Введение
Эндометриоз — заболевание, характеризующееся ростом эндометриальной ткани вне полости матки, является одной из актуальных проблем акушерства и гинекологии. Наружным генитальным эндометриозом (НГЭ) болеют 7—10% женщин репродуктивного возраста. У большинства из них могут иметь место изнурительная тазовая боль, дисменорея, диспареуния, субфертильность или бесплодие. Избыточная продукция эстрадиола и резистентность к прогестерону относятся к основным критическим механизмам, приводящим к симптомам ЭМ. Наиболее точное установление диагноза происходит при лапароскопической оценке органов малого таза с последующим гистологическим исследованием. Лечение пациенток с эндометриозом комплексное, с применением гормональной терапии и хирургического вмешательства.
Большая потребность в неинвазивном диагнозе эндометриоза индуцировала попытки найти неинвазивные критерии для диагностики эндометриоза, которые предпринимаются в течение многих лет. Предложено несколько биомаркеров и панелей биомаркеров, однако практические результаты не достигнуты [1—6]. Отсутствие надежных неинвазивных критериев в диагностике эндометриоза связано с тем, что патогенез эндометриоза, несмотря на большое количество проводимых научных и клинических исследований, недостаточно изучен. В настоящее время развитие эндометриоза ассоциируется с комплексом патологических изменений, обусловленных генетическими/эпигенетическими, гормональными, иммунологическими и другими факторами [1, 7, 8]. Центральную роль в патогенезе эндометриоза может играть иммунная система, ответственная за обнаружение и удаление аномально растущей ткани [9, 10], что подтверждается результатами исследований, свидетельствующих об активном участии иммунной системы в развитии эндометриоза [11—13]. Ключевыми эффекторами при этом являются клетки и гуморальные факторы системы врожденного иммунитета. У пациенток с эндометриозом количество иммунных клеток, инфильтрирующих эндометриоидный очаг, изменяется по сравнению с содержанием в эндометрии женщин без эндометриоза. Кроме того, эти клетки часто проявляют пониженную цитотоксичность, с чем связывают нарушение способности элиминировать фрагменты эктопического эндометрия [14].
Предполагается, что увеличение продукции провоспалительных цитокинов и недостаточная способность иммунных клеток подавлять воспалительный ответ могут лежать в основе становления и развития эндометриоза. Показано, что увеличение уровня IL-6 в перитонеальной жидкости негативно коррелировало с цитолитической активностью NK-клеток [15]. Эктопические эндометриоидные поражения секретируют хемокины в окружающие их ткани, рекрутируя иммунные клетки, которые, в свою очередь, секретируют цитокины и факторы роста, такие как TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-17, EGF, FGF, and VEGF, локально создавая специфическое микроокружение, отражающееся в изменении их концентрации в ПЖ [16—18]. Поскольку иммуномодулирующие белки являются частью общей сигнальной сети, изменение их содержания может определяться и на системном уровне [19, 20].
Ранее нами исследованы особенности профилей растворимых белковых молекул и субпопуляционного состава лейкоцитов в перитонеальной жидкости (ПЖ) и периферической крови (ПК) женщин с эндометриозом [21—23]. Выявленное изменение соотношения нейтрофилов и лимфоцитов, а также содержания субпопуляций моноцитов в кровотоке позволяет предполагать наличие воспалительного процесса на системном уровне. В ПК обнаружено уменьшение доли T-регуляторных клеток, а в ПЖ — увеличение доли цитотоксических и регуляторных субпопуляций NK-клеток, что свидетельствует о нарушении регуляции иммунных реакций [22]. У женщин с более распространенными степенями эндометриоза в ПЖ обнаружены повышенные концентрации про- и противовоспалительных цитокинов (IL-6 и IL-10), изменение в их соотношении и увеличение уровней хемокинов IL-8, MCP-1 и MCP-1β, активирующих воспаление и влияющих на клеточный рост, что свидетельствует о выраженном локальном нарушении баланса иммунорегуляторных факторов [21]. Постепенно формируется представление об основных путях, обусловливающих степень распространенности заболевания, но остаются вопросы, в частности, о связи уровней цитокинов с субпопуляциями иммунных клеток, присутствующих в ПК и ПЖ, поскольку цитокины могут продуцироваться как клетками иммунной системы, так и клетками эндометриоидных очагов. Для лучшего понимания клеточных и молекулярных механизмов прогрессирования эндометриоза представляется важным выяснение особенности взаимосвязей между клетками и цитокинами на локальном и системном уровнях.
Цель исследования — выявить особенности взаимосвязей между содержанием клеток врожденного иммунитета и уровнем цитокинов в ПК и ПЖ при эндометриозе, отражающих степень распространенности процесса.
Материал и методы
В проспективное исследование включены 67 пациенток, наблюдавшихся и оперированных в гинекологическом отделении ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Группу исследования составили 40 пациенток с НГЭ. Диагноз эндометриоза установлен на основании интраоперационного обследования и подтвержден обзорным гистологическим исследованием удаленных очагов. Женщины с эндометриозом разделены на 2 подгруппы в соответствии со степенью распространения поражения: I—II степени (ЭМ-1, n=20) и III—IV степени (ЭМ-2, n=28). Контрольную группу (К) составили 19 женщин с неполной внутриматочной перегородкой, оперированных с применением лапароскопического доступа, генитального эндометриоза, воспалительных и пролиферативных гинекологических заболеваний.
Критерии включения в группу исследования: возраст пациенток 18—45 лет; подтвержденный диагноз НГЭ; подписанное информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: злокачественные новообразования; острые воспалительные заболевания органов малого таза; тяжелая сопутствующая экстрагенитальная патология.
Иммунологическое обследование проводилось у всех женщин основной группы перед оперативным удалением эндометриоидных очагов. Кровь для анализа забирали натощак из локтевой вены на 13—24-й день цикла, перитонеальную жидкость собирали после лапароскопического вхождения в брюшную полость. Для фенотипирования лимфоцитов использовали свежесобранную кровь и перитонеальную жидкость. Для исследования цитокинов плазму крови и перитонеальную жидкость замораживали при температуре –20 °C и хранили до проведения исследования при температуре –80 °C.
Фенотипирование лимфоцитов ПК и ПЖ осуществлялось методом проточной цитометрии с помощью моноклональных антител (мАт), («Becton, Dickinson and Company» и «eBioscience», США), меченных FITC, PE или АРС. Лимфоцитарный гейт, позволяющий исключить из анализа другие клетки крови, выявляли с помощью мАт к CD45 («Dako Inc.», Дания). Оценивалось содержание субпопуляций NK-клеток (CD56+CD16+), моноцитов (CD14+CD16+). Т-регуляторные клетки определяли, как клетки, экспрессирующие Т-клеточный рецептор типа γδ (TCRγδ), а также Трег с фенотипом CD4+CD25+CD127low/–. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Navios («Beckman Coulter, Inc.», США) с использованием программы Kaluza.
В плазме крови и перитонеальной жидкости определяли содержание различных растворимых субстанций (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IFN-g, TNFα, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, IP-10, CSF, GM-CSF, PDGF-bb, RANTES, Eotaxin, VEGF, FGF basic) мультиплексным методом с использованием стандартной 27-плексной тест-системы Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-plex Assay («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США), а изоформ TGF-β — с использованием 3-плексной тест-системы, на проточном лазерном иммуноанализаторе Bio-Plex 200 («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) и последующей обработкой полученных результатов с использованием приложения Bio-Plex Manager 6,0 Properties («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США).
Статистическая обработка данных проведена с использованием пакета Microsoft Office Excel 2010 и программы MedCalc v16.8. Проверку гипотезы о нормальном распределении осуществляли, используя критерии Колмогорова—Смирнова и W-тест Шапиро—Уилка. Данные в случае нормального распределения количественных переменных представлены средней арифметической величиной и стандартным отклонением (M(SD)). Для оценки статистической значимости различий в случае нормального распределения признаков использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. В случае отклонения распределения количественных признаков от нормального проверку статистических гипотез об отсутствии межгрупповых различий в нескольких группах осуществляли с помощью непараметрического критерия Краскела—Уоллиса с поправкой Бонферрони, при попарных сравнениях использовали U-критерий Манна—Уитни, различия считали значимыми при p≤0,05. Для оценки различий качественных признаков использовали критерий χ2 для сравнений двух групп и контроля, различия считали значимыми при p<0,025, попарное сравнение проводили с использованием точного критерия Фишера, различия считали значимыми при p≤0,05. Для выявления взаимосвязи между переменными рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена, связи считали статистически значимыми при p<0,05. Диагностическое значение параметров определяли с помощью ROC-анализа (Receiver Operating Characteristics).
Результаты
Результаты представляемого исследования особенностей взаимосвязи субпопуляционного состава и растворимых факторов в ПК и ПЖ обследованных групп женщин с НГЭ получены на основе опубликованных нами ранее первичных данных [21—23].
Клинико-анамнестическая характеристика и результаты определения субпопуляционного состава лимфоцитов и растворимых факторов в ПК и ПЖ исследуемых групп женщин с НГЭ представлены в табл. 1 и на рис. 1, 2.
Таблица 1. Клинико-анамнестическая характеристика женщин с эндометриозом
| Параметры | Группы | p-значение при χ2-критерии | p-значение при точном критерии Фишера | ||
| ЭМ-1 (n=20) | ЭМ-2 (n=28) | Контроль (n=19) | |||
| Возраст, годы M(SD) | 31,7 (7,6) | 32,9 (5,6) | 30,3 (3,2) | p>0,025 | — |
| Индекс массы тела, кг/м2, M(SD) | 23,4 (3,2) | 23,2 (4,8) | 21,8 (2,9) | p>0,025 | — |
| Средний возраст менархе, годы, M(SD) | 12,9 (0,5) | 12,7 (0,9) | 12,4 (0,7) | p>0,025 | — |
| Менструальный цикл (дни), M(SD) | 28,3 (6,2) | 27,7 (1,9) | 29,5 (1,9) | p>0,025 | — |
| Длительность менструации (дни), M(SD) | 5,25 (0,6) | 5,4 (0,8) | 5,8 (0,9) | p>0,025 | — |
| Боль внизу живота, не связанная с менструацией, n (%) | 8 (66,6) | 27 (96,4) | 0 | p<0,001 | p1–К=0,003 p2–К<0,001 p1–2<0,001 |
| Болезненные менструации, n (%) | 8 (66,6) | 14 (51,8) | 2 (13,3) | p>0,025 | p1–К=0,007 |
| Диспареуния, n (%) | 2 (16,6) | 10 (37,1) | 0 | p=0,021 | p2–К =0,003 p1–2 =0,05 |
| Беременность, n (%) | 5 (41,6) | 10 (37,1) | 11 (73,3) | p>0,025 | — |
| Роды, n (%) | 4 (33,3) | 8 (29,6) | 12(81,8) | p>0,025 | — |
| Бесплодие, | 4 (33,3) | 14 (51,8) | 0 | p=0,01 | p2–К<0,001 p1–2=0,041 |
| Гинекологическая патология в анамнезе, n (%) | 4 (33,3) | 3 (10,7) | 5 (31,3) | p>0,025 | — |
| Перенесенные операции по поводу НГЭ, n (%) | 2 (16,6) | 7 (25,9) | 0 | p>0,025 | — |
| Негинекологические операции, n (%) | 1 (8,3) | 4 (14,8) | 2 (12,5) | p>0,025 | — |
| Аллергические заболевания, n (%) | 0 | 9 (32,1) | 1 (6,8) | p=0,016 | p2–К=0,03 p1–2=0,006 |
| Заболевания органов системы дыхания, n (%) | 3 (25) | 3 (10,7) | 1 (6,5) | p>0,025 | — |
| Заболевания органов сердечно-сосудистой системы, n (%) | 1 (8,3) | 8 (29,6) | 2 (12,5) | p>0,025 | — |
| Заболевания органов желудочно-кишечного тракта, n (%) | 8 (66,6) | 15 (55,5) | 3 (18,75) | p>0,025 | — |
| Заболевания органов мочевыделительной системы, n (%) | 3 (25) | 9 (33,3) | 3 (18,75) | p>0,025 | — |
| Ожирение, n (%) | 2 (16,6) | 3 (10,7) | 0 | p>0,025 | — |
| Онкологические заболевания у близких родственников, n (%) | 4 (33,3) | 4 (14,2) | 0 | p>0,025 | — |
Примечание. Различия между группами оценивали с использованием критерия χ2 для сравнения двух групп и контроля, различия считали значимыми при p<0,025; попарное сравнение проводили с использованием точного критерия Фишера, различия считали значимыми при p≤0,05. 1 — подгруппа женщин с эндометриозом I—II степени (ЭМ-1), 2 — подгруппа женщин с эндометриозом III—IV степени (ЭМ-2). НГЭ — наружный генитальный эндометриоз.
Рис. 1. Лабораторные показатели женщин с наружным генитальным эндометриозом.
НФ — нейтрофилы; ЛФ — лимфоциты. Индекс НФ/ЛФ рассчитан по абсолютным значениям соответствующих показателей. Измеренные показатели представлены как отношение медиан в исследуемой группе к медианам в контрольной группе. Уровень равенства значений обозначен точечной линией. Отношения показателей женщин подгруппы ЭМ-1 представлены на пунктирной линии. На сплошной линии показаны отношения показателей женщин подгруппы ЭМ-2. p-значения представлены для числовых значений показателей при попарном сравнении по критерию Манна—Уитни (p<0,05) после предварительного множественного сравнения с помощью критерия Краскелла—Уоллиса (p<0,025). 1 — подгруппа женщин с эндометриозом I—II степени (ЭМ-1), 2 — подгруппа женщин с эндометриозом III—IV степени (ЭМ-2).
Рис. 2. Субпопуляционный состав лимфоцитов, моноцитов и содержание растворимых факторов в периферической крови и перитонеальной жидкости у женщин с наружным генитальным эндометриозом.
а, б — субпопуляционный состав лимфоцитов и содержание исследованных аналитов в периферической крови; в, г — субпопуляционный состав лимфоцитов и содержание исследованных аналитов в перитонеальной жидкости. Данные представлены как отношение медиан в исследуемой группе пациентов к медианам в контрольной группе. Красной линией показан уровень равенства значений. Сплошной линией показано отношение к контролю медиан в группе ЭМ-1, пунктиром — в группе ЭМ-2. p-значения представлены для числовых значений показателей при попарном сравнении по критерию Манна—Уитни (p<0,05) после предварительного множественного сравнения с помощью критерия Краскелла—Уоллиса (p<0,025). 1 — подгруппа женщин с эндометриозом I—II степени (ЭМ-1), 2 — подгруппа женщин с эндометриозом III—IV степени (ЭМ-2).
Обследованные женщины не отличались по возрасту, индексу массы тела, среднему возрасту менархе, времени менструации. Не выявлены различия между исследуемыми группами пациенток с НГЭ по частоте ожирения, заболеваний органов дыхательной, сердечно-сосудистой, мочевыделительной системы, желудочно-кишечного тракта, по частоте перенесенных негинекологических оперативных вмешательств (аппендэктомия), онкологических заболеваний у близких родственников. Отсутствуют различия по перенесенным ранее операциям по поводу НГЭ.
Наиболее выраженными жалобами у пациенток были боли внизу живота, не связанные с менструацией, диспареуния, а также болезненные менструации в первой у женщин группы ЭМ-1. Отсутствовали различия по количеству беременностей, но у женщин с ЭМ статистически значимо чаще диагностировалось бесплодие.
Как следует из данных рис. 1, у пациенток обеих подгрупп ЭМ-1 и ЭМ-2 по сравнению с контролем отмечалось статистически значимое увеличение содержания лейкоцитов, нейтрофилов, снижение доли лимфоцитов и увеличение нейтрофильно-лимфоцитарного индекса. У пациенток подгруппы ЭМ-2 отмечено увеличение абсолютного содержания моноцитов по сравнению с контролем, а по относительному содержанию моноцитов — с показателями пациенток подгруппы ЭМ-1.
На рис. 2 представлены результаты анализа субпопуляционного состава лимфоцитов в ПК и ПЖ, а также анализа содержания растворимых факторов в ПК и ПЖ обследованных пациенток.
В ПК не отмечены статистически значимые изменения в содержании всех исследованных растворимых аналитов и в субпопуляциях NK-клеток между подгруппами женщин с НГЭ, а также при сравнении с контролем. При этом статистически значимо меньше была доля Трег в обеих подгруппах по сравнению с контролем (p1–К=0,004, p2–к=0,004), ниже количество классических моноцитов (p1–К=0,04, p2–К=0,04) и выше количество промежуточных моноцитов (p1–К=0,03, p2–К=0,03).
В ПЖ женщин с НГЭ обеих подгрупп по сравнению с контролем были отмечены более высокие уровни IL-6 (p1–К=0,02, p2–К=0,02), IL-10 (p1–К=0,01, p2–К=0,01), IL-8 (p1–К=0,01, p2–К=0,01), кроме того, проявилась тенденция к увеличению уровней хемокинов MCP-1 (p1–К=0,06, p2–К=0,06) и MIP-1β (p1–К=0,06, p2–К=0,06). Для перечисленных цитокинов и хемокинов проведен ROC-анализ, который показал их высокую значимость для диагностики НГЭ I—II степени распространенности (MCP-1 и MIP-1β) и III—IV степени распространенности (IL-6, IL-8) [21]. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2. Параметры значимости оценки содержания растворимых аналитов перитонеальной жидкости для диагностики степени распространенности наружного генитального эндометриоза
| Параметр | Специфичность, % | Чувствительность, % | Прогностическая ценность результата, % | AUC, p-значение | |
| положительного | отрицательного | ||||
| НГЭ I—II степени распространенности | |||||
| MCP-1 | 71,4 | 81,8 | 81,8 | 71,4 | 0,805 p=0,0125 |
| MIP-1β | 85,7 | 81,8 | 90 | 75,0 | 0,903 p<0,0001 |
| НГЭ III—IV степени распространенности | |||||
| IL-6 | 71,4 | 87 | 90,9 | 62,5 | 0,823 p=0,0003 |
| IL-8 | 57,1 | 100 | 88,5 | 100 | 0,798 p=0,0062 |
Чтобы оценить, отражаются ли и в какой мере, особенности исследованного белкового состава ПЖ на субпопуляционном составе лимфоцитов в ПК, нами проведен корреляционный анализ между измеренными показателями, результаты которого представлены в табл. 3. В анализ включены все исследованные показатели без учета принадлежности к группе обследованных женщин.
Таблица 3. Значимые корреляционные связи между содержанием измеренных аналитов в перитонеальной жидкости и содержанием исследованных субпопуляций в периферической крови
| Цитокины | Субпопуляции лимфоцитов | |||||||||
| Лф | CD14+ | CD3+ | CD3+CD4+ | CD3+CD8+ | CD3+ CD56+16+ | CD56bright | CD56dim | CD200+ | MFI CD200+ | |
| IL-1β | 0,382 p=0,020 | 0,328 p=0,048 | ||||||||
| IL-1ra | 0,358 p=0,029 | 0,316 p=0,056 | ||||||||
| IL-2 | –0,35 p=0,037 | |||||||||
| IL-4 | 0,456 p=0,005 | 0,359 p=0,029 | ||||||||
| IL-6 | –0,421 p=0,011 | –0,538 p=0,0007 | ||||||||
| IL-8 | –0,423 p=0,011 | –0,38 p=0,022 | –0,322 p=0,05 | |||||||
| IL-9 | 0,36 p=0,051 | –0,364 p=0,032 | ||||||||
| IL-10 | 0,833 p=0,039 | –0,406 p=0,016 | ||||||||
| IL-12р70 | –0,375 p=0,041 | |||||||||
| IL-13 | 0,323 p=0,051 | 0,386 p=0,022 | ||||||||
| IFN-γ | –0,356 p=0,036 | |||||||||
| TNF-α | –0,328 p=0,051 | |||||||||
| MCP-1 | –0,382 p=0,024 | 0,377 p=0,026 | ||||||||
| MIP-1β | 0,402 p=0,014 | –0,336 p=0,048 | –0,367 p=0,030 | |||||||
| Eotaxin | 0,326 p=0,049 | |||||||||
| RANTES | 0,426 p=0,009 | 0,334 p=0,044 | ||||||||
| IP-10 | –0,372 p=0,025 | |||||||||
| FGF | 0,369 p=0,025 | 0,318 p=0,055 | ||||||||
| TGF-β1 | 0,404 p=0,009 | 0,417 p=0,010 | ||||||||
| G-GSF | 0,385 p=0,022 | |||||||||
Примечание. Различия оценивали с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена и признавали значимыми при p<0,05.
Как следует из данных табл. 3, сильная прямая корреляционная связь выявлена только между уровнем в ПЖ регуляторного IL-10 и содержанием в ПК цитотоксических Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+CD8+. В остальных случаях корреляций, представленных в табл. 3, выявлена значимая связь средней силы (от 0,3 до 0,7). Содержание в ПК общего количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-лимфоцитов с хелперной функцией и TNK-лимфоцитов, NK-клеток с фенотипом CD56bright прямо связаны с уровнем в ПЖ IL-1β, IL-1ra, IL-4, Eotaxin, RANTES, FGF, G-GSF, TGF-β1. Прямая корреляционная связь с уровнем TGF-β1 выявлена для лимфоцитов с фенотипом CD200+ и уровнем экспрессии молекулы CD200, что согласуется с представлением о локальном формировании Т-лимфоцитов с естественной регуляторной функцией с помощью CD200+ -лимфоцитов через продукцию TGF-β1. Однако содержание лимфоцитов с фенотипом CD200+ и уровень экспрессии молекулы CD200 обратно коррелируют с уровнем в ПЖ IL-2, IL-6, IL-8, MIP-1β, IP-10, TNF-α. Уровень NK-клеток с фенотипом CD56dim в ПК обратно коррелирует с уровнем MIP-1β, а TNK-клеток — обратно с уровнем IL-8, IL-9, IL-10, ИФН-γ, MCP-1, MIP-1β в ПЖ. В то же время содержание в ПК классических моноцитов прямо коррелирует с уровнем IL-9 и обратно — с уровнем провоспалительного IL-12р70 в ПЖ.
Следовательно, выявленное наличие особенностей связи субпопуляционного состава лимфоцитов ПК с концентрацией цитокинов в ПЖ женщин с эндометриозом подтверждает взаимозависимость системного и локального иммунитета.
Для ответа на вопрос, коррелируют ли одни и те же показатели в ПК с теми же показателями в ПЖ, проведен анализ, результаты которого представлены в табл. 4. Так, выявлена значимая связь средней силы между содержанием в ПЖ и в ПК киллерных клеток, несущих рецепторы Т-лимфоцитов (CD3+CD56+16+ и CD56+TCRγδ+), регуляторных клеток (Трег и TCRγδ+), а также между уровнями изоформы фактора роста TGF-β3. Значимая корреляционная связь между другими показателями была слабой или отсутствовала.
Таблица 4. Значимые корреляционные связи между содержанием измеренных аналитов и исследованных субпопуляций в периферической крови и перитонеальной жидкости
| Показатель в ПК и ПЖ | Коэффициент корреляции | p-значение |
| CD3+CD56+16+ | 0,312 | 0,0441 |
| CD56+TCRγδ+ | 0,320 | 0,0386 |
| TCRγδ+ | 0,365 | 0,0161 |
| Трег | 0,456 | 0,0021 |
| TGF-β3 | 0,307 | 0,0425 |
Примечание. ПК — периферическая кровь; ПЖ — перитонеальная жидкость.
Исходя из результатов анализа, представленных в табл. 3, 4, можно предположить, что связь между содержанием растворимых молекул и субпопуляций в ПК и ПЖ женщин с разной степенью распространенности эндометриоидных гетеротопий может различаться. Поскольку большое значение имеет выявление неинвазивных маркеров распространенности процесса, нами проведен анализ особенностей корреляционных связей между содержанием субпопуляций лимфоцитов/моноцитов и уровнем растворимых факторов в ПК пациенток с НГЭ, результаты которого представлены в табл. 5. В ПК пациенток подгруппы содержание ЭМ-1 CD3+CD4+-лимфоцитов с хелперной активностью прямо коррелировало с уровнем IL-13 и обратно с уровнем TGF-3 и TNFα; содержание обладающих цитотоксической функцией CD3+CD8+-лимфоцитов имело сильную обратную связь с уровнем IL-5 и IL-8. Содержание NK-клеток (CD3–CD56+CD16+) обратно коррелировало с уровнем IL-13. Выявлена обратная связь CD56brightCD16dim-субпопуляции NK-клеток с концентрацией большого числа факторов роста и интерлейкинов (G-CSF, GM-CSF, MIP-1α, MIP-1β, VEGF, IL-12, IL-15, IL-17, IL-2, IL-5, IL-6, IL-9), тогда как субпопуляция CD56dimCD16bright обратно связана только с IL-13. Для CD200+-клеток установлена прямая связь с уровнем G-CSF и IFN-γ.
Таблица 5. Значимые корреляционные связи между содержанием субпопуляций и аналитов в перитонеальной жидкости обследованных женщин
| Показатели | Контрольная группа | Подгруппа 1 | Подгруппа 2 | |||||||||||||||||
| CD14+ CD16+ | CD14++ | CD16++ | CD3+CD56 +CD16+ | CD56+ TCRγδ+ | CD56dim CD16br | CD16++ | CD3+ | CD3+ CD4+ | CD3+ CD8+ | CD3—CD 56+CD6+ | CD56br CD16dim | CD56dim CD16br | CD200+ | Трег | CD14++ | CD16++ | CD3+ CD4+ | CD56br CD16dim | CD200+ | |
| IL-8 | 0,9 0,037 | –0,9 0,037 | 0,619 0,006 | |||||||||||||||||
| MCP-1 | 0,491 0,05 | |||||||||||||||||||
| MIP-1a | 0,928 0,008 | –0,735 0,016 | 0,75 0,013 | 0,633 0,005 | ||||||||||||||||
| MIP-1b | –0,812 0,05 | –0,877 0,001 | ||||||||||||||||||
| IP-10 | 0,87 0,05 | 0,9 0,037 | 0,782 0,008 | |||||||||||||||||
| IL-7 | –0,82 0,089 | 0,618 0,05 | 0,761 <0,0001 | |||||||||||||||||
| IL-9 | 0,829 0,04 | –0,73 0,017 | 0,506 0,01 | |||||||||||||||||
| G-CSF | –0,812 0,05 | –0,615 0,05 | 0,718 0,019 | 0,62 0,05 | 0,822 <0,0001 | |||||||||||||||
| GM-CSF | –0,692 0,03 | 0,471 0,05 | 0,56 0,016 | |||||||||||||||||
| PDGF-bb | –0,721 0,019 | 0,503 0,028 | ||||||||||||||||||
| FGFbasic | 0,87 0,05 | 0,446 0,05 | 0,619 0,06 | |||||||||||||||||
| VEGF | 0,9 0,037 | –0,751 0,01 | ||||||||||||||||||
| TGF-β1 | 0,762 0,017 | |||||||||||||||||||
| TGF-β2 | 0,65 0,05 | 0,63 0,028 | –0,592 0,043 | |||||||||||||||||
| TGF-β3 | -0,735 0,007 | –0,668 0,02 | 0,765 0,004 | –0,674 0,016 | ||||||||||||||||
| IL-1b | 0,95 0,013 | 0,482 0,05 | 0,548 0,019 | |||||||||||||||||
| IL-1ra | 0,886 0,019 | 0,867 0,001 | 0,546 0,019 | |||||||||||||||||
| IL-2 | 0,98 0,005 | –0,694 0,026 | 0,439 0,04 | |||||||||||||||||
| IL-4 | 0,98 0,005 | –0,821 0,045 | 0,819 0,004 | 0,642 0,004 | ||||||||||||||||
| IL-5 | –0,745 0,013 | –1 <0,0001 | –0,742 0,014 | 0,51 0,037 | 0,62 0,005 | |||||||||||||||
| IL-6 | –0,837 0,003 | 0,582 0,014 | ||||||||||||||||||
| IL-10 | 0,87 0,05 | |||||||||||||||||||
| IL-12(р70) | –0,821 0,004 | 0,566 0,014 | ||||||||||||||||||
| IL-13 | 0,676 0,032 | -0.635 0.048 | –0,635 0,048 | |||||||||||||||||
| IL-15 | –0,654 0,04 | |||||||||||||||||||
| IL-17 | 0,9 0,037 | –0,625 0,05 | 0,661 0,003 | |||||||||||||||||
| IFN-γ | 0,758 0,011 | 0,812 0,05 | 0,624 0,05 | 0,541 0,03 | ||||||||||||||||
| TNF-α | 0,98 0,005 | –0,683 0,03 | –0,72 0,02 | 0,474 0,05 | ||||||||||||||||
Примечание. Подгруппа 1 — с НГЭ I—II степени распространенности; подгруппа 2 — с НГЭ III—IV степени распространенности; CD14++ — моноциты классические; CD16++ — моноциты неклассические; CD14+CD16+ — моноциты промежуточные; НГЭ — наружный генитальный эндометриоз. Различия оценивали с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена и признавали значимыми при p<0,05. Данные представлены как коэффициент Спирмена и p-значение.
В ПК женщин подгруппы ЭМ-2 выявлена связь средней силы между содержанием CD3+CD4+-лимфоцитов и уровнями факторов роста FGFb и PDGF. Содержание субпопуляции CD56brightCD16dim-NK-клеток прямо коррелировало с уровнями Gm-CSF, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-9. Содержание клеток, экспрессирующих антиген CD200, прямо коррелировало с широким спектром цитокинов: хемокинов (IL-8, MIP-1a), факторов роста (IL-7, G-CSF, GM-CSF, FGFb), интерлейкинов (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-12(р70), IL-17, TNF-α).
Между содержанием субпопуляции классических моноцитов и уровнем растворимых белковых молекул в ПК женщин с НГЭ выявлены значимые связи средней силы только с уровнем факторов роста TGF-β2 и TGF-β3, тогда как в ПК женщин контрольной группы определены сильные прямые связи между количеством классических моноцитов и рядом растворимых факторов: FGFbasic, IL-10, IL-17, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-8, TNFα, VEGF (r=0,9, p=0,037). В совокупности эти данные демонстрируют наличие взаимосвязи содержания классических моноцитов с уровнем большого числа растворимых иммунорегуляторных молекул в ПК женщин контрольной группы, меньше у пациенток с III—IV стадией ЭМ, а также отсутствие подобной связи в ПК пациенток с I—II стадией ЭМ.
Таким образом, в ПК женщин в группах с разной степенью распространенности ЭМ отмечаются сильные корреляционные связи между клеточными субпопуляциями с разной функциональной направленностью и разными подгруппами растворимых иммунорегуляторных молекул.
Обсуждение
Проведен сравнительный анализ результатов нашего исследования активности иммунных механизмов в ПК и ПЖ женщин с эндометриозом, о которой судили, с одной стороны, по количеству и соотношению субпопуляций иммунных клеток, а с другой, по уровню продуцируемых ими растворимых молекул. Предполагается, что сывороточные концентрации иммунорегуляторных факторов отражают системную иммунную активность, тогда как их уровни в ПЖ в большей степени связаны с локальными процессами [8]. Выявленное нами изменение ряда параметров позволило сделать вывод о наличии воспалительного процесса у женщин с эндометриозом как на локальном, так и на системном уровнях [21, 22].
Установление статистически значимого различия в содержании лейкоцитов, соотношении нейтрофилов и лимфоцитов, изменении в соотношении субпопуляций моноцитов в ПК, по-видимому, свидетельствует о воспалительном процессе у женщин с распространенной степенью эндометриоза. Изменение в количестве и соотношении субпопуляций моноцитов ассоциируется с воспалительным процессом или опухолевым ростом [24, 25]. Возможно, изменение соотношения субпопуляций этих клеток в ПК при эндометриозе связано с хроническим воспалительным процессом, а снижение количества классических моноцитов объясняется перемещением их в ткани, где они дифференцируются в макрофаги [26], которые удаляют апоптотические тела и стимулируют ангиогенез [27].
При эндометриозе в ПЖ среди моноцитов наблюдалось увеличение доли менее зрелых клеток (промежуточных CD14highCD16high и неклассических CD14lowCD16high-моноцитов) и отмечена явная тенденция к уменьшению по сравнению с контролем субпопуляции Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+CD127low/–, характеризующихся регуляторной активностью (Т-рег). Предполагается, что Т-рег играют важную роль в патогенезе эндометриоза и с ними связано нарушение регуляции иммунного ответа [28—30]. Кроме того, выявляется тенденция к повышению содержания Т-киллерных лимфоцитов (NKT-клеток), ответственных за индукцию и поддержание хронического воспаления.
В ПЖ женщин с эндометриозом наблюдалось статистически значимое увеличение уровней хемокинов IL-8, MCP-1 и MCP-1β по отношению к содержанию в контроле. Активное влияние хемокинов (IL-8) на развитие эндометриоза проявляется в привлечении нейтрофилов из ПК, активации ангиогенеза и воспаления, влиянии на процессы клеточного роста, привлечении моноцитов/макрофагов и последующей активации (MCP-1). В литературе присутствуют данные о том, что в ПЖ женщин с эндометриозом обнаружены более высокие концентрации хемокинов IL-8, MCP-1, MIP-3β независимо от стадии заболевания [31]. Результаты наших исследований, согласно данным ROC-анализа, показали высокую диагностическую значимость определения концентрации MCP-1 и MIP-1β в ПЖ женщин с эндометриозом I—II стадии, а IL-8 — III—IV стадии [21].
Статистически значимое увеличение содержания в ПЖ провоспалительного IL-6 и противовоспалительного IL-10 цитокинов выявлено у женщин с эндометриозом обеих подгрупп при сравнении с контролем. Эти данные согласуются с результатами других исследователей, которые также нашли увеличение содержания IL-6 у женщин с эндометриозом [15, 32, 33]. Одновременное повышение содержания провоспалительного IL-6 и противовоспалительного IL-10, выявленное нами, может свидетельствовать об их взаимном влиянии на клетки иммунной системы и хронизацию воспалительного процесса в брюшной полости [34]. Показано, что увеличенные уровни IL-6 в ПЖ негативно коррелировали с цитолитической активностью NK-клеток [15]. Мы выявили сильную обратную корреляцию уровня IL-6 с регуляторной субпопуляцией NK-клеток в ПЖ женщин на ранней стадии заболевания, но прямую корреляцию в группе с распространенной степенью эндометриоза.
На основе результатов проведенного нами корреляционного анализа при выяснении вопроса о том, в какой степени особенности исследованного белкового состава ПЖ отражаются на субпопуляционном составе лимфоцитов в ПК, выявлено большее количество взаимосвязей (см. табл. 3). Между содержанием в ПК общего количества лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Т-лимфоцитов с хелперной функцией, TNK-лимфоцитов и NK-клеток установлена значимая прямая связь средней силы с уровнем в ПЖ RANTES, FGF, G-GSF, TGF-β1. Сильная прямая корреляционная связь показана между содержанием в ПК цитотоксических Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+CD8+ и уровнем в ПЖ регуляторного IL-10. Таким образом, прослеживается взаимосвязь между уровнями в ПЖ ряда факторов роста и противовоспалительного IL-10 и содержанием в ПК цитотоксических T-клеток и NK-клеток.
Прямая корреляционная связь выявлена между количеством в ПК лимфоцитов с фенотипом CD200+, а также уровнем экспрессии молекулы CD200 и уровнем изоформы TGF-β1, но обратная с уровнем в ПЖ цитокинов (IL-2, IL-6, IL-8, MIP-1β, IP-10, TNF-α), концентрация которых в ПЖ увеличивается при воспалении. Взаимосвязь содержания CD200+-лимфоцитов в ПК и уровня TGF-β1 в ПЖ может объясняться формированием в брюшной полости Т-лимфоцитов с естественной регуляторной функцией с помощью CD200+-лимфоцитов через продукцию TGF-β1. Трансмембранный иммунорегуляторный гликопротеин CD200 широко представлен на клетках многих типов, а его рецептор CD200R в основном экспрессируется на миелоидных и лимфоидных клетках. Взаимодействие молекул CD200 и CD200R приводит к супрессии эффекторных иммунных клеток и подавлению воспалительного процесса, усиливая синтез цитокинов IL-10 и TGF-β, способствует формированию Th2-зависимого противовоспалительного окружения и иммунологической толерантности при трансплантации и беременности [35].
Данные о прямой корреляции содержания в ПК классических моноцитов с уровнем IL-9 и обратной — с уровнем провоспалительного IL-12р70 в ПЖ могут быть связаны с усиленной потребностью в зрелых моноцитах, которые превращаются в макрофаги на локальном уровне, обусловленной формированием эндометриоидных очагов и/или воспалительным процессом.
Корреляционный анализ, проведенный для изучения взаимозависимости между количеством лимфоцитов различных субпопуляций, а также уровнями исследованных растворимых факторов, содержащихся в ПК и ПЖ женщин с эндометриозом, показал наличие статистически значимой связи средней силы между содержанием в ПЖ и ПК киллерных клеток, несущих рецепторы Т-лимфоцитов (CD3+CD56+16+ и CD56+TCRγδ+), и регуляторных клеток (Трег и TCRγδ+). Среди растворимых белковых факторов статистически значимая связь средней силы выявлена только между уровнями в ПК и ПЖ изоформы TGF-β3. Отсутствие статистически значимой корреляционной связи между другими показателями, вероятно, можно объяснить отсутствием значительных нарушений связей в цитокиновой сети, которые приводили бы к более выраженному системному воспалительному состоянию при эндометриозе. Представленные данные подтверждают вывод о том, что нарушение в содержании растворимых факторов в большей степени проявляется локально, меньше отражаясь на системном уровне.
Для выяснения вопроса о том, имеются ли различия во взаимосвязи иммунных клеток и иммунорегуляторных молекул на системном уровне, проведено исследование корреляционных связей между содержанием различных субпопуляций лимфоцитов и моноцитов и уровнем растворимых факторов в ПК женщин на разных стадиях эндометриоза. В ПК женщин на ранних стадиях развития эндометриоза для субпопуляции Т-лимфоцитов с хелперной активностью (CD3+CD4+) отмечена прямая связь с уровнем IL-13 и обратная — с TGF-b3 и TNF-α; тогда как цитотоксические CD3+CD8+-лимфоциты имели сильную обратную связь с IL-5 и IL-8. При этом для содержания цитотоксической субпопуляции CD56dimCD16bright-NK-клеток отмечена обратная связь с уровнем IL-13, а количество CD56brightCD16dim-клеток с регуляторной функцией обратно коррелировало с содержанием ряда факторов роста и интерлейкинов (G-CSF, Gm-CSF, MIP-1α, MIP-1β, VEGF, IL-12, IL-15, IL-17, IL-2, IL-5, IL-6, IL-9). Сильная прямая корреляционная связь отмечена для регуляторных Т-лимфоцитов и MIP-1α, IP-10, IL-7, G-CSF, IL-1ra, IL-4. Статистически значимая связь клеток, экспрессирующих CD200, установлена только с фактором роста G-CSF. Таким образом, наблюдается разнонаправленная корреляционная связь на системном уровне между содержанием цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток и концентрацией ряда факторов роста и цитокинов.
В ПК женщин с эндометриозом III—IV степени выявлена прямая связь средней силы между содержанием CD3+CD4+-лимфоцитов и уровнями факторов роста FGFb и PDGF. Субпопуляция CD56brightCD16dim-NK-клеток прямо коррелировала с уровнями Gm-CSF, IL-1β, IL-5, IL-6, IL-9. Прямая корреляционная связь отмечена для клеток, экспрессирующих CD200, с большим спектром растворимых факторов (MIP-1α, G-CSF, Gm-CSF, FGF-basic, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-7, IL-8, IL-12, IL-17, TNF-a).
Полученные данные говорят о существенных различиях взаимосвязей субпопуляционного состава лимфоцитов и измеренных растворимых белковых молекул в ПК женщин на разных стадиях развития эндометриоза. Этот вывод подтверждается результатом исследования корреляционных связей клеток, экспрессирующих антиген CD200, с уровнями цитокинов. Количество экспрессирующих CD200 лимфоцитов в ПК женщин ЭМ-1 подгруппы прямо коррелировало только с G-CSF и IFN-γ, тогда как в подгруппе ЭМ-2 наблюдалась прямая корреляционная связь с широким спектром цитокинов: хемокинов (IL-8, MIP-1a), факторов роста (IL-7, G-CSF, Gm-CSF, FGFb), интерлейкинов (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-12(р70), IL-17, TNF-α).
При изучении корреляционных связей между содержанием субпопуляции классических моноцитов и уровнем растворимых белковых молекул в ПК получены данные, которые в совокупности демонстрируют наличие взаимосвязи содержания классических моноцитов с уровнем большого спектра растворимых иммунорегуляторных молекул в ПК женщин контрольной группы, меньшего у пациенток с III—IV стадией эндометриоза, и отсутствие подобной связи в ПК пациенток с I—II стадией эндометриоза. По-видимому, на ранних стадиях развития эндометриоза происходит существенное нарушение корреляционных связей между моноцитами и растворимыми факторами на системном уровне.
Отсутствие связей уровней исследованных клеток и растворимых факторов в ПК пациенток с ранней стадией эндометриоза может указывать на дисфункцию врожденного звена иммунной системы, способствующую развитию гетеротопий, в то время как наличие связей классических моноцитов с уровнем факторов роста у пациенток с распространенным процессом — на хронизацию процесса и ее последствия.
Заключение
В результате проведенного исследования взаимосвязей между содержанием субпопуляций клеток врожденного иммунитета и уровнем цитокинов в периферической крови и перитонеальной жидкости женщин с эндометриозом выявлены признаки наличия воспалительного процесса. Изменения в соотношении регуляторных и цитотоксических субпопуляций клеток и белкового профиля растворимых молекул в большей степени проявляется на локальном уровне, чем на системном, что подтверждается наличием связей субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови с концентрацией цитокинов в перитонеальной жидкости. На системном уровне у женщин с разной степенью распространенности эндометриоза связь между содержанием цитотоксических Т-лимфоцитов и NK-клеток и концентрацией ряда факторов роста и цитокинов является существенной и разнонаправленной. Кроме того, на ранних стадиях развития эндометриоза на системном уровне происходит существенное изменение корреляционных связей между содержанием моноцитов и растворимых факторов периферической крови, приводящее в дальнейшем к хронизации воспалительного процесса.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Кречетова Л.В., Адамян Л.В.
Сбор и обработка материала — Короткова Т.Д., Инвияева Е.В.
Статистическая обработка — Кречетова Л.В.
Написание текста — Кречетова Л.В., Инвияева Е.В.
Редактирование — Ванько Л.В., Адамян Л.В.
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания 2021 8-А21.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.