Бифидобактерии — многочисленные представители типа Actinomycetota в микробиоценозе толстого кишечника человека, характеризующие его состояние и играющие роль функционального доминанта в нем. Микробиомные исследования кишечника человека, проводимые при помощи молекулярно-генетических методов, продемонстрировали расхождение количества выявляемых бактерий филума Actinomycetota с результатами бактериологического метода.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение эффективности некоторых методик пробоподготовки фекалий для выделения ДНК бифидобактерий, кутибактерий и бактероидов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на пробах фекалий, полученных от взрослых условно-здоровых обследуемых, обработанных с применением различных суспензионных сред (изотонического раствора хлорида натрия либо натрий-фосфатного буфера), фракционированных центрифугированием и подвергнутых экстракции тотальной ДНК из двух различных фракций: неокрашенной поверхностной и глубокой волокнистой. Концентрация выделяемой ДНК определялась спектрофотометрическим методом. Выделенная ДНК использовалась в качестве ДНК-матрицы при проведении ПЦР-анализа в разработанной тест-системе родовой идентификации бифидобактерий, кутибактерий и бактероидов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Использование фосфатного буфера либо же просто изотонического раствора хлорида натрия не оказывает существенного влияния на эффективность выделения ДНК. Проведение ПЦР-анализа при помощи родоспецифичных праймеров к гену малой рибосомальной РНК и с использованием аналогичной системы детекции бактероидов в качестве контроля, показывает, что использование фосфатного буфера или изотонического раствора хлорида натрия на этапе ресуспензирования исследуемого материала не влияет на протекание реакции амплификации. В то же время выделение ДНК из верхней фракции осадка, как рекомендуется производителем набора, не позволяет обнаружить в нем бифидобактерии, тогда как амплификация ДНК бактероидов успешно проходит во всех случаях. ДНК бифидобактерий выявляется только в глубокой волокнистой фазе фекалий.
ВЫВОДЫ
Получаемые данные демонстрируют важность учета способности таких индигенных микроорганизмов кишечника человека, как бифидобактерии, концентрироваться преимущественно в волокнистой части фекалий, не всегда предписываемой в качестве источника выделения бактериальной ДНК руководствами к серийно выпускаемым специализированным наборам реагентов.
