Адренокортикальный рак (АКР) — злокачественное новообразование коры надпочечников, которое относится к орфанным заболеваниям с распространенностью 1 случай на 1 000 000 населения в год [1]. В большинстве случаев 5-летняя выживаемость составляет ниже 40% [2]. Вместе с тем известно много случаев благоприятного течения этого крайне агрессивного заболевания с поздним метастазированием и более длительной продолжительностью жизни. Появляется все больше доказательств того, что вариабельность прогноза при данном заболевании обусловлена его выраженной морфологической, пролиферативной и молекулярной гетерогенностью. Так, только в 2017 г. были выделены 4 морфологических подтипа: классический, онкоцитарный, миксоидный и саркоматоидный [3], которые отличаются клиническим течением и исходом. Таким образом, на основании результатов исследований последнего десятилетия АКР рассматривается как гетерогенная группа заболеваний с различными демографическими характеристиками, клинической манифестацией, патоморфологическими и геномными особенностями, биологическим поведением и прогнозом для пациента. В связи с этим важнейшей задачей при диагностике АКР является не только дифференциальная диагностика между доброкачественным и злокачественным новообразованием коры надпочечников, но и прогностическая стратификация. Предсказание течения и исхода крайне необходимо для выбора тактики ведения пациентов с АКР, но в настоящее время затруднено в клинической практике в связи с тем, что на многие вопросы нет окончательного ответа и единого мнения. В частности, появляются данные о различии выживаемости в зависимости от морфологическоих вариантов, при этом их прогностическое значение также не полностью изучено. Ряд новых иммуногистохимических и молекулярных маркеров, обладающих прогностическим потенциалом, находится на стадии экспериментальных исследований или не валидирован на больших выборках [4], вместе с тем нет систематизированных данных относительно маркеров, используемых в рутинной клинической практике.

Цель исследования — определить клинико-патологические параметры, ассоциированные с общей и безрецидивной выживаемостью (ОВ и БРВ соответственно) в группе взрослых пациентов с АКР.

Материал и методы

Дизайн исследования и изучаемая популяция

Выполнены гистологическое и иммуногистохимическое исследования операционного материала пациентов с новообразованиями надпочечников, получивших лечение в НМИЦ эндокринологии Минздрава России, а также консультативного материала из других лечебных учреждений. Часть оперативных вмешательств была произведена в НМИЦ эндокринологии Минздрава России, их выполняли следующие хирурги: И.В. Ким, Д.Г.Бельцевич, В.Э. Ванушко, Н.С. Кузнецов, С.Н. Кузнецов. Создание референс-центра патоморфологических, иммуногистохимических и лучевых методов исследования на базе НМИЦ эндокринологии Минздрава России в 2019 г. позволило создать регистр пациентов с этим крайне редким заболеванием и собрать уникальную коллекцию клинических и патоморфологических данных пациентов не только Москвы, но и других регионов России.

В исследование были включены 73 пациента с гистологически подтвержденным диагнозом АКР: 51 (69,9%) женщина и 22 (30,1%) мужчины в возрасте от 17 до 82 лет (медиана 43 (31,5; 57), 52 (37; 58) и 58 (45,5; 64) лет для классического, онкоцитарного и миксоидного морфологических вариантов АКР соответственно), которым была произведена адреналэктомия в 2005—2020 гг. Пациенты с диагнозами «опухоль с неопределенным злокачественным потенциалом» и «онкоцитарная опухоль с неопределенным злокачественным потенциалом», а также пациенты детского возраста в исследование не включались. Проведен анализ клинических данных, включающих результаты гормонального и инструментального обследования, на основании которого определены статус заболевания, БРВ и ОВ.

Морфологическое исследование

Из гистологического материала АКР, полученного в ходе хирургического лечения пациентов непосредственно в НМИЦ эндокринологии Минздрава России, а также из готовых гистологических блоков по стандартной методике, были получены препараты, окрашенные гематоксилином и эозином. При гистологическом исследовании опухоли верифицировали в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей надпочечника (ВОЗ, 2017). В опухолях оценивали паттерн роста, клеточный и ядерный полиморфизм, количество митозов в 10 полях зрения при увеличении микроскопа в 400 раз, наличие некрозов. Тщательно исследовали капсульную, сосудистую опухолевую инвазию, поражение периадреналовой жировой клетчатки. Для определения злокачественного потенциала опухоли использовали шкалу Weiss, а в случае онкоцитарных новообразований надпочечника, характеризующихся зернистой и ярко эозинофильной цитоплазмой клеток, высоким ядерным полиморфизмом и диффузным характером роста, применяли модифицированную шкалу Lin—Weiss—Bisceglia. На основании результатов гистологического исследования осуществляли стадирование по системе ENSAT (табл. 1).

Таблица 1. Стадирование АКР по классификации Европейской рабочей группы по изучению опухолей надпочечников (ENSAT)

Примечание. Стадия I — опухоль диаметром до 5 см в пределах надпочечника; стадия II — опухоль диаметром >5 см в пределах надпочечника; стадия III — вовлечение прилежащих тканей, наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах или вовлечение регионарных вен; стадия IV — наличие отдаленных метастазов.

Иммуногистохимические методы

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование осуществлялось на полностью автоматизированном иммуногистостейнере Leica Bond III по стандартным протоколам, рекомендованным фирмой-производителем, для этого были использованы моноклональные антитела к Ki-67, фосфогистону H3 (PHH3). Все гистологические препараты отсканированы при помощи системы Aperio производства «Leica Biosystems» для обеспечения объективного подсчета и анализа полученных результатов. Подсчет пролиферативной активности опухолевых клеток (Ki-67) осуществлялся визуальным методом в 10 полях зрения при увеличении 400 и определялся как процент окрашенных клеточных ядер в участках опухоли с наибольшей активностью (горячие точки). Подсчет фигур митоза проводился также визуальным методом в 10 полях зрения при увеличении 400, наличии позитивного окрашивания и характерных морфологических признаков.

Статистический анализ

Проанализирована связь выживаемости со следующими факторами: морфологическим вариантом, размером образования, гормональной активностью, стадией по классификации ENSAT, индексом Ki-67, митотической активностью, параметрами шкалы Weiss. Для анализа выживаемости использовалась регрессионная модель Кокса. Выполнены независимый и мультивариантный регрессионный анализ, который проводился методом отношения правдоподобия. Статистически значимые факторы в соответствии с результатами независимого регрессионного анализа были включены в анализ методом Каплана—Мейера с последующим попарным сравнением методом log-rank-теста. Различия признаны статистически достоверными при p<0,05. Разделение на подгруппы при апостериорном сравнительном анализе исчисляемых переменных проводилось по принципу равномерного распределения числа пациентов по подгруппам. Для непосредственных статистических расчетов использовалось программное обеспечение IBM SPSS Statistics версия 26.0.

Результаты

Клинические и морфологические характеристики пациентов с АКР

Характеристики пациентов с АКР, полученные в результате сбора и анализа клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных данных, гистологического и иммуногистохимического исследований операционного и консультативного материала, представлены в табл. 2.

Таблица 2. Клинические и морфологические характеристики пациентов с АКР

Классический вариант был диагностирован у 49 (67,1%) пациентов, онкоцитарный — у 15 (20,5%), миксоидный — у 9 (12,3%); саркоматоидный вариант в данном исследовании выявлен не был. Характеристика морфологических вариантов АКР в зависимости от параметров шкалы Weiss представлена на рис. 1.

Рис. 1. Параметры шкалы Weiss при различных вариантах адренокортикального рака.

При независимом регрессионном анализе факторами, статистически достоверно влияющими на БРВ, были морфологический вариант, индекс Ki-67, митотическая активность, наличие атипических митозов и гормональная активность (рис. 2).

Рис. 2. Предикторы безрецидивной выживаемости у пациентов с АКР.

Здесь и на рис. 3: ГА — гормональная активность.

Классический вариант ассоциировался с увеличением шанса рецидива (ОШ, 3,2; p=0,02) по сравнению с онкоцитарным вариантом. Миксоидный вариант также увеличивал шанс рецидива, но не достигал уровня статистической значимости (ОШ, 2,7; p=0,12). Пятилетняя БРВ составила 29,9, 33,3, 66,8% для классического, миксоидного и онкоцитарного вариантов соответственно. Каждое увеличение индекса Ki-67 на 1% соответствовало повышению шанса рецидива на 3,2% (ОШ, 1,032; p=0,005), а увеличение значения митотической активности на 1 — в 1,060 раза (p<0,001). Обнаружена корреляция одного из параметров шкалы Weiss (наличие патологических митозов) с худшей БРВ (ОШ, 4,156; p=0,05), остальные параметры не оказывали статистически достоверного влияния на выживаемость. Избыточная секреция альдостерона повышала шанс рецидива (ОШ, 27,4; p=0,007). Пятилетняя БРВ составила 62,2, 40,3, 32,8, 0% для I, II, III и IV стадий соответственно. После включения факторов в модель множественной регрессии статистическую значимость сохраняли гормональная и митотическая активность.

В соответствии с результатами сравнительного анализа у подгрупп со значениями митотической активности до 10 и от 10 до 20 наблюдалась лучшая медиана БРВ, чем у подгруппы, где активность была >20 (65, 32 и 6 мес соответственно; p<0,001). БРВ была статистически достоверно благоприятнее у подгруппы с индексом Ki-67 <12, чем у подгрупп со значениями этого параметра 12—25 (p=0,015) и >25 (p=0,013; 89, 11 и 6 мес соответственно). Онкоцитарный вариант ассоциировался с лучшей БРВ по сравнению с классическим (p=0,012; медиана БРВ не достигала и 8 мес), а наличие патологических митозов — с худшей БРВ (p=0,031; не достигалась в случае отсутствия, составляла 23 мес при их наличии). Избыточная секреция альдостерона согласовывалась с худшей БРВ по сравнению с отсутствием гормональной активности или секрецией других гормонов (p=0,002). Медианы выживаемости составили 1, 23, 38, 65, 32 для гиперальдостеронизма, гиперандрогении, гиперкортицизма, смешанной гормональной активности и ее отсутствия соответственно.

Общая выживаемость

При независимом регрессионном анализе переменными, ассоциирующимися с ОВ, являлись стадия по классификации ENSAT, морфологический вариант, индекс Ki-67 и митотическая активность (рис. 3).

Рис. 3. Предикторы общей выживаемости у пациентов с АКР.

Для II и III стадий по классификации ENSAT выявлено снижение риска смерти на 87,2% (ОШ, 0,128; p=0,001) и 74,7% (ОШ, 0,253; p=0,018) по сравнению со стадией IV. Для стадии I также можно утверждать о снижении шанса смерти, но значение коэффициента expB не может быть корректно рассчитано ввиду отсутствия событий в подгруппе ENSAT I. Пятилетняя ОВ составила 100, 80,4, 63,6, 0% для I, II, III и IV стадий соответственно. Как классический, так и миксоидный варианты ассоциировались с более высоким риском смерти (p<0,001) по сравнению с онкоцитарным вариантом. Значение expB не может быть корректно рассчитано вследствие отсутствия событий в подгруппе онкоцитарного АКР. Пятилетняя ОВ — 55,9, 75,0, 100% для классического, миксоидного и онкоцитарного вариантов соответственно. Каждое увеличение индекса Ki-67 на 1% согласовывалось с повышением риска смерти на 5,8% (ОШ, 1,058; p<0,001), а каждое увеличение значения митотической активности на 1 — в 1,076 раза (p<0,001). По результатам многофакторного регрессионного анализа независимыми предикторами ОВ были митотическая активность и стадия по ENSAT. Стадии ENSAT I—III ассоциировались с меньшим шансом смерти по сравнению со стадией IV, но статистически значимые различия были выявлены только со стадией II (p=0,033).

Обнаружена корреляция стадии IV классификации ENSAT с худшей ОВ по сравнению с остальными стадиями (p=0,002, p<0,001, p=0,011 для I, II, III стадий соответственно). Подгруппы со значениями митотической активности до 10 и от 10 до 20 согласовывались с лучшей ОВ по сравнению с подгруппой, где активность была >20 (p<0,001; медиана ОВ не достигалась для первых двух групп и составляла 10 мес в последнем случае). ОВ подгруппы со значениями индекса Ki-67 <12 была статистически достоверно благоприятнее, чем подгрупп со значениями 12—25 (p=0,029) и >25 (p=0,002; медиана ОВ не достигалась для первых двух групп и составляла 56 мес в последнем случае). Онкоцитарный вариант ассоциировался с лучшей ОВ по сравнению с классическим (p=0,005). Медианы выживаемости не рассчитаны для факторов «стадия по классификации ENSAT» и «морфологический вариант», так как в подгруппах «ENSAT I» и «онкоцитарный вариант» не было событий.

Обсуждение

Несмотря на ограниченную распространенность АКР, изучение диагностических и прогностических особенностей данного заболевания по-прежнему занимает особое место в онкологии, эндокринологии и патоморфологии. АКР является не только наиболее часто встречающейся первичной злокачественной опухолью надпочечника [5], но и вторым по частоте после анапластической карциномы щитовидной железы злокачественным новообразованием эндокринных органов, при котором регистрируется наибольшая летальность [6]. Даже в случае высокоагрессивного биологического и клинического поведения этой злокачественной опухоли, в некоторых случаях заболевание ассоциируется с длительной БРВ и ОВ. В связи с этим задача патоморфолога состоит не только в том, чтобы установить адренокортикальное происхождение и злокачественную природу новообразования надпочечника, но и в том, чтобы охарактеризовать предполагаемую выживаемость пациента. Достоверная прогностическая стратификация при любом онкологическом заболевании имеет крайне важное значение для принятия решения о назначении адъювантной терапии, определения особенностей последующего наблюдения пациента, а также для того, чтобы информировать пациентов касательно режима лечения, ближайших и отдаленных исходов. В случае АКР в ряде работ были идентифицированы клинико-патологические факторы, ассоциированные с повышенным риском рецидива и смерти, однако иногда данные противоречивы и несистематизированы, отсутствует консенсус в том, какие именно параметры являются ключевыми, не существует единой повсеместно принятой прогностической системы, еще не определен оптимальный метод для стратификации. Усовершенствование геномных технологий привело к появлению новых молекулярных классификаций АКР и выделению подгрупп с различными показателями выживаемости [7—10]. Однако анализ транскриптома и другие молекулярные инструменты все еще не являются широкодоступными, что свидетельствует о важности и необходимости использования рутинных маркеров для прогностической стратификации. В настоящем исследовании оценивалась прогностическая значимость иммуногистохимических маркеров, повсеместно использующихся в клинической практике, — Ki-67 и PHH3. В соответствии с нашими данными, оба фактора оказывали статистически достоверное влияние как на ОВ, так и на БРВ, но после включения факторов в модель множественной регрессии прогностической ценностью среди маркеров пролиферативной активности обладал только PHH3. Митотическая активность является фундаментальным критерием при диагностике адренокортикальной карциномы вне зависимости от используемого диагностического алгоритма, корректная оценка которого особенно важна в случае пограничной степени злокачественности. При этом техническая вариабельность и различия, возникающие при диагностике разными специалистами, в значительной мере влияют на точность оценивания. Повысить точность можно при помощи специфического окрашивания антителами к PHH3, мишенью которого является белок корового гистона H3 в позиции 10 серина (рис. 4). Этот белок максимально визуализируется в процессе конденсации хромосом в раннюю профазу и незначительно — в другие фазы митотического цикла, а также в апоптоз. Окрашивание на PHH3 являлось надежным и простым методом подсчета митотического индекса в других злокачественных новообразованиях как с диагностической, так и с прогностической целью [11]. Результаты нашей работы представляют интерес, так как в нескольких исследованиях было показано, что индекс Ki-67 имеет большее прогностическое значение при АКР, чем количество митозов. При этом подгруппы со значениями митотической активности до 10 и от 10 до 20 были статистически достоверно благоприятнее по БРВ и ОВ, чем подгруппа при значении >20, что соответствует данным предыдущих исследований, на основании которых пороговое число для разделения АКР на low-grade и high-grade составило 20. Также интересно, что была обнаружена корреляция наличия атипических митозов с худшей БРВ, так как ранее среди всех параметров шкалы Weiss единственным критерием, ассоциированным с прогнозом пациента, являлся митотический индекс [2].

Рис. 4. Иммуногистохимическое окрашивание АКР антителами к фосфогистону (PHH3), ×100.

Гистологические варианты АКР характеризуются выраженной морфологической гетерогенностью, а также отличаются определенными профилями иммуногистохимической экспрессии [12]. Их дальнейшее исследование имеет особое значение в контексте не только диагностического, но и прогностического применения. По данным литературы [13], медиана выживаемости составляла 17—35 мес для классического, 60 мес для онкоцитарного, 29 мес для миксоидного и 7 мес для саркоматоидного вариантов. Пятилетняя выживаемость варьировала для классического варианта от 40 до 70%, по данным работы J. Kanitra и соавт. [14], она составляла 47% для онкоцитарного варианта. Наиболее длительная выживаемость, зарегистрированная у пациентов с миксоидным вариантом, составила 69 мес [13]. Результаты нашего исследования подтверждают имеющиеся данные, что онкоцитарный вариант ассоциируется с лучшей ОВ по сравнению с классическим и миксоидным вариантами. Однако в случае БРВ различия миксоидного и онкоцитарного вариантов не достигали статистической значимости. Возможно, количество случаев в группе миксоидного варианта (n=8) затрудняет поиск статистически значимых различий. Существуют данные, что прогноз для пациентов с миксоидным вариантом немного хуже, чем с классическим [13]. При сравнительном анализе статистически достоверные различия также обнаружены только между онкоцитарным и классическим вариантами.

Среди клинических факторов статистически значимое влияние на ОВ оказывала только стадия в соответствии с классификацией ENSAT, вместе с митотической активностью являясь независимым предиктором ОВ. В случае БРВ различия не достигали статистической значимости. Следует принять во внимание, что в подгруппе ENSAT IV в случае анализа ОВ было всего 6 пациентов, а в случае БРВ — 3, что затрудняет поиск статистически значимых различий. Также была обнаружена корреляция между избыточной секрецией альдостерона и увеличением риска рецидива, но следует учитывать, что в этой группе находился только 1 пациент. В настоящее время данные о взаимосвязи функциональной активности опухоли и прогноза противоречивы. Широко обсуждается влияние гиперсекреции кортизола, которая являлась неблагоприятным фактором, ассоциировавшимся с повышенным риском рецидива и смерти в некоторых работах [2]. В то же время в ряде других исследований, в том числе в нашем, прогностическая ценность гиперкортицизма не была подтверждена.

Важно принять во внимание, что выборочная совокупность с учетом орфанного характера исследуемого заболевания и объем собранных нами клинико-патологических данных действительно велики, но в контексте регрессионного анализа этого недостаточно. При этом некоторые случаи не были включены в многофакторную модель из-за отсутствия сведений по каким-либо параметрам. Отсутствие данных обусловлено тем, что не все пациенты с самого начала наблюдались и проходили лечение в нашем учреждении. В связи с этим результаты мультифакторного регрессионного анализа на данном этапе не могут быть достаточно информативными, чтобы разрабатывать прогностическую систему. Также следует учитывать, что в настоящей работе морфологический вариант рассматривается как самостоятельный прогностический фактор. Результаты исследования подтверждают важность определения гистологического подтипа на этапе диагностики АКР в связи с различными прогностическими особенностями. Численность исследуемой когорты пациентов не позволила проанализировать параметры, характерные для каждого из четырех морфологических вариантов, которые потенциально могут быть идентифицированы как предикторы агрессивного течения заболевания. Еще более детальное исследование прогностических особенностей морфологических вариантов, определение предикторов течения и исхода для каждого подтипа, а также разработка диагностического алгоритма, который позволит усовершенствовать прогностическую стратификацию на индивидуальном уровне, создать рекомендации по персонализированному ведению пациента с учетом клинических, морфологических и иммуногистохимических характеристик заболевания, являются дальнейшими направлениями нашего исследования АКР.

Заключение

Таким образом, в настоящей работе выявлены потенциальные морфологические, иммуногистохимические и клинические предикторы течения АКР. Насколько нам известно, это первое исследование, где выполнен комплексный анализ прогностической ценности важнейших диагностических параметров АКР. В данной работе учитывается широкий спектр факторов, на основе которых базируется диагностика АКР в клинической практике. В результате на основании совокупности клинически значимых данных пациенты могут быть разделены на отдельные прогностические группы в отношении возникновения рецидива и отдаленных исходов. Так, с повышенным риском рецидива ассоциируется наличие патологических митозов, избыточная секреция альдостерона, смерти — IV стадия по ENSAT, рецидива и смерти — значения митотической активности >20, индекс Ki-67 >12, классический вариант. Независимыми предикторами БРВ являлись митотическая активность и гормональная активность, ОВ — митотическая активность и стадия по ENSAT.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Л.С. Урусова

Сбор и обработка материала — Л.С. Урусова, Э.Э. Порубаева, Н.В. Пачуашвили

Статистическая обработка данных — Л.С. Урусова, Э.Э. Порубаева

Написание текста — Л.С. Урусова, Э.Э. Порубаева

Редактирование — Л.С. Урусова

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.