg), Topographic Scanning System (TOP SS) фирмы «Laser Diagnostic Technologies» (США), конфокальный лазерный офтальмоскоп Zeiss Humphrey Systems (Германия-США).

Лазерная допплеровская флоуметрия (ЛДФ) обеспечивает непрерывное измерение тканевой перфузии в относительно маленьком объеме материала. В 1972 г. Riva и соавт. провели первую лазерную допплерографию у животных и измерили скорость движения эритроцитов в ретинальных артериях кроликов.

Во время исследования сетчатка сканируется инфракрасным лазерным лучом, свет отражается или рассеивается от движущихся красных кровяных клеток (эритроцитов) с определением частоты отраженных сигналов (эффект Допплера). Флоуметры фиксируют изменения в допплеровском сдвиге частот локально с последующей количественной оценкой скорости кровотока в микроциркуляторном русле. Неподвижные структуры не подвергаются допплеровскому анализу сдвига частот. В перфузируемой ткани фотоны рассеиваются движущимися эритроцитами и статическими компонентами ткани, продуцируя целый ряд частотных сдвигов, создавая видимый пятнистый паттерн (speckle pattern). При столкновении фотонов с движущимися эритроцитами, проходящими через капилляры, происходит допплеровское смещение частот, пропорциональное вязкости крови и углу рассеивания света.

В настоящее время используют лазерные допплеровские флоуметры «Perimed» (Швеция), «Transonic Systems, Inc.» (США). Российский прибор, реализующий в себе возможность контактной ЛДФ и оптической тканевой оксиметрии, представлен в компьютеризированном анализаторе микроциркуляции крови ЛАКК-02, НПП «Лазма».

Техника ЛДФ чувствительна к внезапным изменениям тканевых структур и дает наиболее достоверные результаты при непрерывном одностороннем мониторировании (например, внезапное изменение перфузионного давления или оценка действия лекарственного препарата на циркуляцию). В лазерных допплеровских флоуметрах используются низкоэнергетические лазеры мощностью менее 2 мВ.

Ряд авторов изучали влияние лазерного света на сосудистую реактивность. А. Shepherd и соавт. [10] проводили исследования на изолированных мышцах мошонки хомячков, в которых артериолы подвергали действию света гелий-неонового лазера мощностью 10 мВ или инфракрасного диодного лазера мощностью 3 мВ. В обоих случаях диаметр сосудов не изменялся, что доказывает отсутствие влияния лазерного излучения на микроциркуляторное русло. Измерение кровотока в эксперименте осуществляется на глубине около 1 мм. Исследование состояния микрососудов на глубине менее 1 мм представляет значительные трудности из-за наслаивания сигналов от ДЗН, сетчатки и хориоидеи.

Остается дискутабельным вопрос о выборе экспериментальной модели для получения достоверных показателей гемодинамики в сосудах глаза. По мнению J. Kiel и H. Reitsamer, для исследования хориоидального кровотока подходят экспериментальные животные с аваскулярной фовеа (например, приматы) или относительно аваскулярным кровотоком сетчатки (кролики или морские свинки), у которых при измерении будет отсутствовать допплеровский сдвиг частот отраженного сигнала от эритроцитов в ретинальных сосудах [11]. Известно, что интерпретировать результаты при исследовании кровотока в сосудах ДЗН достаточно трудно, так как более глубокие слои головки зрительного нерва питаются за счет задних коротких цилиарных артерий и хориоидеи, а более поверхностные - из системы центральной артерии сетчатки. В. Petrig и соавт. [12] обнаружили, что у приматов кровоток в головке ДЗН не изменялся при повреждении задних цилиарных артерий и уменьшался при окклюзии центральной артерии сетчатки. Наиболее выраженное ухудшение состояния гемодинамики ДЗН отмечалось при поражении ретинальной и хориоидальной систем, однако наибольший допплеровский сдвиг частот кровотока наблюдался в сосудах поверхностных слоев головки ДЗН. Роль коллатерального кровообращения при нарушении кровотока в области ДЗН не изучалась.

Основные преимущества метода ЛДФ - непрерывность и неинвазивность. Исследование длится несколько секунд, оценка данных осуществляется в течение нескольких минут. Недостатком его является чувствительность к внешним колебаниям. Большинство авторов при исследовании хориоидальной циркуляции используют склеральный датчик для устранения влияния ретинального кровотока на получение сигнала допплеровского сдвига частот.

При использовании ЛДФ на модели ишемии-реперфузии у крыс разного возраста М. Ishihara и соавт. [13] выявили зависимость повреждения от длительности ишемии. При длительной ишемии была получена меньшая скорость дальнейшей реперфузии. Авторы наблюдали у крыс зависимость состояния кровотока от возраста, что было подтверждено в исследовании К. Matsuura и соавт. [14], которые отметили влияние гипотермии на уменьшение реперфузии после ишемии. G. Li и соавт. [15] с помощью ЛДФ показали, что постокклюзионная реактивная гиперемия у крыс происходит в ретинальных, а не в хориоидальных сосудах и зависит от длительности окклюзии. После каротидной окклюзии с наложением гидравлического зажима на общую сонную артерию скорость кровотока в постокклюзионном периоде резко возрастает в сосудах сетчатки (реперфузия) и незначительно изменяется в хориоидальных сосудах.

ЛДФ - информативный метод для непрерывного измерения хориоидального кровотока у крыс при определении влияния оксида азота (NO) на поддержание основного глазного кровотока in vivo. После внутривенного введения неселективного или селективного ингибитора NО-синтазы, M. Koss [16] отметил дозозависимое снижение преэкваториального хориоидального кровотока.

V. Wong и соавт. [17] изучали изменения глазного кровотока с помощью ЛДФ на модели стрептозоцинового диабета у крыс при резком нарушении внутриглазного давления.

Лазерная допплеровская велосиметрия (ЛДВ) служит для определения кровотока в артериолах или венулах сетчатки. Лазерное излучение низкой мощности фокусируют на ретинальные сосуды глазного дна с последующим анализом сигнала допплеровского сдвига частот, отраженного от движущихся клеток крови. Методика позволяет определить диаметр сосуда и объемную скорость кровотока в нем. Е. Sato и соавт. [18] в эксперименте на кошках, подвергшихся ингаляции газовой смесью 5% диоксида углерода с 21% кислородом и 74% азота, отмечали повышение скорости кровотока и увеличение диаметра сосудов сетчатки во время гиперкапнии. Кроме того, наблюдалась зависимость скорости кровотока от содержания NO при введении ингибитора NO-синтазы. Т. Nagaoka и соавт. [19] исследовали влияние NO на регуляцию ретинального кровообращения при гипоксии у кошек. С помощью ЛДВ показано уменьшение диаметра ретинальных сосудов, вязкости крови и снижение скорости ретинального кровотока при интравитреальном введении ингибитора NO-синтазы.

К. Sogawa и соавт. [20] на модели острой гипергликемии у кошек использовали ЛДВ для оценки скорости кровотока и диаметра артериол сетчатки. Выявлено увеличение показателей скорости кровотока после острой гипергликемии, являющейся, по мнению авторов, одной из причин эндотелиальной дисфункции.

Ультразвуковые методы диагностики кровотока глаза

Цветовое допплеровское картирование (ЦДК) позволяет получать не только двухмерное изображение сосудов, но и допплеровскую информацию о состоянии кровотока. Методика дает возможность визуализировать кровоток в мелких орбитальных сосудах, таких как глазная артерия и ее ветви (центральная артерия сетчатки, задние короткие цилиарные артерии и задние длинные цилиарные артерии и др.) и получать данные о состоянии венозного орбитального кровотока. С помощью этого метода можно оценивать гемодинамику в сосудах глаза путем анализа спектра допплеровского сдвига частот и измерения скоростей кровотока: максимальной систолической скорости (Vsyst), конечной диастолической скорости (Vdiast) и средней скорости (Vmean) [21, 22]. Для получения информации о состоянии сосудистой системы проксимальней и дистальней исследуемого сосуда определяют индекс резистентности (RI).

Для проведения метода используют многофункциональные цифровые ультразвуковые системы (Voluson, DC-7 (Mindray), Siemens Acuson Antares и др.) и линейные датчики с частотой от 10 до 16 МГц. Для визуализации мелких сосудов и измерения низкоскоростного кровотока применяют энергетическое картирование (ЭК), при котором анализируется амплитуда сигналов, отраженных от эритроцитов в заданном объеме. При ЭК и ЦДК сосуды идентифицируются по отношению к анатомическим образованиям орбиты (топографическая идентификация), по цветовому коду и в зависимости от направления движения крови относительно датчика - кровоток в артериях кодируется красным цветом, в венах - синим. Цвета становятся более светлыми при увеличении скорости, низкие скорости кодируются темными тонами красного и синего.

Методика использовалась на экспериментальных моделях животных в ходе изучения модели стрептозоцинового диабета у крыс [23]. Авторы определили достоверное снижение показателей скорости кровотока в центральной артерии сетчатки, задних длинных цилиарных артериях и повышение RI. Максимальное повышение RI в центральной артерии сетчатки происходило с 4-го месяца и сохранялось в течение всего периода наблюдения, в то время как в задних длинных цилиарных артериях достоверное увеличение RI наблюдалось во всех сроках наблюдения, что свидетельствовало о более раннем вовлечении в патологический процесс мелких сосудов. Скорость венозного кровотока в центральной вене сетчатки достоверно снижалась к 12 мес (до 52% от нормы), что указывало на наличие признаков венозного стаза. Наиболее четкая визуализация потоков крови наблюдалась в энергетическом режиме, что дало возможность авторам оценить направление хода сосудов, их анатомическое расположение и взаимоотношения с другими тканями орбиты. На основании ультразвуковых допплеровских методов исследования была разработана схема кровоснабжения глаза и орбиты крысы, что представляет значительный интерес для экспериментального изучения изменений кровоснабжения глаза.

Ультразвуковые методы использовали для оценки влияния медикаментозных препаратов на кровоток.

Е.А. Кравчук [24] при экспериментальном моделировании гемофтальма у кроликов проводила ЦДК и ЭК в сочетании с трехмерным ультразвуковым сканированием. После курса терапии антиоксидантом тримексидином отмечалось уменьшение объема кровоизлияния в стекловидном теле и увеличение скорости кровотока в сосудах глаза и орбиты, при этом максимально изменялась конечная диастолическая скорость кровотока. На основании методов цветового и энергетического допплеровского картирования и трехмерной реконструкции сосудов в режиме реального времени была разработана прижизненная схема кровоснабжения глаза кролика. Разработанные автором объективные критерии прижизненной оценки состояния кровотока в ретробульбарных сосудах in vivo позволили оценить влияние медикаментозных средств на гемодинамику глаза.

Заключение

Существующие на сегодняшний день методы исследования микроциркуляции в эксперименте позволяют оценить ретинальный, хориоидальный кровоток и сосуды ретробульбарного пространства. Комплексное применение известных методов позволяет получить достоверную информацию о состоянии гемодинамики глаза. Разработка и выбор экспериментальных моделей сосудистой патологии глаз имеют теоретическое значение для расширения понимания механизмов нарушения кровообращения и практическую значимость для оценки эффективности лечения сосудистых заболеваний сетчатки и зрительного нерва.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail