Рак мочевого пузыря (РМП) — гетерогенная группа злокачественных новообразований, которые характеризуются различными молекулярно-генетическими нарушениями, обусловливающими особенности онкогенеза и клинического течения опухоли, а также обладающими прогностической и предиктивной ценностью. Исследования подобных нарушений важны как для фундаментальной медицинской науки, так и для практической медицины.

Мутационный статус гена FGFR3 является важной биологической характеристикой уротелиального рака. FGFR3 относится к семейству рецепторов фактора роста фибробластов (FGFR), мутации в данном гене встречаются в различных опухолях, чаще всего в уротелиальном раке [1]. Данные аберрации включают около 6% слияний FGFR3, 10—60% соматических несинонимичных мутаций в гене FGFR 3, 7% амплификаций гена FGFR1 [2]. Передача сигналов от аберрантных рецепторов семейства FGFR связана с активацией ключевого сигнального пути митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK/ERK) и играет важную роль в онкогенезе и прогрессировании опухолей [2, 3].

Мутантный статус FGFR3 считается благоприятным прогностическим маркером, так как ассоциирован с преимущественно немышечно-инвазивными папиллярными карциномами низкой степени злокачественности (low grade) [4—7]. Результаты ряда исследований свидетельствуют о том, что мутации в гене FGFR3 связаны с высокими показателями выживаемости у пациентов с РМП [8].

В последние годы в клинической онкологии FGF-рецепторы все чаще рассматриваются как перспективная лекарственная мишень для таргетной терапии злокачественных опухолей. Было разработано несколько препаратов-ингибиторов, нацеленных на семейство FGFR. Эрдафитиниб, pan-FGFR-ингибитор, недавно стал первым таргетным препаратом, одобренным FDA для лечения метастатической или неоперабельной уротелиальной карциномы [3, 9]. В клиническом исследовании эрдафитиниба объективный ответ на лечение наблюдался у 40% пациентов с местно-распространенным неоперабельным или метастатическим уротелиальным раком с выявленными изменениями FGFR, включая 59% пациентов, которые ранее получали иммунотерапию [10]. Другой ингибитор FGFR, рогаратиниб, применявшийся для лечения уротелиального РМП в комбинации с атезолизумабом, показал объективный ответ в 44% случаев, включая 16% полного ответа [11].

В настоящее время необходимы дальнейшие исследования для более глубокого понимания эффектов комбинированной терапии РМП, включающей FGFR-таргетную и иммунотерапию препаратами-ингибиторами иммунных контрольных точек [12]. Связь мутантного FGFR3-статуса с другими известными на сегодняшний день предиктивными маркерами иммунотерапии неоднозначна. Предполагается, что состояние гена FGFR3 в уротелиальной карциноме не зависит от феномена микросателлитной нестабильности (MSI) [13]. Согласно данным литературы [12], мутации в FGFR3 связаны с более низкой экспрессией PD-L1.

Известно, что FGFR3 играет важную роль в регуляции работы иммунной системы путем ингибирования интерферонов и стимуляции выработки фактора некроза опухоли-α. Отмечены также ингибирующие эффекты FGFR3 на широкий спектр компонентов адаптивного иммунного ответа, включая степень лимфоидной инфильтрации и экспрессию CD8+ Т-клеток, а также усиление противовоспалительного ответа, опосредованного TGF-β. Есть предположения, что мутации FGFR3 и слияния FGFR3-TACC3 могут быть связаны с развитием определенного фенотипа опухоли, характеризующимся слабой лимфоидной инфильтрацией. Было показано, что сигнальный путь Wnt/β-катенин, который связан опухолями, слабо инфильтрированными Т-клетками, как при РМП, так и при большинстве солидных опухолей, перекрывается с сигнальными путями FGFR3. Также амплификация FGFR3 связана со снижением инфильтрации РМП противовоспалительными макрофагами [12].

Высказываются предположения, что ингибирование FGFR посредством таргетной терапии может изменить микроокружение опухоли и увеличить количество инфильтрирующих опухоль лимфоцитов и тем самым повысить чувствительность опухоли к воздействию иммунотерапевтических препаратов. Также одной из причин приобретенной резистентности опухоли к блокаторам иммунных контрольных точек может быть усиленная передача сигналов по пути FGFR3, таким образом, FGFR-таргетная терапия может быть эффективна после предшествующего курса иммунотерапии [12].

Необходимо отметить, что, хотя большинство РМП с нарушениями в гене FGFR3 являются высокодифференцированными поверхностными уротелиальными карциномами, всегда возможна дальнейшая опухолевая прогрессия данных новообразований. Так, результаты исследования S.Rebouissou и соавт. [14] показывают, что делеция CDKN2A играет важную роль в прогрессировании немышечно-инвазивной FGFR3-позитивной карциномы мочевого пузыря. В ряде публикаций отмечено, что делеция CDKN2A способствует мышечной инвазии FGFR3-позитивной опухоли, а снижение экспрессии белка p16 можно трактовать как предиктор прогрессирования немышечно-инвазивного РМП [15, 16]. Таким образом, своевременно проведенное исследование FGFR3-статуса РМП позволит клиницисту назначить пациенту дополнительное терапевтическое лечение в случае прогрессирования онкологического заболевания мочевого пузыря.

Целью исследования, проведенного на базе кафедры патологической анатомии ДПО ФГБОУ «РМАНПО» и ФГБУН «ИХБФМ» Со РАН, было изучение соматического мутационного статуса гена FGFR3 в уротелиальном раке мочевого пузыря и оценка его связи с клинико-морфологическими характеристиками опухоли, феноменом dMMR, PD-L1-статусом опухоли и ИГХ-экспрессией белка p16.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили 40 образцов операционного материала РМП, предоставленных кафедрой патологической анатомии РМАНПО.

Выборка пациентов сформирована случайным образом. Критериями включения в исследование были наличие парафиновых блоков, содержащих достаточное количество опухолевой (не менее 20%) и окружающей ткани, стадии процесса Т1-3, уротелиальный РМП, наличие ряда клинических данных (клинический диагноз РМП, пол, возраст). Критериями невключения являлись отсутствие парафиновых блоков с достаточным объемом материала для исследования, карцинома in situ, неинвазивный папиллярный рак, отсутствие или неполные клинические данные, а критерием исключения стало недостаточное количество ткани в опухолевых блоках для проведения иммуногистохимических исследований.

Отобранные пациенты были преимущественно мужского пола — 92,5% (37/40), средний возраст (оба пола) составлял 62,75 года (29—87 лет). Распределение по стадии TNM (UICC, 2018) было следующим: pT1— 40% (16/40), pT2 —55% (22/40), pT3 — 5% (2/40), карцинома in situ и неинвазивный папиллярный рак в исследование не включались. Распределение по степени дифференцировки опухоли (WHO classification, 5th ed., 2022): low-grade — 25% (10/40), high-grade — 75% (30/40). В 47,5% (19/40) РМП имел папиллярное гистологическое строение, а в 52,5% (21/40) — погружной тип роста.

Наличие мутаций в гене FGFR3 в исследованных образцах РМП определяли молекулярно-генетическим методом с использованием полимеразно-цепной реакции (ПЦР). Выделение ДНК из FFPE блоков проводили с использованием набора RNeasy FFPE Kit (Qiagen GmbH, Германия, кат. номер 73504) Выделение РНК из гистологических блоков, заключенных в парафин, проводили с использованием High Pure FFPET RNA Isolation Kit (Roche Life Science) из 3—4 срезов толщиной 5 мкм. Аллель-специфическую ПЦР в реальном времени использовали для выявления 6 более распространенных соматических мутаций в гене FGFR3 (c.746C>G p.S249C COSM715; c.1118A>G p.Y373C COSM718; c.742C>T p.R248C COSM714; c.1108G>T p.G370C COSM716; c.1948A>G p.K650E COSM719; c.1111A>T p.S371C COSM17461). Кроме того, ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени была применена для выявления двух распространенных слияний (FGFR3-Tacc3_v1 и FGFR3-TACC3v3) в препаратах РНК.

Иммуногистохимическое исследование dMMR в представленных образцах РМП проводили с использованием антител VENTANA anti-MSH6 (SP93), VENTANA anti-PMS2 (A16-4), VENTANA anti-MLH1 (M1) с системой детекции OptiView DAB IHC Detection Kit с OptiView Amplification Kit. В случае отсутствия ядерного иммуногистохимического окрашивания хотя бы одного маркера диагностировалась dMMR. Для исключения ложнонегативных результатов оценивался характер экспрессии внешнего позитивного контроля, в качестве которого использовалась нормальная ткань аппендикса и ткань рака сигмовидной кишки с известным высоким уровнем экспрессии белков системы репарации неспаренных оснований ДНК (MMR-системы).

Исследование PD-L1-статуса РМП проводилось иммуногистохимическим методом с использованием набора PD-L1 IHC 22C3 PharmDx (Dako, Inc.) и антител PD-L1 SP142 с системой детекции OptiView DAB IHC Detection Kit с амплификацией сигнала (Ventana Medical Systems, Inc.). С каждого образца опухоли делали по 2 среза: один для нанесения первичных антител и второй для реагента негативного контроля. В качестве контроля протокола исследования применяли стекла с образцами клеточных культур (NCL-H226 —позитивная клеточная линия и MCF-7 — негативная клеточная линия), образцы ткани миндалины для 22С3 и SP142 в каждом цикле постановки реакции. Для всех антител применялся автоматизированный метод иммуногистохимического исследования, для 22С3 исследование проводилось на автостейнере Avtostainer Link 48 (ASL48) (Dako, Inc.) с использованием оптимизированного закрытого протокола, заложенного в автоматизированную платформу. Для постановки реакции с антителом SP142 (Ventana Medical Systems, Inc.) применялся иммуногистостейнер VENTANA Bench Mark ULTRA (Ventana Medical Systems, Inc.) по протоколам, рекомендованным в инструкциях к антителам и системой внешнего контроля качества NordiQC. На первом этапе анализа оценивали правильность окрашивания позитивных и негативных клеточных линий и позитивного тканевого контроля (ткань миндалины). Затем проводили оценку иммуногистохимических реакций на образцах уротелиального рака. Для каждого антитела оценивали визуально наличие фактической иммуногистохимической реакции как в опухолевых клетках, так и в иммунных и определяли PD-L1-статус опухоли по системам и их пороговым значениям (cut-off), рекомендованным в настоящее время для уротелиального РМП. Для антитела 22С3 использовалась система оценки CPS: отношение как опухолевых, так и иммунных клеток, экспрессирующих PD-L1, ко всем жизнеспособным опухолевым клеткам в образце, умноженное на 100, пороговое значение (cut-off) ≥10. Для антитела SP142 использовалась система оценки IC: отношение площади, занимаемой иммунными клетками, экспрессирующими PD-L1 к площади опухоли, под которой понимают все жизнеспособные клетки опухоли, иммунные клетки микроокружения и гранулемы, умноженное на 100 и выраженное в процентах, пороговое значение (cut-off) ≥5%.

Для каждого антитела помимо PD-L1 статуса, определяемого согласно рекомендованным системам оценки и пороговым значениям, дополнительно определяли уровень экспрессии PD-L1 иммунными и опухолевыми клетками, для данной цели использовали системы IC и TC соответственно. Показатель TC определяли как долю жизнеспособных опухолевых клеток, демонстрирующих иммуногистохимическую экспрессию PD-L1, среди общего количества опухолевых клеток.

В соответствии с рекомендациями по оценке результатов экспрессии PD-L1 оценивалось только наличие мембранного окрашивания в опухолевых и иммунных клетках независимо от его интенсивности.

Исследование экспрессии белка p16 проводилось иммуногистохимическим методом с использованием клона E6H4 (Ventana) на срезах с TMA-блока (Tissue Microarray Block). Позитивный p16-статус РМП определяли при наличии любого ядерно-цитоплазматического иммуногистохимического окрашивания p16, выявленного в клетках опухоли, также все случаи РМП были разделены по характеру экспрессии белка p16 на три группы: диффузная иммуногистохимическая экспрессия исследуемого белка, неоднородная экспрессия, отмечавшаяся преимущественно в базальных отделах («базальная») и полное отсутствие экспрессии.

Оценка числа опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (tumor-infiltrating lymphocytes, TILs) проводилась на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, при использовании увеличения микроскопа в 200—400 раз. Все исследованные срезы имели толщину 4—5 мкм и были изготовлены с парафиновых блоков, ткань в которых была фиксирована в 10% забуференном формалине в течение 24—72 ч. Количественный показатель TILs определяли как отношение площади стромы опухоли, занимаемой лимфоидными клетками, к общей площади стромы опухоли, выраженное в процентах. Учитывалась только мононуклеарная лимфоидная инфильтрация инвазивной опухоли, включая как «центральную опухоль», так и «инвазивный край», полиморфно-ядерные лейкоциты (нейтрофилы) были исключены из подсчета. Подсчет проводился без учета «горячих точек» и площади, занятой лимфоидными клетками, расположенными за пределами границ опухоли, а также в зонах с очагами некроза, артефактами размозжения, диатермии и коагуляции.

Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 2.8.8 (разработчик — ООО «Статтех», Россия).

Результаты и обсуждение

В проведенном исследовании наличие нарушений в гене FGFR3 обнаружено в 35% (14/40) образцов РМП. Были выявлены различные мутации, а именно G370C, S249C, S371C/Y373C, R248C. Чаще всего, в 57,1% (8/14), определялась мутация S249C, а G370C, R248C и S371C/Y373C встречались с одинаковой частотой, составляющей 14,3% (2/14).

При сопоставлении FGFR3-статуса исследованных образцов РМП в зависимости от пола и возраста пациентов, а также значений показателя TILs не установлено статистически значимой связи, значения p составили 1,000; 0,599; 0,177 соответственно (используемые статистические методы: точный критерий Фишера, t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна—Уитни) (рис. 1).

Рис. 1. Анализ связи мутационного статуса гена FGFR3 в РМП с полом (а) и возрастом (б) пациентов, гистологическим строением (в), степенью дифференцировки опухоли (г), стадией pT (д) и TILs (е).

Однако согласно полученным данным при анализе мутационного статуса гена FGFR3 в зависимости от гистологического строения опухоли, а также степени дифференцировки и глубины инвазии в стенку мочевого пузыря (стадии pT) были выявлены статистически значимые различия (p<0,001; p=0,018; p=0,001 соответственно; используемые статистические методы: точный критерий Фишера и хи-квадрат Пирсона) (см. рис. 1).

Шансы наличия аберраций в FGFR3 в исследуемой выборке РМП были статистически значимо выше в группе папиллярных карцином по сравнению с группой опухолей, демонстрирующих эндофитный, агрессивный, погружной тип роста (ОШ=0,023; 95% ДИ: 0,002—0,214). Также отмечались статистически значимо более высокие шансы позитивного FGFR3-статуса в группе высокодифференцированных опухолей по сравнению с группой карцином с низкой степенью дифференцировки (ОШ=0,130; 95% ДИ: 0,026—0,643).

Таким образом, в данном исследовании наличие нарушений в гене FGFR3 не было связано с полом и возрастом пациентов, а также со степенью лимфоидной инфильтрации опухоли. Однако полученные результаты показывают, что позитивный мутационный статус гена FGFR3 статистически значимо чаще наблюдается в группе папиллярных высокодифференцированных немышечно-инвазивных карцином мочевого пузыря (см. рис. 1).

Дефицит системы репарации неспаренных оснований ДНК (dMMR) был найден в 50% (20/40) уротелиальных карцином. В таких наблюдениях РМП определялось полное отсутствие ИГХ-экспрессии исследуемых белков MMR-системы, что послужило основанием для оценки их MMR-статуса как dMMR-позитивного. Необходимо отметить, что dMMR наблюдался в опухолях как с наличием генетических изменений в FGFR3, так и с отсутствием таковых. При статистическом анализе FGFR3-статуса РМП в зависимости от MMR-статуса опухоли не удалось установить статистически значимых различий, значение p составило 0,741 (используемый статистический метод — точный критерий Фишера). Шансы позитивного FGFR3-статуса в группе dMMR-карцином в исследуемой выборке РМП были в 1,56 раза ниже по сравнению с группой pMMR (proficient mismatch repair) опухолей, но указанные различия шансов не были статистически значимыми (95% ДИ: 0,42—5,76) (рис. 2).

Рис. 2. Анализ связи мутационного статуса гена FGFR3 в РМП с MMR-статусом (а), PD-L1-статусом SP142 (б) и PD-L1-статусом 22C3 (в), p16-статусом (г) и характером иммуногистохимической экспрессии белка p16 (д).

В данной научной работе позитивный PD-L1-статус был выявлен иммуногистохимическим методом в небольшом числе случаев — с использованием клона SP142 в 7,5% (3/40) исследуемых образцов РМП, с использованием клона 22C3 в 10% (4/40) опухолей.

Статистически значимой зависимости между PD-L1-статусом РМП, определенным с помощью двух различных клонов антител, и FGFR3-статусом опухоли обнаружено не было, значения p составили 0,539 и 0,278 для SP142 и 22С3 соответственно (используемый статистический метод — точный критерий Фишера). Необходимо отметить, что во всех PD-L1-позитивных РМП отсутствовали какие-либо нарушения в гене FGFR3 (см. рис. 2).

Также при сопоставлении показателей IC (SP142), TC (SP142) и IC (22C3), CPS (22C3) и состояния мутационного статуса гена FGFR3 не было выявлено статистически значимых различий, значения p составили 0,218 и 0,293 для IC (SP142) и TC (SP142) соответственно и 0,114 и 0,065 для IC (22C3) и CPS (22C3) соответственно (используемый статистический метод — U-критерий Манна—Уитни).

Однако при анализе показателя TC (22C3) в зависимости от FGFR3-статуса опухоли была установлена значимая статистическая связь, значение p составило 0,036 (используемый статистический метод — U-критерий Манна—Уитни). Более высокие уровни экспрессии PD-L1 демонстрировали опухолевые клетки (TC) уротелиальных карцином, в которых не было выявлено генетических аберраций в FGFR3.

В 70% (28/40) всех исследованных РМП обнаружена иммуногистохимическая экспрессия белка p16. В 37,5% (15/40) наблюдалась диффузная экспрессия указанного белка, в 32,5% (13/40) — иммуногистохимическое окрашивание p16 было определено как носящее преимущественно базальный характер, в 30% (12/40) образцов РМП экспрессии p16 выявлено не было.

Посредством статистического анализа не удалось установить значимой связи между статусом белка p16 и наличием мутаций в FGFR3 в исследуемых РМП (p=0,48, используемый статистический метод — точный критерий Фишера). Шансы позитивного FGFR3-статуса были в 1,94 раза выше среди уротелиальных карцином, в которых отмечалась экспрессия p16, по сравнению с опухолями, где иммуногистохимическое окрашивание не наблюдалось (95% ДИ 0,43—8,79) (см. рис. 2).

Однако согласно полученным данным при сравнении характера экспрессии p16 в зависимости от FGFR3-статуса были установлены статистически значимые различия, значение p составило 0,049 (используемый статистический метод χ² Пирсона) (см. рис. 2). Базальное иммуногистохимическое окрашивание p16 отмечалось преимущественно в карциномах мочевого пузыря, в которых также наблюдались генетические нарушения в FGFR3, а диффузная экспрессия p16 и полное ее отсутствие были характерны для уротелиальных карцином с негативным мутационным статусом гена FGFR3 (рис. 3—5).

Рис. 3. Low-grade РМП, стадия pT1, позитивный FGFR3-статус, ТМА-блок.

а — окраска гематоксилином и эозином; б — базальная экспрессия p16 в клетках опухоли; ИГХ-реакция. а, б — ×100.

Рис. 4. High-grade РМП, стадия pT2a, негативный FGFR3-статус, ТМА-блок.

а — окраска гематоксилином и эозином; б — отсутствие экспрессии p16 в клетках опухоли; ИГХ-реакция. а, б — ×100.

Рис. 5. High grade РМП, стадия pT3b, негативный FGFR3-статус, ТМА-блок.

а — окраска гематоксилином и эозином; б — диффузная экспрессия p16 в клетках инфильтративного компонента опухоли и в зоне дисплазии, отсутствие экспрессии в экзофитном папиллярном компоненте опухоли; ИГХ-реакция. а, б — ×100.

Заключение

В 35% случаев исследуемых образцов РМП были выявлены мутации G370C, S249C, S371C/Y373C, R248C в гене FGFR3. Частота встречаемости данных генетических аберраций не зависела от пола и возраста пациентов, а также от числа опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов, однако нарушения в гене FGFR3 статистически значимо чаще наблюдались в группе папиллярных высокодифференцированных немышечно-инвазивных РМП. Позитивный FGFR3-статус отмечался как среди pMMR-опухолей, так и среди карцином с определенным ИГХ-методом дефицитом системы репарации неспаренных оснований ДНК, таким образом, феномен dMMR и нарушения в гене FGFR3 в данной работе являлись независимыми онкогенетическими событиями в РМП. PD-L1-статус РМП, определенный с помощью разных клонов антител (SP142 и 22C3), не был статистически значимо связан с наличием мутаций в гене FGFR3, при этом позитивный PD-L1-статус отмечался только в карциномах мочевого пузыря, в которых отсутствовали нарушения в гене FGFR3. Также выявлено, что для FGFR3-позитивных опухолей характерен более низкий уровень иммуногистохимической экспрессии PD-L1 опухолевыми клетками, определенный с помощью клона 22C3. Полученные результаты подтверждают последние данные научной литературы, свидетельствующие о наличии обратной связи между экспрессией PD-L1 и аберрантными рецепторами FGF. Несмотря на отсутствие связи между статусом белка p16 и FGFR3-статусом исследуемых опухолей, характер иммуногистохимической экспрессии белка p16 оказался статистически значимо связан с наличием мутаций в гене FGFR3, в FGFR3-позитивных опухолях отмечалось очаговое окрашивание опухолевых клеток преимущественно в базальных отделах; в группе FGFR3-негативных РМП чаще наблюдалась диффузная экспрессия p16 либо полное ее отсутствие.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о необходимости определения нарушений в гене FGFR3 наряду с другими предиктивными молекулярно-биологическими маркерами у пациентов с уротелиальной карциномой мочевого пузыря для возможности дальнейшего назначения им персонализированной терапии.

Участие в исследовании М.Л. Филипенко, Т.Ю. Алексеенка и Н.А. Оськиной осуществлялось в рамках государственного задания ИХБФМ Со РАН №121031300045-2.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Л.Э. Завалишина, Е.М. Олюшина

Сбор и обработка информации — Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Е.М. Олюшина

ИГХ-исследование — Л.Э. Завалишина, Е.М. Олюшина, Ю.Ю. Андреева, О.А. Кузнецова

Генетическое исследование — М.Л. Филипенко, Е.Ю. Алексеенок, Н.А. Оськина

Написание текста — Е.М. Олюшина

Редактирование — Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, М.Л. Филипенко, Г.А. Франк

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.