В настоящее время 45 млн человек в мире страдают слепотой, и эта цифра каждый год увеличивается на 1—2 млн [3]. Примерно в 10% случаев причиной слепоты являются стойкие помутнения роговицы после травм, трансплантаций, тяжелых язвенных кератитов и дистрофических заболеваний, сопровождающихся неоваскуляризацией стромы [4].

Проблема васкуляризации роговицы является весьма актуальной в связи с увеличением количества заболеваний и различного рода воздействий экзогенных факторов, индуцирующих ангиогенез. Обширен список традиционных методов лечения данной патологии, но все они не всегда достаточно эффективны. Одними из наиболее часто применяемых современных методов подавления ангиогенеза являются фотодинамическая (ФДТ) и медикаментозная антиангиогенная терапии [1, 2].

ФДТ с применением фотосенсибилизаторов (ФС) основана на избирательной способности ФС накапливаться в делящихся клетках и при воздействии света с длиной волны, соответствующей пику его поглощения, генерировать синглетный кислород и другие активные радикалы. Их токсическое действие на новообразованные сосуды может проявляться десквамацией эндотелиальных клеток и окклюзией просвета сосуда, при этом особых негативных воздействий на окружающие ткани не оказывается [1].

Альтернативная медикаментозная антиангиогенная терапия в офтальмологии основана на применении препаратов, ингибирующих фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); в настоящее время эти препараты находятся на различных стадиях клинических испытаний. Одним из таких препаратов является бевацизумаб, представляющий собой рекомбинантное гиперхимерное гуманизированное моноклональное антитело, обладающее способностью селективно связываться со всеми изоформами человеческого VEGF (VEGF110, VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF183, VEGF189 и VEGF206) c высокой аффинностью, тем самым ингибируя адгезию к его рецепторам на поверхности эндотелиальных клеток, что препятствует развитию и способствует редукции новообразованных сосудов [1, 2, 4].

Сами по себе эти методы достаточно эффективны, но у каждого есть свои показания и противопоказания. Кроме того, важным условием является необходимость неоднократного повторения выбранной терапии для лечения в сложных случаях. В связи с этим нами было предложено применять вышеуказанные методы в комбинации, рассчитывая на их синергидное действие, которое позволило бы уменьшить кратность повторных процедур.

Цель настоящего экспериментального исследования — морфологическое изучение состояния новообразованных сосудов роговицы после проведения ФДТ с ФС Фотосенс, введения бевацизумаба, препарата анти-VEGF, и их сочетанного применения, а также иммуногистохимическое исследование фармакодинамики бевацизумаба в тканях роговицы при субконъюнктивальном его введении.

Материалом исследования служили 44 кролика (88 глаз) породы серая шиншилла массой 2,5—3,0 кг с моделированной корнеальной неоваскуляризацией (химический ожог 10% раствором гидроксида натрия — NaOH). Все животные были разделены на 5 групп: в 1—4-й по 8 особей, в 5-й (контрольной) — 12. В 1-й группе проводили ФДТ с помощью диодного лазера БИОСПЕК (Россия) с использованием препарата Фотосенс (внутривенно в дозировке 0,3 мг/кг за 72 ч до лазерного облучения). Плотность мощности лазерного излучения 500 мВт/см2, длина волны 675 нм. Кроликам 2-й группы однократно субконъюнктивально инъецировали бевацизумаб в дозировке 1,25 мг. В 3-й группе животным проводили ФДТ с ФС Фотосенс в комбинации с антиангиогенным препаратом бевацизумаб, вводимым субконъюнктивально непосредственно перед проведением ФДТ (параметры лазерного облучения и дозировки препаратов соответствовали таковым в 1-й и 2-й группах). В 4-й группе проводили исследование фармакодинамики препарата бевацизумаб, вводимого субконъюнктивально в дозировке 1,25 мг. 5-я группа служила контролем (вместо препаратов вводили соответствующее количество физиологического раствора). Сроки выведения животных из эксперимента в 1—3-й группах 1—2, 48 ч и 2, 4 нед, в 4-й — 1—2, 24, 48 ч и 1 нед; в контрольной — 1—2, 24, 48 ч и 1, 2, 4 нед.

В работе применяли методы биомикроскопии и флюоресцентной ангиографии (ФАГ) переднего отдела глаза. Биомикроскопию осуществляли с помощью щелевой лампы ЩЛ-3Г ТУЗ 3.2438—91 с использованием метода фокального бокового освещения. ФАГ проводили стандартным методом на фундус-камере Топкон (Япония) со встроенной цифровой камерой. В качестве возбуждающего фильтра использовали Baid Atomic B4, перед объективом видеокамеры устанавливали желтый барьерный фильтр ЖС-13, соответствующий по характеристике Kodak Wratten №15. В качестве контрастного вещества применяли 10% раствор флюоресцеин-натрия (Флуоресцид) производства фирмы «Алкон» (США), который вводили в ушную вену в количестве 2,0 мл в течение 2 с. Через 6—7 с от начала инъекции проводили серийную съемку роговицы с неоваскуляризацией.

Морфологическое исследование осуществляли методами световой, иммунофлюоресцентной и трансмиссионной электронной микроскопии.

Иммуногистохимический анализ фармакодинамики бевацизумаба проводили на серийных криосрезах (толщиной 10 мкм) глаз кроликов с использованием флюоресцентно меченых антител Goat anti Human IgG (H+L) Alexa 546 (Molecular Probes) в разведении 1:800. Гистологическое исследование роговицы проводили методами парафиновых и/или полутонких срезов (эпоксидная смола EPON 812), окрашенных гематоксилином и эозином или полихромным красителем соответственно. Для электронной микроскопии срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу. Гистологические препараты исследовали на световом микроскопе Leica DM 2500. Фотографирование и морфометрический анализ изображений осуществляли с помощью цифровой камеры Leica DFC 320 и программного обеспечения Image scope color, M. Ультратонкие срезы исследовали на трансмиссионном электронном микроскопе Opton EM-10C (Германия).

Результаты проведенного биомикроскопического исследования и ФАГ показали, что через 3 нед после химического ожога во всех группах новообразованные сосуды формировали многослойное сплетение, расположенное преимущественно в передней трети толщи стромы роговицы (рис. 1, а,б).

На сагиттальных срезах роговицы при гистологическом исследовании новообразованные сосуды магистрального типа на периферии и в центральных отделах располагались главным образом в поверхностных стромальных слоях роговицы в виде тонкостенных сосудистых сплетений, выстланных слоем плоских эндотелиальных и единичными гладкомышечными клетками по периметру базальной мембраны. Их отличала повышенная проницаемость стенки, на что указывало наличие в периваскулярных пространствах лейкоцитов, в том числе эозинофилов.

Новообразованные сосуды отличало от нормальных относительно истонченное строение стенки и гипоцеллюлярность в отношении как миоцитов, так и эндотелиоцитов, ядра которых были уплощены. Базальная мембрана и гладкомышечная оболочка имели неравномерную толщину, особенно в проекции безъядерной части эндотелиальных клеток, что лишь в малой степени отличало сосуды артериолярного типа от венулярных.

Для подтверждения проникновения бевацизумаба в строму роговицы при субконъюнктивальном его введении нами было проведено иммуногистохимическое исследование. Установлено, что через 1—2 ч бевацизумаб проникал в строму роговицы (рис. 2, а)

После проведения ФДТ на гистологических препаратах отмечали развитие тромбоза магистральных сосудов как артериолярных, так и венулярных, с частичной или полной облитерацией их просвета, вокруг дилатированных капилляров при этом наблюдали отек прилежащей стромы без признаков экстравазации и видимых изменений окружающей роговичной ткани. Позднее в поверхностной строме обнаруживали фибропластическую реакцию, вызывавшую уплотнение коллагенового матрикса и спадение новообразованных капилляров (рис. 3, а).

В первые же часы после однократного субконъюнктивального введения бевацизумаба наблюдали изменения в виде отека ядер эндотелиоцитов, резкого уменьшения просвета и снижения кровотока в конечных отделах новообразованных сосудов (см. рис. 3, б). На фоне редукции новообразованного сосудистого русла происходил спазм магистральных артериол, нередко сопровождавшийся их тромбозом и снижением экстравазации (см. рис. 3, в). Через 2 нед отмечали относительную гиперцеллюлярность субэпителиальной стромы. Спустя 1 мес антиангиогенный эффект несколько снижался, появлялись признаки реваскуляризации стромы.

В 3-й группе после проведения ФДТ с одновременным введением бевацизумаба редукция новообразованных сосудов наступала быстрее и сохранялась до конца эксперимента за счет суммирования процессов спазмирования и тромбообразования в магистральных сосудах, а также отека эндотелиоцитов и спадения стенок капиллярного русла (см. рис 3, г).

По данным ультрамикроскопического исследования, механизм ангиотропного действия комбинированного лечения заключался в отеке (рис. 4, а)

Новообразованной сосудистой сети в строме роговицы присуща многоуровневая архитектоника. Сосуды образуют 3—4-слойное сплетение в верхней трети толщи стромы. Средний калибр новообразованных сосудов в строме роговицы уменьшался в направлении от поверхностных к глубоким ее слоям. Результаты морфометрического анализа свидетельствовали о том, что в 4-й группе через 1 мес после проведения ФДТ в комбинации с субконъюнктивальным введением бевацизумаба плотность новообразованных сосудов, начиная с уровня прекапилляров, достоверно снижалась по сравнению с таковой в контроле. Параллельно отмечалось уменьшение калибра магистральных сосудов. По сравнению с контролем в 1-й группе (ФДТ) наблюдали достоверное уменьшение диаметра преимущественно магистральных сосудов, в то время как во 2-й (бевацизумаб) — прекапилляров, посткапиллярных венул и капилляров. Результаты морфометрического анализа приведены в таблице.

Иммуногистохимическое исследование показало, что максимальное накопление препарата бевацизумаб в эндотелии новообразованных сосудов роговицы отмечалось уже в первые 1—2 ч после субконъюнктивального его введения. Экспериментально установлено, что в 1-й группе (ФДТ) развивался фототромбоз в магистральных новообразованных сосудах преимущественно венозного отдела, что сопровождалось выраженным отеком стромы роговицы. Во 2-й группе (бевацизумаб) медикаментозная антиангиогенная терапия приводила к нарушению кровотока, главным образом в микроциркуляторных звеньях новообразованной сосудистой сети, в результате отека и последующей атрофии клеточных элементов стенки капилляров.

В случае комбинированной терапии (3-я группа) отмечали синергизм антиангиогенных процессов, причем без клинически значимого отека роговицы. В контрольной (5-й) группе картина неоваскуляризации стромы роговицы не только сохранялась, но и усиливалась к концу срока наблюдения.

По результатам экспериментально-морфологического исследования можно заключить, что фотодинамическая терапия с ФС Фотосенс в комбинации с анти-VEGF препаратом бевацизумаб приводит практически к полной непроходимости всех отделов новообразованного сосудистого русла роговицы, причем в более ранние сроки и на протяжении всего эксперимента по сравнению с 1-й и 2-й группами. При сохранении в ряде случаев кровотока в крупных магистральных сосудах возможно проведение повторных курсов комбинированного лечения. Отсутствие побочного действия на окружающие ткани и восстановление оптических свойств роговицы позволяют предположить, что в перспективе возможно использование предложенного метода в клинической практике.