Наследственные оптические нейропатии (ОН) — генетически обусловленные заболевания зрительного нерва, являющиеся важной причиной двустороннего острого, подострого и хронического снижения зрения. Суммарная распространенность этих заболеваний в общей популяции составляет 1:10 000 населения [19]. Среди всех наследственных ОН наиболее часто встречаются ОН Лебера, связанная с мутациями в митохондриальной ДНК (мтДНК), и аутосомно-доминантная ОН, возникающая в результате мутаций в ядерной ДНК.

Наследственные ОН характеризуются селективным поражением ганглиозных клеток сетчатки, преимущественно папилломакулярного пучка, что определяет общие клинические особенности заболеваний: двустороннее симметричное снижение остроты зрения с формированием центральной или центроцекальной скотомы, дисхроматопсия, диффузная или височная атрофия диска зрительного нерва (ДЗН) и истончение перипапиллярного слоя нервных волокон с преобладающей потерей в темпоральном секторе.

Традиционно выявление наследственных ОН основывалось на обнаружении классических симптомов и семейного анамнеза. Однако наследственный характер заболевания часто не представляется возможным подтвердить, так как реконструкция расширенных родословных у пациентов зачастую затруднена. Это приводит к тому, что большой процент наследственных ОН расценивают как спорадические случаи [1, 2, 6]. Возможность генетического анализа в настоящее время позволяет диагностировать наследственные ОН и в отсутствие явного семейного анамнеза.

В клинической практике для подтверждения ОН Лебера проводят поиск трех первичных мутаций m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484T>C мтДНК, которые обусловливают 90—95% всех случаев митохондриальной ОН. Однако в настоящее время известно более 10 первичных, а также большое число условно-патогенных и вторичных мутаций мтДНК, связанных с этим заболеванием [11, 20].

Аутосомно-доминантную ОН связывают с мутациями гена OPA1, состоящего из 30 экзонов и локализованного на длинном плече хромосомы 3 (в локусе 3q28-q29). В настоящее время известно более 200 мутаций гена OPA1 [10]. Идентифицированы также мутации гена OPA3, приводящие к развитию аутосомно-доминантной ОН в сочетании с врожденной катарактой [20].

При анализе мутаций, проведенном на основе обследования большого числа больных аутосомно-доминантной ОН, проживающих в Западной Европе, выявлены «горячие» точки гена OPA1 и установлено, что 57% всех мутаций в гене сосредоточены в экзонах 8, 15, 27, а также с меньшей частотой в экзонах 14, 16, 18, 28 гена OPA1 [7]. В доступных литературных источниках мы не нашли работы, свидетельствующие о проведении подобных исследований в популяциях России.

Цель работы — молекулярно-генетический анализ ДНК пациентов с клиническим диагнозом наследственной ОН Лебера и аутосомно-доминантной ОН для выявления наиболее часто встречающихся мутаций митохондриальной и ядерной ДНК.

В результате расширенного офтальмологического и клинического обследования была сформирована выборка из 50 пациентов в возрасте от 14 лет до 71 года (34 мужчины, 16 женщин) с двусторонней ОН, негенетические (воспалительная, ишемическая, инфильтративная, компрессионная, травматическая, токсическая) причины которой были исключены. Клиническая картина у 17 пациентов соответствовала аутосомно-доминантной ОН, у 33 пациентов — наследственной ОН Лебера. У 3 пациентов ОН сочеталась с двусторонней врожденной катарактой. Для молекулярно-генетического подтверждения клинического диагноза наследственной ОН в образцах ДНК пациентов был проведен поиск трех «мажорных» мутаций мтДНК (m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484T>C), мутаций в «горячих» участках (экзонах 8, 14, 15, 16, 18, 27, 28) гена OPA1, а также во всей кодирующей последовательности гена OPA3 у пациентов с ОН в сочетании с врожденной катарактой.

ДНК из лейкоцитов периферической крови выделяли с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit («Promega», США) в соответствии с протоколом производителя.

Поиск мутаций m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484T>C проводился с помощью системы, в основе которой лежит мультиплексная пробозависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA). Дизайн олигонуклеотидных проб для лигирования и универсальных праймеров выполнен в лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ МГНЦ РАМН, синтез — в ООО «Евроген», Москва.

Поиск мутаций в «горячих» участках гена OPA1 и во всей кодирующей последовательности гена OPA3 проводился методом прямого автоматического секвенирования ПЦР-фрагментов, содержащих исследуемые экзоны и фланкирующие их интронные последовательности, на приборе 3130xl Genetic Analyzer («Applied Biosystems», Япония).

Дизайн праймеров для ПЦР осуществляли в лаборатории ДНК-диагностики ФГУП МГНЦ РАМН, синтез — в ООО «Евроген», Москва. Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1хбуфер (67 мМ Tris-HCl, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% Twin-20, 4 мМ MgCl₂), 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 ед. термофильной ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер»), 20-30 мкл минерального масла, на программируемом термоциклере МС2 производства фирмы «ДНК-технология» (Россия).

Исследуемые первичные мутации мтДНК, обусловившие развитие наследственной ОН Лебера, выявлены у 16 (32%) пациентов. Распределение первичных мутаций в этой группе представлено следующим соотношением: m.11778G>A — 56%, m.14484T>C — 25%, m.3460G>A — 19% случаев (см. таблицу).

Считают, что дебют ОН Лебера приходится в среднем на возрастной диапазон 15—35 лет с преимущественным поражением мужчин: соотношение мужчины/женщины 9:1, 8:1. Однако в нашем исследовании гендерные различия были менее существенными, а начало остро развившегося заболевания у двух женщин было выявлено в 48 и 57 лет и до генетического обследования расценивалось как двусторонняя последовательно возникшая задняя ишемическая ОН. Семейный анамнез по атрофии зрительного нерва (АЗН) был выявлен у 4 пациентов, следовательно, спорадически возникшая наследственная ОН Лебера отмечена в 75% наблюдений.

Таким образом, генетически подтвержденная ОН Лебера была выявлена у 32% обследованных, однако клиническую картину, соответствующую этому заболеванию, наблюдали у 66% (33 пациента). При этом отмечали двустороннее одновременное или последовательное безболезненное снижение зрения до 0,1 и ниже с развитием центральной или центроцекальной скотомы, дисхроматопсии. Офтальмоскопическая картина в острой стадии характеризовалась типичными изменениями: гиперемией ДЗН, извитостью ретинальных сосудов, перипапиллярными телеангиэктазиями, отеком перипапиллярного слоя нервных волокон, в хронической стадии формировалась частичная АЗН с диффузной или височной бледностью ДЗН (рис. 1).

Молекулярно-генетический анализ «горячих» участков гена OРА1 (экзоны 8, 14, 15, 16, 18, 27, 28) позволил идентифицировать патогенные мутации в 2 (4%) наблюдениях: у женщины 32 лет — мутацию с.869G>A (Arg290Gln) в экзоне 8, у мужчины 54 лет — мутацию с.2850delT в экзоне 28. Выявленная мутация с.869G>A встречается у больных в популяциях Кубы, Великобритании, Италии, мутация с.2850delT, впервые обнаруженная в нашей работе, ранее не была описана [3, 9, 16]. Оба пациента отмечали начало ухудшения зрения в школьном возрасте с последующим прогрессированием, в семейном анамнезе у каждого был выявлен один родственник с низкой остротой зрения: мать у женщины и отец у мужчины.

В нашем исследовании мутации гена OPA3 у 3 пациентов с ОН в сочетании с врожденной катарактой обнаружены не были.

Таким образом, генетически подтвержденная аутосомно-доминантная ОН была выявлена у 4% обследованных, однако классическая клиническая картина, типичная для этого заболевания, была отмечена у 17 (34%) пациентов, у 9 из них, с их слов, имелись родственники с АЗН. У этих пациентов отмечали двустороннее симметричное снижение остроты зрения в первые 10 лет жизни, во многих случаях с незаметным, субклиническим началом. Прогрессирование заболевания отличалось вариабельностью: от умеренной потери остроты зрения, которая стабилизировалась в юности, до медленного, но постоянно прогрессирующего снижения зрения. Кроме этого, наблюдали случаи с внезапными, ступенчатыми уменьшениями показателей визометрии. Клиническая картина характеризовалась развитием дисхроматопсии различной степени выраженности, двусторонними центральными и центроцекальными скотомами с различной степенью депрессии световой чувствительности. Офтальмоскопическая картина соответствовала двусторонней частичной АЗН с преимущественным побледнением височной стороны ДЗН, в некоторых случаях с развитием глубокой экскавации ДЗН (рис. 2).

Таким образом, в нашем исследовании пациенты на основании клинических показателей и имеющихся данных наследственного анамнеза для анализа результатов были разделены на две группы: наследственные ОН Лебера и аутосомно-доминантные ОН. Однако, учитывая возможность пересекающихся признаков заболеваний в редких случаях, всем пациентам провели описанное выше полное молекулярно-генетическое исследование.

Среди всех пациентов с клинически установленным диагнозом наследственной ОН или подозрением на нее только у 36% этиология заболевания была генетически верифицирована. Отчасти это связано с тем, что в настоящее время в практической медицине диагностика ОН Лебера ограничена тремя первичными мутациями m.11778G>A, m.3460G>A, m.14484T>C. Однако известны другие первичные, но более редко встречающиеся мутации мтДНК, приводящие к развитию ОН Лебера, а также условно-патогенные мутации, патогенность которых в настоящее время не доказана в силу единичных случаев наблюдения, т.е. возможно, что в нашей выборке имеются случаи, причиной которых являются более редкие мутации митохондриального генома.

Возможно, это связано с тем, что наряду с генетически обусловленными случаями заболевания, в изученной группе имеется некоторое число фенокопий ОН, обусловленной неустановленными негенетическими причинами.

Тем не менее по данным литературы три первичные мутации являются причиной 90—95% всех случаев наследственной ОН Лебера. Однако в нашем исследовании «мажорные» мутации были выявлены у 48% пациентов с «лебероподобной» клинической картиной. Существенную разницу можно объяснить различными условиями отбора пациентов для исследования. Высокий процент определения вышеперечисленных мутаций был выявлен в работах, авторы которых включали только семейные случаи, по крайней мере, с двумя мужчинами с ОН, родственно связанными через одну здоровую женщину, с подтвержденной материнской передачей заболевания [14]. В наше исследование были включены пациенты с типичной клинической картиной ОН Лебера, вне зависимости от наличия семейного анамнеза. Вместе с тем из таблицы следует, что среди семейных случаев первичные мутации ОН Лебера встречаются у 4 пациентов из 5, т.е. в 80%.

Низкая доля выявления генетических изменений при аутосомно-доминантной ОН в нашей работе, возможно, связана с ограничением задач исследования и поиском мутаций только в «горячих» точках гена OPA1, наиболее часто встречающихся у больных аутосомно-доминантной ОН западно-европейской популяции. Вероятно, мутационная структура гена OPA1 у пациентов, проживающих на территории РФ, имеет отличия.

Общепринято, что точечные мутации гена OPA1 являются основной причиной развития аутосомно-доминантной ОН, однако, по данным литературы [15, 16, 18], эти изменения удается генетически верифицировать у 32—60% пациентов с аутосомно-доминантной ОН. Значительная доля отрицательных результатов при исследовании гена OPA1 подтверждает, что аутосомно-доминантная ОН — генетически гетерогенное заболевание. Идентифицированы мутации гена OPA3, ответственные за развитие аутосомно-доминантной ОН в сочетании с врожденной катарактой. Однако частота выявляемости этих изменений невелика и составляет 3% [7]. Другие локусы для этого заболевания — это OPA4 [12] и OPA5 [5], тем не менее гены для них еще неизвестны. Описаны также альтернативные типы генетических дефектов, например крупные структурные перестройки — делеция нескольких экзонов и даже всей кодирующей области гена OPA1, встречающиеся в 10% случаев [4, 8], которые не могут быть зарегистрированы в гетерозиготном состоянии методами традиционного секвенирования.

Таким образом, большое разнообразие мутаций в митохондриальном и ядерном геноме затрудняет поиск патологических изменений мтДНК и ядерной ДНК, являющихся причиной наследственных ОН. Однако при этом нельзя полностью исключить возможность того, что определенные спорадические ОН могут быть фенокопиями, вызванными негенетическими причинами, но имеющими схожие клинические характеристики.

Изучение наследственного анамнеза является важным компонентом обследования пациента, так как помогает в оценке возможного наследственного генеза ОН, а также в формировании адекватной стратегии молекулярно-генетического анализа. Однако в нашем исследовании среди пациентов с генетически подтвержденными наследственными ОН семейный анамнез по АЗН был установлен только у 33% (6) пациентов, что согласуется с данными многих авторов, которые также отмечают высокий процент спорадических случаев. Так, M. Ferré и соавт. показали, что среди 440 больных с генетически верифицированной наследственной ОН 48% пациентов с аутосомно-доминантной ОН и 10% с ОН Лебера не имели отягощенного семейного анамнеза [7].

Подобные результаты обусловлены некоторыми особенностями наследственных заболеваний, которые проявляются неполной пенетрантностью, в результате чего доля лиц, у которых обнаруживают проявление мутантного гена, среди всех лиц, унаследовавших этот ген, значительно варьирует. Так, в настоящее время известно, что только у 50% всех мужчин и 10% всех женщин с мутацией m.11778G>A развивается ОН Лебера в течение жизни [13, 17]. Таким образом, первичные мутации ОН Лебера являются необходимыми, но недостаточными условиями для повреждения зрительного нерва. Наследственной ОН свойственна также вариабельная экспрессия, характеризующаяся тем, что степень выраженности клинических проявлений гена широко варьирует от субклинических изменений функций зрения до полной слепоты. Поэтому родственники, имеющие незначительные нарушения зрительных функций, могут не знать о наличии патологии зрительного нерва.

Это приводит к тому, что роль наследственного фактора в развитии заболевания недооценивают и при исключении всех возможных причин ОН этиологию заболевания часто обозначают как неясную. Проведение современного молекулярно-генетического обследования при двусторонней ОН даже в отсутствие известного семейного анамнеза во многих случаях позволяет выявлять генез заболевания зрительного нерва.

1. Среди всех пациентов с клиническим диагнозом наследственной ОН этиология заболевания была генетически верифицирована у 36%. Возможно, это связано с тем, что в выборке имеются случаи, причиной которых являются более редкие мутации митохондриального генома, или с наличием фенокопий заболевания.

2. Низкая выявляемость генетических изменений при аутосомно-доминантной ОН в проведенном исследовании, возможно, обусловлена тем, что спектр мутаций гена OPA1 пациентов, проживающих на территории РФ, может отличаться от характерной для западно-европейской популяции или указывать на наличие других генетических механизмов.

3. Среди генетически верифицированных наследственных ОН в 66% случаев наследственный анамнез по АЗН не был выявлен.

4. Проведение современного молекулярно-генетического обследования пациента с двусторонней ОН даже в отсутствие известного семейного анамнеза во многих случаях позволяет выявлять генез заболевания зрительного нерва.