В патогенезе рака желудка важное значение имеют так называемые гены общего контроля (caretaker genes), которые влияют на канцерогенез опосредованно, обеспечивая способность репарации нелетальных мутаций в геноме, в частности, мутаций протоонкогенов, генов-супрессоров опухолевого роста и генов-регуляторов апоптоза, т.е. отвечают за общую стабильность генома. К этой категории относятся гены системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair, MMR).

При инактивации генов системы MMR (MSH2, MSH6, PMS2, MLH1 и др.) происходит накопление многочисленных мутаций в геноме, в том числе в зонах микросателлитных повторов [1—3], что обусловливает формирование микросателлитной нестабильности (MSI) [4—6]. Микросателлитные повторы (микросателлиты) представляют собой отрезки ядерной ДНК, состоящие из повторяющихся мономеров длиной не более 9 пар оснований, тандемно или случайно распределенные в геноме человека [7]. Функция микросателлитных повторов не ясна [8]. MSI является геномным маркером, отражающим недостаточность системы репарации ДНК вследствие мутаций или инактивации MMR-генов. Микросателлитная нестабильность была впервые описана при синдроме Линча (наследственный рак толстой кишки без полипоза) [4], а затем выявлена во многих солидных опухолях человека [2].

Мутации в микросателлитах возникают в десятки раз чаще, чем в других областях генома, а в отсутствие должной функции системы репарации количество их возрастает в сотни и тысячи раз [9, 10]. Микросателлитная нестабильность — это индикатор мутаторного фенотипа, т.е. диспропорции между мутационной нагрузкой (mutational burden) клетки и числом мутаций, характерным для клетки с нормально функционирующей системой репарации. Большинство мутаций в повторяющихся последовательностях непосредственно не влияет на жизнедеятельность клетки, однако ускоренное накопление мутаций в регуляторных и кодирующих областях генов, ответственных за процессы клеточного роста, деления и апоптоза, способствует неконтролируемому росту, выживанию и дальнейшему озлокачествлению клеток с неисправной системой репарации. Примечательно, что сами гены системы репарации содержат повторяющиеся последовательности в кодирующих областях и возникающие в них вторичные мутации могут способствовать дальнейшей дестабилизации всей системы [11—13].

Как и колоректальный рак [14] злокачественные опухоли желудка, возникшие на фоне дефекта системы репарации ДНК, демонстрируют специфические биологические характеристики и достаточно выраженные особенности клинического течения.

В литературе [1, 15, 16] имеется 3 метаанализа демографических и клинико-морфологических особенностей рака желудка с микросателлитной нестабильностью и влияния MSI-статуса на прогноз. Последний и наиболее крупный из них объединил почти 20 тыс. пациентов из 48 исследований. Результаты этих исследований были опубликованы с 1994 по январь 2016 г. [16]. Более 80% исследованной популяции составили представители азиатской расы, что связано с большим количеством исследований, проведенных в Японии, Китае, Корее и Тайване, где рак желудка является значимой медико-социальной проблемой, однако метаанализ не выявил расовой предрасположенности к развитию дефектов MMR.

Совокупный анализ показал, что опухоли с MSI достоверно чаще наблюдаются в старшей возрастной группе, более характерны для женщин, развиваются преимущественно в дистальных отделах желудка, чаще имеют интестинальный тип строения, реже метастазируют в регионарные лимфатические узлы и, как следствие, характеризуются более ранними стадиями по TNM. Однако ряд исследований противоречит этим данным, так, в 4 исследованиях не обнаружено связи между MSI, возрастом и полом пациентов [3, 17—19], в 6 не обнаружена связь с локализацией опухоли [3, 19—23].

Влияние на прогноз оценивалось в 21 из 48 исследований. Общая выживаемость оказалась достоверно выше для опухолей с MSI по сравнению с MSS-опухолями (HR 0,69, 95% ДИ 0,56—0,86; p<0,001). Важно также, что анализ отдельных подгрупп не показал влияние методологических особенностей отдельных исследований, таких как давность исследования, объем выборки, происхождение пациентов, технические аспекты выявления MSI, на общую прогностическую значимость MSI-статуса [16].

Известно также, что наличие микросателлитной нестабильности в опухолевых клетках аденокарциномы является предиктором чувствительности опухоли не только к химиотерапевтическим препаратам, но и к иммунотерапии, что в ряде случаев и определяет его положительную прогностическую роль при аденокарциномах, в том числе желудка. Совместный анализ 4 рандомизированных исследований по применению периоперационной химиотерапии показал лучшую общую выживаемость с MSI по сравнению с MSS-фенотипом [24]. Что касается иммунотерапии, которая стала все более широко внедряться в современную онкологическую практику, по данным исследования KEYNOTE-061, обнаружение в опухоли MSI демонстрировало высокую эффективность иммунотерапии: частота объективных ответов составила 47%, однако медиана продолжительности жизни не достигнута. Другим молекулярным подтипом, вероятно, чувствительным к иммунотерапии, является рак желудка, ассоциированный с вирусом Эпштейна—Барр [25, 26].

Таким образом, существуют противоречивые данные относительно связи MSI и различных клинико-морфологических параметров рака желудка, отсутствуют данные о частоте встречаемости этих опухолей в России, а также не ясно, является ли наличие MSI независимым прогностическим признаком при раке желудка.

Цель нашего исследования — оценить частоту выявления микросателлитной нестабильности в аденокарциномах желудка у пациентов из Российской Федерации, уточнить связь микросателлитной нестабильности с клинико-морфологическими характеристиками и влияние на прогноз заболевания.

Материал и методы

В исследовании использованы образцы операционного материала от 310 пациентов с верифицированным диагнозом рака желудка, не получавших в предоперационном периоде химио- или лучевую терапию. Критериями исключения были карцинома in situ, недостаточное количество материала в парафиновых блоках, верифицированный нейроэндокринный рак, лимфома желудка или гастроинтестинальная стромальная опухоль желудка. Возраст пациентов варьировал от 22 до 85 лет (средний — 63 года). Медиана длительности наблюдения за пациентами составила 83 мес.

Постановку иммуногистохимических реакций осуществляли с помощью системы детекции UltraVision Quanto (Thermo Fisher Scientific, США) согласно протоколу производителя в иммуностейнере Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific, США). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов выполняли при помощи буфера Thermo Dewax and HIER Bufer H (pH 9,0) при температуре 95—98 °C в течение 20 мин в модуле предобработки (PT-Module, Thermo Fisher Scientific, США). В работе использовали следующие моноклональные антитела: Dako/Agilent Technologies, США: MSH2 (клон FE-11, разведение 1:50), MSH6 (клон EP49, RTU), MLH1 (клон ES05, разведение 1:50), PMS2 (клон EP51, разведение 1:40). Время инкубации антител составляло 20—30 мин в соответствии с инструкцией производителя.

Оценку реакции с маркерами микросателлитной нестабильности проводили в соответствии с ранее опубликованными методиками [27, 28]. Опухоли относили к MMR-негативным (дефицитным), если отсутствовала ядерная экспрессия хотя бы одного из маркеров (MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2), при наличии положительной реакции в окружающих нормальных эпителиальных и гладкомышечных клетках, а также лимфоцитах. При положительной экспрессии маркеров опухоли считали MMR-позитивными, т.е. не имеющими дефектов в генах системы репарации ДНК. При отсутствии экспрессии одновременно в опухолевых клетках и окружающих нормальных клетках случаи исключали из анализа.

Полученные результаты были сопоставлены с основными клинико-морфологическими характеристиками рака желудка. Сопоставление результатов со степенью дифференцировки опухолей проводили для тубулярного, папиллярного и смешанного гистологических типов рака (n=222).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием анализа таблиц сопряженности, критерия хи-квадрат, непараметрических критериев для парного и множественного сравнений, анализа выживаемости по Каплану—Мейеру, логрангового критерия, многофакторного анализа выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса (Statistica 10, StatSoft, Inc., США).

Результаты и обсуждение

При изучении экспрессии маркеров была обнаружена только ядерная реакция. Нормальным считалось окрашивание ядер клеток независимо от его интенсивности. Следует отметить, что положительная ядерная реакция наблюдалась в ядрах лимфоцитов, клеток стромы или нормальной окружающей слизистой оболочки в качестве внутреннего контроля [29, 30].

Исследовано 310 образцов операционного материала рака желудка. Позитивный MMR-статус (положительная иммуногистохимическая реакция со всеми четырьмя маркерами) выявлен в 285 (91,9%) случаях из 310, негативный MMR-статус (отсутствие реакции с одним или несколькими маркерами MMR) — в 25 (8,1%) наблюдениях. Полученное значение согласуется с данными других авторов [3, 16, 22, 31, 32], где частота выявления MMR-негативных опухолей варьирует от 4,8 до 25,2%.

Среди 25 MMR-негативных опухолей только в 3 (12%) наблюдениях выявлено отсутствие экспрессии пары MSH2/MSH6, в остальных случаях (88%) отсутствовала экспрессия пары MLH-1/PMS2. Таким образом, опираться только на пару MLH-1/PMS2 при оценке микросателлитной нестабильности рака желудка нецелесообразно, поскольку возникает вероятность пропуска части пациентов с микросателлитной нестабильностью.

Отсутствие экспрессии MSH2 и MSH6 выявлено в 3 наблюдениях — двух тубулярных аденокарциномах low grade (ВОЗ, 2019) (рис. 1), локализовавшихся в средней трети желудка, а также одной низкодифференцированной тубулярной аденокарциноме с субтотальным поражением желудка. Отсутствие экспрессии MLH1 и PMS2 установлено в 22 наблюдениях, среди которых преобладали высоко- и низкодифференцированные тубулярные аденокарциномы (рис. 2), но также выявлены 2 смешанные аденокарциномы, представленные тубулярным и дискогезивным компонентами, и 1 случай аденоплоскоклеточного рака.

Рис. 1. Экспрессия маркеров микросателлитной нестабильности в высокодифференцированной тубулярной аденокарциноме желудка.

Отсутствие экспрессии пары MSH2/MSH6, наличие экспрессии пары MLH1/PMS2.

а, б — окраска гематоксилином и эозином; иммуногистохимическая реакция с антителами к: в — MSH2; г — MLH-1; д — MSH6; е — PMS2. а — об. ×10; б—е — об. ×20.

Рис. 2. Экспрессия маркеров микросателлитной нестабильности в низкодифференцированной тубулярной аденокарциноме желудка.

Наличие экспрессии пары MSH2/MSH6, отсутствие экспрессии пары MLH1/PMS2.

а, б — окраска гематоксилином и эозином; иммуногистохимическая реакция с антителами к: в — MSH2; г — MLH-1; д — MSH6; е — PMS2. а — об. ×5; б—е — об. ×20.

В имеющейся выборке пациентов не проводилось разделение по степеням микросателлитной нестабильности, поскольку все случаи с негативным MMR-статусом демонстрировали отсутствие двух маркеров (либо MSH2/MSH6, либо MLH-1/PMS2), в то время как для разделения на статусы MSI необходима нестабильность одного (MSI-Low) или более маркеров (MSI-High). При таком подразделении все случаи с MMR-негативным статусом можно отнести к группе MSI-High, поскольку отсутствовала экспрессия сразу двух маркеров.

Среди пациентов с MMR-позитивными опухолями 43% (123 наблюдения) составили женщины и 57% (162) — мужчины. Среди MMR-негативных опухолей, напротив, преобладали женщины (60%, 15 наблюдений), а мужчин было лишь 40% (10). Таким образом, определялась тенденция к преобладанию у женщин MMR-негативных опухолей (рис. 3, а) без статистической значимости (p=0,104). Причем частота обнаружения MSH2/MSH6-отрицательных опухолей у мужчин и женщин значимо не различалась (10 и 13% соответственно).

Рис. 3. Структурные диаграммы и диаграммы размаха для пациентов в группах MMR-негативных и MMR-позитивных опухолей.

Структурные диаграммы распределения по: а — полу; в — локализации опухолей по третям желудка; г — дистальной/проксимальной локализации опухолей; д — макроскопической форме опухолей (R.Bormann); е —гистологическому типу опухолей; б — диаграмма размаха распределения по возрасту.

Рис. 3. Структурные диаграммы и диаграммы размаха для пациентов в группах MMR-негативных и MMR-позитивных опухолей. (Продолжение)

Структурные диаграммы распределения: ж — по классификации P. Lauren; з — по наличию/отсутствию перстневидных клеток в опухолях.

Среди пациентов с MMR-позитивными опухолями большинство (86%) составляли лица старше 51 года, однако встречались и более молодые — 39 наблюдений (14%). В группе MMR-негативных опухолей все пациенты были старше 51 года (табл. 1). При анализе распределения прослеживается тенденция к более старшему возрасту пациентов в группе MMR-негативных опухолей (рис. 3, б). При статистическом анализе выявлено значимое преобладание пациентов старше 61 года, имеющих MMR-негативные опухоли (p=0,008).

Таблица 1. Возраст пациентов с MMR-негативным и MMR-позитивным статусом опухоли

Далее оценивали связь MMR-статуса с клинико-морфологическими параметрами (табл. 2). При оценке локализации опухолей в желудке по третям (верхняя, средняя, нижняя) в группе MMR-негативных опухолей большинство новообразований располагалось в нижней трети желудка (14 (56%) из 25 наблюдений) и средней трети желудка (6 (24%) из 25), тотальное поражение не встречалось (рис. 3, в). При этом в группе MMR-позитивных опухолей в нижней трети желудка локализовались лишь 24% новообразований (69 из 285 наблюдений). При статистическом анализе выявлено значимое преобладание случаев, локализующихся в нижней трети желудка среди MMR-негативных опухолей (p=0,048).

Таблица 2. Клинико-морфологические характеристики выборки пациентов с MMR-негативным и MMR-позитивным статусом опухоли

Для оценки дистальной/проксимальной локализации опухолей 1 случай из выборки исключен (наличие опухоли в культе ранее оперированного желудка), таким образом, общее число наблюдений в группах по данному параметру составило 309. Более половины MMR-негативных опухолей характеризовалось дистальной локализацией (15 наблюдений, 60%), 8 (32%) случаев — проксимальной, также встретилось 2 (8%) случая с субтотальным и тотальным поражением желудка (рис. 3, г). MMR-позитивные опухоли, напротив, располагались преимущественно проксимально (161 случай, 57%). При статистическом анализе выявлено значимое преобладание случаев с дистальной локализацией среди MMR-негативных опухолей (p=0,022).

Макроскопически большинство (17 из 25, 68% наблюдений) MMR-негативных опухолей относилось ко 2-му типу по классификации R.Bormann, т.е. представляло собой блюдцеобразные/чашеподобные опухоли с плотными подрытыми краями (рис. 3, д). В группе MMR-позитивных гораздо чаще встречались инфильтративно-язвенный (79 наблюдений, 28%) и диффузно-инфильтративный (58, или 20%) типы рака (см. табл. 2). При статистическом анализе выявлено значимое преобладание случаев, относящихся ко 2-му типу по классификации R.Bormann среди MMR-негативных опухолей (p=0,010).

Анализ распределения по гистологическому типу согласно Классификации ВОЗ (2019) выявил, что 88% (22 случая) MMR-негативных опухолей относятся к тубулярному типу, 8% (2) — к смешанным формам рака, 4% (1 случай) — к аденоплоскоклеточному раку (рис. 3, е). Указанные смешанные формы рака в обоих случаях представляли собой комбинацию тубулярного и дискогезивного гистологических типов. Следует обратить внимание, что среди папиллярного, дискогезивного и муцинозного типов, а также в случае карциномы с лимфоидной стромой не было выявлено ни одной опухоли с MMR-негативным статусом. При статистическом анализе установлено значимое преобладание случаев с тубулярным гистологическим типом среди MMR-негативных опухолей (p=0,010).

При сравнении групп по подтипам согласно классификации P.Lauren выявлено, что в группе MMR-негативных опухолей диффузный подтип не встречался, кишечный диагностирован у 16 (67%) пациентов, опухоли промежуточного подтипа — у 9 (33%) (рис. 3, ж). Из сравнения исключен 1 случай аденоплоскоклеточного рака (n=309). В группе MMR-позитивных опухолей кишечный подтип установлен в 103 (36%) случаях, промежуточный — в 105 (37%), а диффузный — в 77 (27%).

Таким образом, выявлено преобладание кишечного подтипа по P.Lauren в группе MMR-негативных опухолей. При статистическом анализе установлено значимое преобладание случаев с кишечным подтипом по классификации P.Lauren среди MMR-негативных опухолей (p=0,003).

При сравнении групп по наличию перстневидных клеток (рис. 3, з) в опухолях найдены следующие закономерности: в группе MMR-негативных опухолей в подавляющем большинстве случаев перстневидные клетки отсутствовали (21 случай из 25, 84%). В группе MMR-позитивных опухолей распределение отличалось: в 150 (52,6%) случаях из 285 перстневидные клетки отсутствовали, в 135 (47,4%) из 285 присутствовали. При статистическом анализе выявлено значимое преобладание случаев с отсутствием перстневидных клеток среди MMR-негативных опухолей (p=0,022).

Для остальных клинико-морфологических параметров значимых статистических различий не обнаружено.

Данные по общей выживаемости получены для 259 пациентов из 310. Общая пятилетняя выживаемость больных в группе MMR-негативных опухолей составила 76% (умерли 6 (24%) из 25). Медиана не достигнута (рис. 4). Общая пятилетняя выживаемость больных в группе MMR-позитивных опухолей была 36% (умерли 152 (64%) из 234). Медиана составила 35 мес (95% доверительный интервал).

Рис. 4. Анализ выживаемости пациентов при раке желудка в группах MMR-негативных и MMR-позитивных опухолей.

Анализ общей пятилетней выживаемости пациентов выявил статистически значимые различия — p-значение логрангового критерия составило 0,013. Таким образом, выживаемость пациентов в группе MMR-негативных опухолей была значимо выше, чем у пациентов в группе MMR-позитивных новообразований.

Дополнительно был проведен многофакторный анализ выживаемости в регрессионной модели пропорциональных рисков Кокса и установлено, что MMR-статус не является значимым прогностическим признаком (HR=0,983). В настоящее время наличие микросателлитной нестабильности является фактором благоприятного прогноза в значительной степени из-за высокой эффективности иммунотерапии (анти-PD-1) у этих больных, однако набор материала для данного исследования проходил до внедрения иммунотерапии в широкую клиническую практику. Вероятно, поэтому в данной выборке роль микросателлитной нестабильности в качестве независимого прогностического фактора не была подтверждена.

Несколько авторов показали, что по чувствительности и специфичности иммуногистохимический метод и ПЦР сопоставимы между собой в целях выявления микросателлитной нестабильности [33, 34], поэтому он активно используется во всем мире для данной цели [27, 28, 35—37]. Вероятность обнаружения MSI при сохранной экспрессии белков MMR не превышает 4,7% [33]. Для установления микросателлитной нестабильности иммуногистохимические тесты активно используются при подборе лечения рака толстой кишки и рекомендованы международным консенсусом. Таким образом, считаем обоснованным выделение отдельного патогенетического подтипа (MMR-негативного или MSI-подтипа) на основании иммуногистохимического определения MSI. Полученные данные о клинико-морфологических характеристиках и выживаемости пациентов с таким подтипом полностью соответствуют характеристикам MSI-подтипа, публикуемым в большинстве исследований, в том числе и генетических [16, 35].

Заключение

Частота выявления MMR-негативных опухолей в российской популяции составляет 8,1% от всех пациентов с раком желудка. Общая пятилетняя выживаемость больных в группе MMR-негативных опухолей была 76%, что значимо (p=0,013) превышает таковую в группе MMR-позитивных опухолей (36%). Различие в выживаемости и клинико-морфологических характеристиках позволяет выделить эту группу опухолей в отдельный патогенетический подтип рака желудка, называемый MMR-негативным подтипом (или MSI-подтип). Этот подтип чаще выявляется у пациентов старше 61 года, преобладает дистальная локализация опухолей (нижняя треть желудка), 2-й тип по классификации R. Bormann, тубулярный гистологический тип, кишечный подтип по классификации P. Lauren. Других значимых различий между MMR-негативными и MMR-позитивными опухолями по клинико-морфологическим параметрам не установлено. Несмотря на значимые различия в выживаемости, MMR-статус не является независимым прогностическим признаком при раке желудка.

Работа выполнена в рамках госзадания (номер ЦИТИС 121061800151-2) ФГБОУ ВПО «МГУ имени М.В. Ломоносова» и на оборудовании, приобретенном по программе развития ФГБОУ ВПО «МГУ имени М.В. Ломоносова».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.В. Данилова, П.Г. Мальков

Сбор и обработка материала — Н.В. Данилова, А.В. Чайка, В.М. Хомяков

Статистическая обработка данных — Н.В. Данилова

Написание текста — Н.В. Данилова, Н.А. Олейникова

Редактирование — Ю.Ю. Андреева, П.Г. Мальков

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.