Колоректальный рак (КРР) является третьим по распространенности злокачественным новообразованием в мире, на долю которого приходится примерно 10% всех онкологических диагнозов и смертей. В настоящее время КРР более всего распространен в развитых странах, однако рост заболеваемости сегодня отмечается и в развивающихся регионах [1]. Широкомасштабный популяционный скрининг людей старше 50 лет способствовал стабилизации распространенности КРР в этой возрастной группе, в то время как заболеваемость КРР у пациентов моложе 50 лет продолжает расти [1]. В России в 2021 г. впервые выявили рак ободочной кишки у 33 378 больных. По данным, опубликованным в 2022 г., это заболевание остается одним из ведущих локализаций в общей структуре онкологической заболеваемости у обоих полов (7,1%) [2]. Существует несколько причин, приводящих к возникновению КРР. Например, он может быть генетически детерминирован, а возникает вследствие хронического воспаления кишечника (до 5% всех опухолей) [3]. Считается, что длительное воспаление вызывает состояние хронического окислительного стресса, что может приводить к окислительному повреждению ДНК и провоцировать развитие неопластических нарушений в слизистой оболочке кишки [4]. При выявлении КРР на ранних стадиях (I и II) с помощью скрининговых процедур, таких как колоноскопия, 5-летняя выживаемость составляет уже 90%, а на более поздних стадиях (IV) снижается примерно до 13% [5].

Воздействие представителей микробиоты на развитие КРР стало очевидным в недавнее время. По данным PubMed, при запросе gut microbiota and cancer отмечается бурный рост числа публикаций в последние годы. К примеру, в 2017 г. было опубликовано 611 материалов, а в 2022 г. — уже 1854. Множество исследований посвящено изучению роли определенных кишечных микроорганизмов в развитии злокачественных новообразований толстой кишки. Считается, что характеристика состава кишечной микробиоты может не только дать дополнительную информацию для уточняющей диагностики КРР, но и войти в число методов скрининга опухолей данной локализации. Предполагают, что коррекция состава микробиоты с применением пре-, про- и антибиотиков может быть использована для профилактики возникновения и прогрессии неопластических нарушений в кишечнике. Вместе с совершенствованием методики скрининга это может снизить показатели заболеваемости КРР и смертности больных. Таким образом, всесторонне и глубокое изучение кишечного микробиома как фактора, потенциально влияющего на возникновение КРР, и разработка на этой основе эффективной диагностической стратегии для раннего выявления данного заболевания являются актуальными и перспективными.

Нормальный состав микробиоты кишечника человека

Огромное влияние на развитие исследований, связанных с микробиотой, оказали два события: проект «Микробиом человека» (Human Microbiome Project) и открытие секвенирования и метаболомики. Цель проекта, проведенного в 2007—2008 гг. в США, заключалась в расшифровке 900 полных геномов бактерий, в создании подробной карты микробиома, населяющего организм 300 здоровых добровольцев. Геном человека содержит около 22 000 генов. По оценкам проекта, бактерии наделяют организм человека еще 8 млн генов. На основании данных этого исследования было сделано заключение, что основными типами микроорганизмов в составе микробиоты являются строгие анаэробы Bacteroidetes и Firmicutes, превосходящие по численности аэробные микроорганизмы в 100—1000 раз. Факультативные анаэробы составляют менее 1% микробиоты и в основном представлены семейством Enterobacteriaceae и родами Enterococcus и Lactobacillus [6, 7].

Современные методы определения состава микробиоты кишечника

В общей методологии изучения кишечной микробиоты культуральный метод сегодня отходит на второй план, в связи с тем что лишь небольшая фракция этих бактерий поддается культивированию. В настоящее время для характеристики микробиома широко используются молекулярно-генетические технологии и масс-спектрометрия [8]. В числе молекулярно-генетических методов наиболее распространенными являются секвенирование гена 16S рибосомной РНК (рРНК) и секвенирование всего генома. Секвенирование — это процесс, который используется для определения нуклеотидных последовательностей выделенных чистых культур. Этот ген выбран как универсальный маркер для видовой идентификации: он имеется в геномах всех прокариот и обладает относительно малой изменчивостью. Прочтение последовательности осуществляется с помощью постановки ПЦР с праймерами под ген 16S рРНК с последующей очисткой ДНК и секвенированием. Далее последовательность сравнивается с компьютерной базой данных с использованием алгоритма BLAST [9]. Именно этот метод применяют чаще всего, хотя он, как и другие, имеет свои преимущества и недостатки. В настоящий момент нет единого стандартизированного подхода, который можно рекомендовать для оценки микробиоты толстого кишечника. Известно, что наибольшее число бактерий локализуется именно в толстом кишечнике. Количество просветной микрофлоры толстой кишки составляет 1010—1011 КОЕ/г фекалий. В связи с этим возникает вопрос: какие образцы использовать для проведения исследования? Анализ кала — самый простой способ, преимущества которого заключаются в простоте выполнения, неинвазивности и информативности. Однако, как выяснилось, микробиом кала неточно соответствует микробиому кишечника [10—12]. Каловые массы более густо заселены различной микрофлорой в сравнении с участками слизистой оболочки кишечника [13]. Кроме того, поскольку образцы кала собираются пациентами, существует риск потери критически важной микробиоты из-за неправильного хранения и задержки при транспортировке [14]. В результате было показано, что образцы ткани слизистой оболочки толстой кишки являются лучшим методом отбора проб для определения состава кишечного микробиома у пациентов с КРР [15, 16]. Следует отметить, что такой метод из-за его инвазивности невозможно использовать для скрининга и последующего отслеживания динамики. Кроме того, слабительные препараты, вводимые перед колоноскопией, также могут изменять микробиоту кишечника [17].

Другим способом изучения анализа кишечной микробиоты является метаболомика. Такой подход позволяет определить низкомолекулярные метаболиты во взятых из кишечника образцах, которые отражают особенности жизнедеятельности микрофлоры и ее взаимодействия с организмом хозяина, что может помочь нашему пониманию изменений, связанных с возникновением злокачественного поражения в толстой кишке [18]. Поскольку метаболиты кишечной микробиоты влияют на микроокружение опухоли [19], это может стать основой для характеристики профиля метаболитов не только для раннего выявления КРР, но и для разработки способов его профилактики, а также поиска биомаркеров рецидива с целью своевременной коррекции тактики лечения.

Дисбиоз как одна из причин возникновения КРР

Различные исследования демонстрируют, что генетические мутации и эпигенетические модификации в ключевых генах, таких как гены-супрессоры опухоли, протоонкогены и гены репарации ДНК, приводят к тому, что нормальный эпителий толстой кишки претерпевает злокачественную трансформацию и становится опухолевым [20]. Образ жизни, включающий в себя так называемую западную диету, алкоголь, курение, а также такие заболевания, как ожирение, инсулинорезистентность и сахарный диабет, являются значимыми факторами риска для развития спорадического КРР [21]. Кишечная микробиота не только непосредственно участвует в пищеварении и усвоении питательных веществ, но и играет жизненно важную роль в поддержании иммунитета, защите от экзогенных патогенов, формировании эпителия здорового кишечника и общем гомеостазе слизистой оболочки. Дисбиоз кишечника, вызванный дисбалансом между симбиотическими и условно-патогенными микробами, приводит к соответствующим функциональным нарушениям, что может провоцировать развитие определенных заболеваний [22]. Факторы окружающей среды, генетические особенности пациента, рацион питания и образ жизни — все это может способствовать развитию в кишечнике дисбиоза, который приводит к нарушению физиологических процессов и создает условия для возникновения целого ряда заболеваний, включая КРР.

Дисбиоз кишечника подразделяют на три типа: 1) потеря полезных микробов; 2) распространение патогенных микробов; 3) потеря микробного разнообразия. В ряде исследований показано, что у пациентов с аденомой толстой кишки изменения в микробиоме кишечника были аналогичны нарушениям у пациентов, у которых установлен диагноз КРР. Так, например, у больных с новообразованиями содержание бактерий группы Proteobacteria было значительно больше, а бактерий отдела Bacteroidetes — меньше, чем у здоровых лиц. Эти данные расценивают как одно из прямых указаний на то, что дисбиоз кишечной микробиоты может способствовать образованию опухолей в толстой кишке [23, 24]. B. Flemer и соавт. [25] с использованием секвенирования 16S рРНК изучили состав микробиоты в толстой кишке (в области роста опухоли и на здоровых участках кишечника) у 59 пациентов, перенесших хирургический этап лечения по поводу КРР, у 21 больного с полипами толстой кишки и у 59 лиц без признаков заболевания. Помимо этого, у обследуемых осуществлялся забор участка слизистой оболочки толстой кишки для уточнения экспрессии специфических генов методом ПЦР в реальном времени. Согласно полученным данным, у пациентов с КРР в составе микробиоты в большом количестве присутствовала Prevotella, а количество Bacteroidetes и Firmicutes было недостаточным. В ряде других исследований показано, что у больных КРР такие бактерии, как F.nucleatum, S.gallolyticus, E.coli, E.faecalis и B.fragilis, более распространены, а вот количество клостридий, розебурии и бифидобактерий снижено [9, 26]. В исследовании, выполненном H. Tsoi и соавт. [27], в 112 образцах кала больных КРР содержание P. anaerobius оказалось выше, чем у здоровых лиц (оценка проводилась методом ПЦР). В рамках экспериментальной части работы исследователи заселяли этим микроорганизмом кишечник мышей, которым предварительно давали антибиотики широкого спектра действия с последующей однократной дотацией азоксиметана для инициирования развития опухоли в толстом кишечнике. Далее ткань толстого кишечника оценивали гистологически. У той когорты мышей, чей кишечник заселяли P.anaerobius, наблюдалась более высокая частота дисплазии кишечника (63%) по сравнению с мышами из контрольной группы (8,3%; p<0,01). P.anaerobius в основном колонизировали именно толстый кишечник. Клетки толстой кишки, подвергшиеся воздействию P.anaerobius, имели значительно более высокие уровни пролиферации, чем контрольные клетки.

Механизмы влияния микрофлоры кишечника на возникновение КРР

Рассматривается несколько возможных факторов и механизмов, благодаря которым определенные микроорганизмы могут провоцировать зарождение опухолевого процесса (рисунок). При этом данный вопрос остается все еще дискутабельным. Воссоздание фекальной микробиоты, характерной для пациентов с КРР, на мышиных гнотобиотических моделях (мыши ApcMin/+, модель семейного аденоматозного полипоза человека) [28] показало усиление пролиферации эпителиальных клеток толстой кишки и ускорение канцерогениндуцированного опухолеобразования толстой кишки по сравнению с мышиными моделями, которым производили фекальную трансплантацию от здоровых доноров [26]. Эти данные предоставляют доказательства, подтверждающие этиологическую роль кишечной микробиоты в развитии КРР.

Факторы, влияющие на возникновение КРР (адаптировано: N. Koyande и соавт. [29]).

Бактериальные метаболиты, генотоксины, а также транслокации целых бактерий могут модулировать иммунный ответ и изменять нормальные физиологические условия, приводя к злокачественной трансформации и опухолевому росту. В работе H. Tsoi и соавт., которая была описана выше, показано, что P. anaerobius на поверхности клеток толстого кишечника взаимодействует с толл-подобными рецепторами (TLR2 и TLR4), которые участвуют в инициации иммунного ответа. Это приводит к повышению в клетках уровня активных форм кислорода (АФК), что в дальнейшем способствует активизации клеточной пролиферации.

Бактериальные метаболиты (вторичные желчные кислоты, H2S и N-нитрозосоединения) могут провоцировать повреждение ДНК и стимулировать развитие хронического воспаления, которое, в свою очередь, также провоцирует повышенную выработку АФК и активных форм азота (АФА) клетками воспаленных тканей, что усугубляет процессы повреждения. Возникающие генетические и эпигенетические изменения могут способствовать индукции канцерогенеза и развитию КРР [30].

Патогенные микроорганизмы могут способствовать возникновению генетических изменений и посредством выработки генотоксинов. Примером таких вирулентных бактериальных факторов является фермент CDT (cytolethal distending toxin, цитолетальный расширяющий токсин) — мощная ДНКаза, действие которой приводит к разрывам двойных цепей ДНК. CDT продуцируется патогенными E. coli и C. jejuni, которые в большом количестве обнаруживаются у больных КРР. Введение C. jejuni с дефектной формой токсина устраняло онкогенные эффекты этой бактерии на мышиных моделях, что доказывает причинную роль CDT в онкогенезе [31]. Колибактин — еще один генотоксин, продуцируемый E. coli, представляет собой пептид, образующийся в результате активности ферментов, которые кодируются кластером генов, известным как «остров патогенности pks». Колибактин индуцирует образование ДНК-аддуктов и поперечных сшивок. Колонизация мышей линии ApcMin/+ колибактином приводит к развитию колитассоциированного КРР. При этом данный эффект ослабляется при делеции «острова pks». Важно отметить, что местоположения двойных разрывов, вызванных колибактином, соответствуют таковым мутационных «горячих точек» в геноме КРР, что подчеркивает вероятную роль этого генотоксина в возникновении опухолей. Ингибиторы биосинтеза колибактина потенциально могут прервать эти генотоксические и опухолепротективные эффекты pks+ E. coli и, возможно, обеспечить профилактику возникновения опухолевого процесса у пациентов-носителей патогенного штамма [32—35]. Подобно колибактину, «индолимины», класс микробных метаболитов, содержащие функциональную иминовую группу и секретирующиеся комменсалом M. morganii, содержащимся в образцах фекалий, полученных у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника и больных КРР, также могут опосредовать повреждение ДНК и способствовать развитию злокачественной опухоли [36].

Бактерии E. faecalis и B. fragilis продуцируют энтеротоксин fragilis и АФК, которые вызывают усиление воспаления, окислительное повреждение ДНК и повреждение кишечного эпителиального барьера.

Таким образом, воздействие бактерий и их метаболитов способно приводить к дисфункции эпителиального барьера кишечника. Кишечный барьер обычно удерживает бактерии в просвете, но любое его нарушение увеличивает проницаемость стенки кишечника, что влечет за собой желудочно-кишечные расстройства и может провоцировать развитие КРР [30]. Дисфункция эпителиального барьера, опосредованная бактериальными метаболитами, индуцирует хроническое воспаление путем активации цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-α (ФНО-α) и интерлейкин-6 (ИЛ-6), и дисфункции эпителиальных клеток (трансформация эпителиальных клеток), что в конечном итоге может приводить к неопластическим изменениям [30]. Наконец, некоторые группы бактерий могут непосредственно проникать через эпителиальный барьер, что вызывает его разрушение и нарушает барьерную функцию, способствуя проникновению в кровь различных метаболитов и провоцируя системное воспаление. Одной из таких бактерий является F. nucleatum, которая экспрессирует на своей поверхности FadA — молекулу, обеспечивающую адгезию с Е-кадгерином на поверхности клеток эпителия кишечника. Затем бактерия проникает в эпителиальные клетки толстой кишки, что приводит к индукции воспалительных изменений. Е-кадгерин обычно действует как супрессор опухолевого роста, взаимодействуя с β-катенином — фактором транскрипции, регулирующим деление клеток. Связывание FadA с Е-кадгерином ингибирует его супрессорную активность [37]. В присутствии F. nucleatum также наблюдалось увеличение количества инфильтрирующих опухоль клеток миелоидного происхождения, включая макрофаги, дендритные клетки и гранулоциты. Факторы, выделяемые этими клетками, могут способствовать ангиогенезу и выживанию опухолевых клеток, что поддерживает механизмы онкогенеза. Последние данные позволяют считать, что F. nucleatum — одна из основных бактерий, связанных с развитием и прогрессированием КРР [37].

В ряде исследований показано, что F. nucleatum более распространена в опухолевой ткани, нежели в нормальной слизистой оболочке кишечника [38, 39]. Согласно O.I. Coleman [23] F. nucleatum может быть использована в качестве неинвазивного биомаркера для аденомы и карциномы толстой кишки. Однако в настоящий момент остается неясным и требует дополнительных исследований тот факт, что ни один отдельный вид микроорганизмов не был обнаружен у всех пациентов с КРР и микробный состав значительно различается у разных людей. Наиболее часто выявляемые патогенные микроорганизмы из указанных выше исследований мы объединили в таблицу.

Бактерии, ассоциированные с КРР, и механизм их канцерогенного действия

Комбинация определенных бактериальных штаммов может выступать в качестве нового неинвазивного диагностического маркера. Так, в частности, в диагностическом тесте, нацеленном на выявление КРР и основанном на определении состава микробиоты в сочетании с иммунохимическим анализом кала на скрытую кровь, были достигнуты высокие диагностические показатели: для бактерий F. nucleatum — чувствительность 92,8%, специфичность 79,8%; для 4 видов бактерий (F. nucleatum, B. clarus, R. intestinalis, Cl. hathewayi ) — чувствительность 92,8%, специфичность 81,5% [9].

Заключение

Данные клинических исследований, накопленные к настоящему времени, свидетельствуют о необходимости проведения расширенных и углубленных исследований влияния микробиома на возникновение КРР. В нашей обзорной статье описаны типы микробиоты, ассоциированной с КРР, методы их анализа и механизмы воздействия на эпителий толстого кишечника. Накопленные на сегодняшний день сведения указывают на потенциальную роль ряда бактерий в возникновении КРР и раскрывают возможные механизмы их патогенного действия. В перспективе эти данные могут помочь в создании методов скрининга КРР на основе изучения микробиоты кишечника человека. Насущная проблематика данного направления исследований — это определение оптимального метода забора материала для микробиологического анализа и его стандартизация в рамках скрининга.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.