Буллезная кератопатия (БК) или эндотелиально-эпителиальная дистрофия (ЭЭД) роговицы — часто встречающееся патологическое состояние, развивающееся вследствие декомпенсации функции роговичного эндотелия и характеризующееся стойким отеком роговицы [11].

Развитие послеоперационной буллезной кератопатии (ПБК) происходит в результате потери эндотелиальных клеток (ЭК) роговицы во время хирургических манипуляций.

В англоязычной медицинской литературе ранняя ПБК обозначается термином «внезапная буллезная кератопатия» или «внезапный необратимый отек роговицы» («irreversible immediate corneal edema», «irreversible BK»), возникший «на операционном столе» и неразрешающийся за все время наблюдения [16, 23, 25].

Следует отметить, что консервативное лечение ПБК неэффективно, а бóльшая часть хирургических методов лечения имеет те или иные недостатки, которые ограничивают область их клинического применения.

Эффективной может оказаться клеточная терапия (КТ), однако в этом случае требуется решение ряда вопросов: необходимо иметь постоянно доступный источник клеток, использовать безопасный и экономичный метод их выделения и процессинга, исключить или в крайнем случае минимизировать возможность развития иммунного конфликта, обеспечить полную биологическую безопасность для пациента, реально оценивать техническую сложность применяемых методов, материальные затраты, законодательные и этические ограничения.

Решением вышеперечисленных проблем являются технологии персонализированной клеточной терапии (ПКТ), в которых для лечения пациента используются его собственные (аутологичные) клетки, полученные и сохраненные заранее либо полученные непосредственно перед проведением лечения [13, 26]. Естественно, что для каждой конкретной клеточной технологии будет характерен уникальный алгоритм получения, хранения, процессинга и применения аутологичных клеток или клеточного продукта.

В НИИ глазных болезней РАМН коллективом авторов (А.А. Каспаров, Евг.А. Каспарова, А.С. Павлюк) разработан и применяется метод ПКТ, известный по прежним публикациям как локальная экспресс-аутоцитокинотерапия. Метод применяется в двух модификациях — наружная ПКТ и интракамеральная ПКТ. Наружная ПКТ предполагает субконъюнктивальное введение и инстилляции смеси цельной аутологичной крови и комплекса полиА:полиУ (препарата Полудан). Такая модификация используется при эпителиально-стромальных поражениях роговицы и конъюнктивы (упорные и часто рецидивирующие герпетические кератиты, осложненные аденовирусные кератоконъюнктивиты, термохимические ожоги 1—2-й степени, замедленная реэпителизация после фоторефракционной и фототерапевтической кератэктомии). Метод интракамеральной ПКТ заключается в инкубации in vitro крови пациента со стимулятором (Полудан), сборе сыворотки со взвешенными в ней активированными лейкоцитами и введении полученного клеточного препарата (КП) в переднюю камеру глаза пациента. Приоритет на изобретение закреплен патентами на изобретения: №2165747 «Способ лечения поствоспалительной буллезной кератопатии» и №2357743 «Средство для лечения, способ получения средства для лечения и способ лечения отека роговицы и других проявлений ранней буллезной кератопатии».

Далее в данной статье под термином ПКТ мы будем подразумевать интракамеральную модификацию ПКТ.

Спектр стимуляторов, используемых для проведения КТ, ограничен теми субстанциями, применение которых разрешено законодательно. В случае интраоперационной ПКТ в офтальмологии препарат должен быть разрешен к внутриглазному введению.

При приготовлении КП для ПКТ используется синтетический комплекс полиадениловой—полиуридиловой кислот, структурный аналог двухспиральной вирусной РНК, реализующий свое действие через Toll-like рецепторы 3-го и 7-го типа, препарат Полудан, разрешенный к внутриглазному применению и более 10 лет успешно используемый в офтальмологической практике [31]. Кроме того, на клетки оказывают активирующее влияние и другие процессы — свертывание крови, имитирующее течение раневого процесса, температура 37 °С, усиливающая интенсивность синтетических процессов.

Важнейшим требованием при проведении КТ является характеристика и стандартизация клеточного продукта [5]. Мы провели ряд исследований, в результате которых было установлено, что предлагаемый метод сбора клеток в аутологичной сыворотке вокруг сгустка свернувшейся крови позволяет получить КП с высоким содержанием жизнеспособных клеточных элементов, из 8 мл крови можно получить 2—4 мл КП с концентрацией ядросодержащих клеток 3·10⁶ кл/мл и жизнеспособностью 70—90%.

Было исследовано, какие именно клеточные популяции входят в состав КП; установлено, что соотношение гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов отличается от соотношения в цельной крови; содержание мононуклеарной фракции снижено в 1,3 раза и увеличена доля гранулоцитов, T-хелперы, T-цитотоксические и NK-клетки присутствуют в КП в тех же пропорциях, что и в периферической крови, тогда как содержание В-лимфоцитов снижено почти в 5 раз [1].

Первое исследование эффективности ПКТ было проведено у больных с ранними проявлениями герпес-вирусного кератоиридоциклита и эндотелиита, имевшего тенденцию к прогрессированию. ПКТ оказалась более эффективной, чем лечение одним Полуданом интракамерально. Выздоровление было достигнуто у 84 и 56% больных соответственно (p<0,01). Средняя острота зрения существенно возросла в группе ПКТ: 0,11±0,2 до лечения и 0,6±0,3 после.

Обнаруженная значимая разница в эффективности лечения (28%), по нашему мнению, была связана с более выраженным терапевтическим воздействием ПКТ на патологический процесс в эндотелии и задних слоях стромы роговицы по сравнению с одним Полуданом.

Учитывая сходство клинической картины при буллезном герпетическом увеокератите и ранней ПБК поражение эндотелия, наличие воспалительного компонента в их патогенезе, подтвержденные патогистологическими исследованиями [3, 5], а также отметив высокую клиническую эффективность методики ПКТ и ее выраженный регенераторный, противовоспалительный и противоотечный эффекты, мы решили применить ее в лечении ранней ПБК [6—8, 14, 31].

Для каждого конкретного метода КТ вопрос о механизмах лечебного действия требует отдельного изучения, однако принято считать, что механизмами, обусловливающими эффективность любой КТ, являются: заместительный механизм, когда введенные клетки физически заполняют собой дефект ткани, восстанавливая ее функцию, трофический, когда введенные в зону повреждения компоненты клеточного препарата продуцируют биологически активные вещества и/или модулируют активность клеток тканевой ниши путем паракринных или контактных воздействий [18, 22, 24]. Поэтому нами было проведено определение в составе КП биологически активных веществ — цитокинов и факторов роста, которые могут играть центральную роль в механизмах реализации его терапевтических эффектов [2]. Полученные значения приведены в табл. 1.

Установлено что цитокиновый профиль КП формируется за счет цитокинов:

— выделенных в ответ на стимуляцию полиА: полиУ (ИФН-α, ИЛ-1, -6, ФНО-α);

— спонтанно синтезированных за время инкубации (ИЛ-8);

— предсуществующих в плазме и сыворотке крови (TGFβ₁, PDGF-AB, TGFβ₂, VEGF, ИФН-γ и ИЛ-4).

Можно предположить, что при проведении интракамеральной ПКТ и замене водянистой влаги передней камеры глаза на КП наблюдаются явления, аналогичные полученным в культуре эндотелиоцитов: PDGF ускоряет заживление раневого дефекта; TGFβ₁ приводит к стимуляции пролиферации клеток, усилению продукции коллагена и выработке эндогенного b-FGF эндотелиоцитами, который, в свою очередь, защищает клетки от апоптоза; VEGF стимулирует миграцию эндотелиоцитов в зону повреждения [15, 19, 27, 30, 32, 33].

Известно, что и другие обнаруженные цитокины играют роль в процессах регенерации. Так, ФНО-α регулирует процессы фиброгенеза в поврежденной роговице, ИЛ-1 индуцирует синтез b-FGF эндотелиоцитами после деструкции роговицы [28, 29]. Провоспалительные цитокины ослабляют межклеточные контакты между эндотелиоцитами, чем, предположительно, стимулируют эндотелий роговицы к делению, снимая один из механизмов его ингибирования [20].

Результаты определения цитокинового спектра КП позволили разработать схему предполагаемого механизма лечебного действия ПКТ (рис. 1).

Выделившиеся в результате стимуляции полиА: полиУ провоспалительные цитокины вкупе с ИЛ-8 ослабляют межклеточные контакты, чем снимают контактное ингибирование митоза, позволяя эндотелиоцитам осуществить деление или мигрировать и закрыть зону дефекта. Антиапоптотическому эффекту способствует наличие факторов роста, концентрация которых в водянистой влаге в норме снижена; они, кроме того, усиливают синтез внеклеточного матрикса, что стабилизирует барьерную функцию эндотелия. Прямой противовирусный эффект обеспечивается наличием в КП ИФН-α.

Все указанные выше процессы приводят к восстановлению барьерной функции эндотелия роговицы. После интракамеральной инъекции КП начавшиеся in vitro процессы синтеза и продукции цитокинов лейкоцитами продолжаются in vivo в передней камере глаза, обеспечивая таким образом пролонгированное локальное высвобождение биологически активных веществ, обусловливающих клинический эффект ПКТ.

В период 2000—2013 гг. была выполнена интракамеральная ПКТ на 52 глазах с ранней ПБК (т.е. развившейся спустя 1—3 мес после операции) различной степени выраженности и генеза. Сеансы интракамеральной ПКТ проводились от 1 до 5 раз в зависимости от клинической динамики с интервалом 3—4 дня. В общей сложности было проведено 117 сеансов ПКТ.

Стадии БК варьировали от 1-й до 3-й (по классификации, предложенной авторами): 1-я стадия у 5 пациентов, 2-я — у 27, 3-я — у 20.

Пациенты предъявляли жалобы на резкое снижение остроты зрения, покраснение глаза, светобоязнь, слезотечение, ощущение инородного тела в глазу, боль. У 8 пациентов было компенсированное на гипотензивной терапии сопутствующее повышение внутриглазного давления (ВГД).

Состояние роговой оболочки характеризовалось наличием стойкого локального, чаще диффузного отека эндотелия, у некоторых пациентов — отложением на нем пигмента; выраженной складчатостью десцеметовой оболочки (в частности, после факоэмульсификации (ФЭ) складки были грубые и множественные, занимали от 40 до 80% площади роговицы), выраженным диффузным отеком стромы, буллезным отеком эпителия. Плотность эндотелиальных клеток (ПЭК) в большинстве случаев не определялась из-за выраженного отека стромы. Во всех случаях, несмотря на активно проводимое консервативное лечение в сроки от 2,5 нед до 1,5 мес (экспресс-инстилляции гиперосмотического раствора глюкозы, дексаметазона, солкосерила; курсы субконъюнктивальных инъекций дексаметазона, солкосерила; гелий-неоновый лазер, лечебные мягкие контактные линзы, гипотензивная терапия пациентам с повышенным ВГД), тенденции к выздоровлению не наблюдалось.

Острота зрения колебалась от правильной светопроекции до 0,6 и составляла в среднем 0,1±0,12.

Пациенты были в возрасте от 69 до 80 лет, большинство из них женщины. Сроки наблюдения составили от 3 мес до 7 лет.

Пациенты были разделены на три группы в зависимости от причины, приведшей к ПБК (табл. 2).

В 1-ю группу вошли 47 (90,4%) пациентов с ранней послеоперационной псевдоафакичной БК, развившейся после хирургии катаракты (ЭЭК+ИОЛ и ФЭ), у семи из них была ЭЭД Фукса.

Во 2-ю группу включено 4 (7,7%) пациента с ранней ПБК, развившейся после антиглаукоматозной операции, у двух из них ПБК развилась на фоне ЭЭД Фукса.

В 3-й группе была 1 (1,9%) пациентка с БК, развившейся спустя несколько лет после проникающего ранения роговицы, поверхностного химического ожога и травмирования длительно находившимся в передней камере мельчайшим осколком стекла.

В случае развития ПБК после осложненной заднекамерной имплантации ИОЛ (вывиха ИОЛ и ее опорных элементов, грыжи стекловидного тела и хрусталиковых масс) ПКТ проводили после устранения данных состояний.

В условиях операционной после ретробульбарной анестезии и выполнения парацентеза производили замещение влаги передней камеры на КП. Оставшуюся часть КП вводили под конъюнктиву паралимбально. Сразу же после операции больной принимал положение лицом вниз и лежал так в течение 2 ч.

Положение вниз лицом обеспечивает осаждение активированных клеточных элементов на задней поверхности роговицы и тем самым способствует непосредственному контакту с зоной поражения — эндотелиальными клетками и десцеметовой мембраной (контактное стимулирование).

Помимо контактного взаимодействия, повторные сеансы ПКТ обеспечивают циркуляцию в передней камере глаза растворенных в аутологичной сыворотке цитокинов, в том числе факторов роста (трофический компонент ПКТ).

Пациентам проводили общеофтальмологическое обследование, включавшее биомикроскопию, визометрию, пневмотонометрию (при невозможности ее выполнения ВГД измеряли транспальпебральным тонометром ТГДЦ 01А), фоторегистрацию, зеркальную микроскопию.

У ряда больных для определения толщины роговицы использовали анализатор биомеханических свойств роговицы Пентакам (Pentacam, «Oculus», Германия). Прижизненную конфокальную микроскопию роговицы проводили с использованием конфокального микроскопа Confoscan-4 («Nidek», Япония) с увеличением 500.

Лечебный эффект ПКТ оценивали как «выраженный» при:

— расправлении более 70% складок десцеметовой оболочки;

— полной резорбции отека стромы;

— исчезновении буллезных изменений эпителия;

— повышении прозрачности и уменьшении толщины роговой оболочки;

— приросте остроты зрения от 0,25 до 0,9.

Эффект расценивали как «частичный» при:

— расправлении 40—50% складок;

— частичной резорбции отека;

— исчезновении буллезных изменений эпителия роговицы;

— приросте остроты зрения от 0,05 до 0,2.

При отсутствии эффекта первоначальные буллезные изменения роговицы сохранялись.

Из числа пациентов, получавших сеансы ПКТ, выраженный терапевтический эффект был отмечен у 44,2%. Частичный эффект наблюдался у 21,1% больных, отсутствие эффекта — у 34,6% больных.

Прирост остроты зрения в группе пациентов с выраженным эффектом составил 0,49±0,27, у пациентов с частичным эффектом — 0,12±0,04 (p≤0,05) (табл. 3).

У двух больных из группы с выраженным эффектом наблюдались рецидивы БК: через год после ПКТ у одной пациентки на фоне повышения ВГД и спустя 3 года на фоне ОРВИ у другой больной.

О резорбции отека также свидетельствует уменьшение толщины роговицы после проведения ПКТ. Средние показатели пахиметрии до лечения составляли 801±112 мкм, после проведения ПКТ — 582±55 мкм (p≤0,05).

Следует отметить, что чем раньше (т.е. в первые недели или месяцы) после возникновения отека проводится процедура ПКТ, тем чаще впоследствии мы наблюдаем выраженный терапевтический эффект. Это, по-видимому, связано с тем, что необратимые апоптотические и дистрофические изменения десцеметовой мембраны и эндотелия роговицы прогрессируют уже в течение первых месяцев после развития ПБК [26, 31]. Эффект ПКТ начинает проявляться уже в первые дни после процедуры и, как правило, максимально развивается спустя 1—3,5 мес после ее проведения.

Исследование эндотелия роговицы методом ПКФМС (визуализация и подсчет ЭК) у больных с ранней ПБК до проведения ПКТ, как правило, оказывалось невозможным ввиду выраженного отека роговицы. После проведения ПКТ в группе пациентов с выраженным и частичным эффектом отек роговицы резорбировался, прозрачность роговицы восстанавливалась и ПКФМС давала возможность визуализировать структуру роговицы, определить состояние кератоцитов, а также количественные и качественные характеристики эндотелия.

Так, средние значения ПЭК после лечения составили 1080±463. Ядра, визуализируемые в кератоцитах и эндотелии, были крупными и гиперрефлективными, что свидетельствует об интенсивно протекающих синтетических процессах.

Многие эндотелиоциты были полиплоидными (имели по 2 ядра и более). У ряда пациентов полиплоидные ядра сохраняются спустя 3—5 лет после проведения ПКТ [9]. При этом, несмотря на то что ПЭК у этих больных относительно низкая (760—1229 клеток/мм), прозрачность роговицы сохраняется и рецидива отека не наблюдается. При контрольном обследовании парных глаз этих больных методом конфокальной микроскопии двойных ядер в эндотелиальных клетках не обнаружено. Наличие полиплоидных ядер свидетельствует о том, что в результате применения ПКТ, вероятно, в эндотелии реализуются регенеративные процессы, приводящие в том числе к незавершенному митозу. Такие клетки сохраняют функциональную активность и обеспечивают нормальные метаболические процессы в монослое эндотелия в условиях возрастной физиологической убыли клеток. По данным В.Я. Бродского и И.В. Урываевой, полиплоидизирующий митоз, в результате которого увеличивается количество ядер и происходит увеличение размеров клеток, является вариантом регенерации в условиях монослоя, его наличие подтверждает способность эндотелия роговицы к делению [4, 12].

Деление эндотелиоцитов роговицы человека описано в литературе. Стимуляция деления ЭК зафиксирована при ослаблении межклеточных контактов в результате травмы, под воздействием ЭДТА или провоспалительных цитокинов и факторов роста, добавляемых вместо компонентов водянистой влаги передней камеры, а также при контакте с сывороткой крови [10, 17, 21, 23].

Все эти факторы присутствуют и в случае применения интраоперационной ПКТ для лечения ПБК — на эндотелии имеется операционный дефект, а в переднюю камеру вводится, замещая собой водянистую влагу, КП в аутологичной сыворотке крови, содержащий в своем составе цитокины и факторы роста.

Далее приводим клинические случаи.

Случай 1. Пациентка К., 52 года.

Пациентка обратилась в НИИГБ РАМН спустя месяц после ФЭ катаракты с имплантацией ИОЛ с жалобами на низкое зрение и «туман» перед правым глазом. Активное консервативное лечение, проводимое в течение 4 нед после операции, было неэффективным. С диагнозом «OD—вторичная ЭЭД роговицы, артифакия, состояние после субтотальной витрэктомии и ревизии полости стекловидного тела, периферическая хориоретинальная дистрофия» пациентка была госпитализирована в стационар НИИГБ РАМН.

При поступлении острота зрения правого глаза составляла счет пальцев у лица, ВГД OD — 9,1 мм рт.ст., при проведении биомикроскопии OD отмечали выраженный отек роговицы, преимущественно ее задних слоев, грубую складчатость десцеметовой оболочки по всей площади роговицы (рис. 2, а)

До операции ФЭ ПЭК на правом глазу составляла 2263 клеток/мм.

17.12.2009 на OD была выполнена ПКТ. На следующий день отмечалась резко положительная динамика — полная резорбция отека роговицы в центральной и парацентральной областях роговицы, расправление практически всех складок десцеметовой оболочки (см. рис. 2, в), восстановление прозрачности роговицы и повышение остроты зрения до 0,5. В течение 20 ч после процедуры ПКТ толщина роговицы уменьшилась на 475 мкм и составила 495 мкм. Данные конфокальной микроскопии на 1-е сутки после ПКТ на OD: единичные гиперрефлективные наложения на эндотелии (возможно, лейкоцитарная взвесь), выраженный полиморфизм и полимегатизм ЭК, ПЭК 1799—1851 клеток/мм, единичные складки десцеметовой оболочки и задних слоев стромы, строма структурна, умеренно повышена рефлективность кератоцитов, базальный слой эпителия сохранен, границы между клетками несколько стушеваны (см. рис. 2, г—е).

В течение последующего месяца остаточный отек задних слоев стромы исчез полностью, толщина роговицы стабильно составляла 495 мкм, острота зрения правого глаза повысилась до 0,8. Прозрачность роговицы и острота зрения сохраняются стабильными в течение 4 лет наблюдения (см. рис. 2, ж—к).

Случай 2. Пациентка Ш., 72 года.

Пациентка обратилась в ГУ НИИГБ РАМН спустя 1,5 мес после операции ФЭ с имплантацией ИОЛ с жалобами на ощущение инородного тела и «затуманивание зрения» правого глаза. В течение 1,5 мес пациентка получала консервативное лечение, которое не дало эффекта.

При осмотре роговицы правого глаза определялся нежный диффузный отек эпителия и стромы, плоские обширные буллы в центре и на периферии (рис. 3, а).

Вследствие повышения прозрачности роговицы уже через месяц после ПКТ стала возможна визуализация эндотелия с помощью ПКФМС OD: отмечается выраженный полиморфизм ЭК, ПЭК 648,5 клеток/мм, повышенная рефлективность кератоцитов, прозрачность межклеточного матрикса снижена, особенно в передних слоях стромы. Эпителий — резко повышена рефлективность межклеточных границ базального слоя. Пахиметрия OD — 621 мкм в центре. Через 3 мес после ПКТ острота зрения OD составила 1,0.

Спустя 3 года пахиметрия роговицы OD составляет 568 мкм в центре (см. рис. 3, в). ПЭК OD 864 клеток/мм, vis OD — 1,0. ПКФМС OD: визуализируются ЭК с двойными ядрами (см. рис. 3, г, д). Задняя и средняя строма без особенностей, в передних стромальных слоях — умеренный отек экстрацеллюлярного матрикса, базальный слой эпителия сохранен, в эпителии единичные десквамированные клетки поверхностного слоя (см. рис. 3, е, ж). В течение 3 лет наблюдения состояние роговицы и острота зрения стабильны.

Персонализированная клеточная терапия (ПКТ) с использованием аутологичных клеточных продуктов открывает новые возможности для эффективного лечения ранней ПБК, развившейся в первые месяцы после микрохирургических операций, и позволяет решить ряд имеющихся на сегодняшний день проблем (безопасный и экономичный способ получения клеточного материала, исключение возможности иммунологического конфликта и др.).

Исследования клеточного и цитокинового состава КП для проведения ПКТ позволили сформулировать возможные фундаментальные механизмы терапевтического действия ПКТ: провоспалительные цитокины вкупе с ИЛ-8 ослабляют межклеточные контакты, чем, вероятно, снимают контактное ингибирование митоза, позволяя эндотелиоцитам поделиться или мигрировать и закрыть зону дефекта; антиапоптотическому эффекту способствует наличие факторов роста, концентрация которых в водянистой влаге в норме снижена, они, кроме того, усиливают синтез внеклеточного матрикса, что стабилизирует барьерную функцию эндотелия, о чем также свидетельствует наличие полиплоидных ядер в эндотелии роговицы у ряда пациентов.

Разработанный нами метод проведения ПКТ, позволяющий получить из небольшого объема периферической крови пациента КП, представляющий собой взвесь аутологичных лейкоцитов в насыщенной цитокинами (процессированной) сыворотке, прошел успешные клинические испытания. Полученные результаты свидетельствуют о его терапевтической эффективности и безопасности применения в офтальмологической клинике для лечения ранней ПБК. Выраженный терапевтический эффект достигнут в 44,2% случаев, при этом прирост остроты зрения составил 0,49±0,27. Достигнуто снижение толщины роговицы с 801±112 до 582±55 мкм. О нормализации структуры роговицы после ПКТ также свидетельствуют данные ПКФМС.

ПКТ в настоящее время является единственным эффективным методом лечебного воздействия на клетки поврежденного эндотелия, не требующим трансплантации роговицы, у пациентов с ранней послеоперационной буллезной кератопатией.