Болезнь Паркинсона (БП) рассматривается как одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, она встречается с частотой 1—2 случая на 1000 населения [1]. В основе патологического процесса при БП лежит протеинопатия, проявляющаяся на молекулярном уровне в нарушении агрегации белка альфа-синуклеина, который накапливается в структурах центральной и периферической нервной системы [2], и сочетающаяся с ферропатией — отложением железа и железосодержащих белков [3].

Альфа-синуклеин — это пресинаптический белок, он имеет простую структуру и участвует в процессах везикулярного транспорта [4]. Высокая концентрация этого белка при окислительном стрессе, инициирующем нейродегенерацию, может запускать каскад реакций, способствующих его аномальной внутриклеточной агрегации [5]. Агрегированный альфа-синуклеин подвергается фосфорилированию по остатку серина-129 (α-Syn-p129) и накапливается в нейронах нигростриатных образований головного мозга [6], в периферических вегетативных нейронах [7] и нервных волокнах [8]. Патологические включения α-Syn-p129 обнаруживают иммуногистохимическими методами в перечисленных выше структурах нервной системы в аутопсийном материале пациентов с БП [9].

Двухвалентное железо (II) при помощи рецепторов трансферрина поступает в нервные клетки из диферринового трансферрина (белка плазмы крови) [10]. В дофаминовых нейронах нигростриатной системы ионы железа (II) участвуют в синтезе дофамина из L-диоксифенилаланина, отдавая один электрон и образуя трехвалентное железо (III), которое, если оно не восстанавливается, может запускать реакцию Фентона, связанную с образованием окислительных свободных радикалов [11]. В нейронах трехвалентное железо связывает цитоплазматический пигмент нейромеланин, выполняющий роль хелатирующего агента [10]. В клетках нейроглии аналогичную роль по отношению к ионам железа (III) играет белок ферритин.

При БП железо накапливается в структурах компактной части черного вещества головного мозга, что было показано при использовании как методов гистохимии [12], так и метода рентгенологической абсорбционной спектроскопии [13], который позволил не только обнаружить соединения железа, связанные с нейромеланином, но и вычислить их количественные параметры. Вместе с тем в литературе нет единого представления об изменениях экспрессии ферритина при БП: по мнению одних авторов, она увеличивается [14], по мнению других — она не меняется [15]. При этом оценка изменений метаболизма железа и железосодержащих белков в нигростриатных структурах головного мозга при БП будет неполной без определения локализации и состояния рецепторных зон трансферриновых рецепторов в клетках. В то же время сведений о том, подвергаются ли морфологическим изменениям трансферриновые рецепторы клеточных структур черного вещества головного мозга при БП, в доступной литературе мы не нашли.

Цель работы — исследовать, используя комплексный морфохимический подход, локализацию альфа-синуклеина, соединений железа и железосодержащих белков в структурах черного вещества головного мозга при болезни Паркинсона.

Материал и методы

Аутопсийные образцы среднего мозга были взяты как у лиц со смешанной формой БП, которые умерли от интеркуррентных заболеваний (возраст 60, 61, 63 и 70 лет — 4 случая), так и у лиц контрольной группы, у которых при жизни не выявляли неврологической симптоматики (60—70 лет — 6 случаев). Образцы мозга фиксировали в 4% растворе формалина, подвергали стандартной гистологической обработке и заключали в парафиновые блоки, которые раскладывали на серии фронтальных срезов толщиной 10 мкм в границах структур, соответствующих компактной части черного вещества головного мозга. На одной части срезов гистохимическим методом выявляли соединения железа (II), на другой иммуногистохимическими методами — железосодержащие белки и альфа-синуклеин. Соединения железа (II) определяли методом Перлса при помощи 2% раствора гексацианоферрата (II) калия и 2% раствора соляной кислоты, предварительно обрабатывая срезы 30% раствором перекиси водорода в течение 30 мин. Патологическую форму фосфорилированного альфа-синуклеина (α-Syn-p129) в структурах черного вещества выявляли, используя иммуноферментный и иммунофлюоресцентный методы. При проведении первого метода применяли первичные антитела к α-Syn-p129 (фирма Abcam, №ab184674), а в качестве хромогена — вторичные антитела из набора Sigma EXTRA-3 и 3,3-диаминобензидин. При выполнении второго метода также использовали первичные антитела к α-Syn-p129 (фирма Abcam, №ab184674), а иммунофлюоресцентное окрашивание проводили вторичными антителами козы к иммуноглобулинам кролика, которые были конъюгированы с флюорохромом CF488 (фирма Sigma). Иммунофлюоресцентным методом выявляли и трансферриновый рецептор, используя первичные антитела к трансмембранному гликопротеину CD71 (фирма Abcam, №ab84036), а соответствующее окрашивание проводили вторичными антителами осла к иммуноглобулинам мыши, которые были конъюгированы с флюорохромом CF555 (фирма Sigma). В глиальных клетках (астроглии, олигодендроглии и микроглии) ферритин выявляли иммуноферментным методом с двойной меткой, применяя кроличьи антитела к тяжелой цепи ферритина (фирма Abcam, №ab75972). Идентифицировали астроглию с помощью реакции на GFAP, используя мышиные антитела (фирма Leica, №PA0026), олигодендроглию — реакции на циклонуклеотидфосфатазу (CNP) с применением мышиных антител к этому ферменту (фирма Sigma, №AMAb91068), а микроглию — реакции на белок CD68 также с помощью мышиных антител к этому белку (фирма Abcam, №ab201340). Иммуноферментные реакции проводили на гистостейнере Leica BOND MAX (фирма Leica), используя набор двойной детекции ChromoPlex-1 (фирма Leica, №DS9477). Локализацию α-Syn-p129, железа и железосодержащих белков в структурах черного вещества оценивали под микроскопом Leica DMLB, оснащенным цифровой фотокамерой с программой анализа изображений Leica Qwin. Микрофотографии иммунофлюоресцентных препаратов получали на микроскопе Nikon Ni-E, используя монохромную камеру Nikon Ds-Qi.

Результаты и обсуждение

Проведенное исследование показало, что соединения железа (II), выявляемые гистохимическим методом, локализовались в структурах компактной части черного вещества как в контрольной группе, так и у больных БП (рис. 1, а, б). В группе контроля соединения железа (II) располагались относительно равномерно в нейропиле, однако их обнаруживали и вокруг стенок сосудов, и в единичных клетках нейроглии (см. рис. 1, а). По сравнению с контролем у больных БП исследуемые соединения в нейропиле окрашивались интенсивнее, но неравномерно, для клеточных элементов было характерно их наличие в нейроглии, в нейронах они определялись в единичных клетках (см. рис. 1, б).

Рис. 1. Соединения железа в компактной части черного вещества мозга лиц контрольной группы (а) и пациентов с болезнью Паркинсона (б).

Стрелками показаны клетки нейроглии, содержащие соединения железа. Реакция Перлса, докрашивание красным прочным, ×400.

Иммуноферментным методом патологическую форму альфа-синуклеина α-Syn-p129 не обнаруживали в контроле, но выявляли во всех исследованных случаях БП (рис. 2, а, б). Агрегаты α-Syn-p129 располагались в виде скоплений белка в нейритах (см. рис. 2, а), а также в виде телец Леви, локализовавшихся как в цитоплазме нейронов, так и вне клеток (см. рис. 2, б). Иммунофлюоресцентным методом фосфорилированный альфа-синуклеин в структурах черного вещества обнаружили только в 1 случае из 6 образцов контрольной группы (рис. 3, а), а в аутопсийных образцах больных БП его определяли во всех исследованных случаях. Эта патологическая форма альфа-синуклеина в виде агрегатов белка выявлялась в телах нейронов и их отростках, а также в окружающем нейропиле (рис. 3, б). Иммуноокрашивание на трансферриновый рецептор характеризовалось равномерной мембранной реакцией на гликопротеин CD71 в клетках черного вещества лиц контрольной группы и пациентов с БП (см. рис. 3, а, б).

Рис. 2. Патологические белковые агрегаты в черном веществе мозга человека при болезни Паркинсона.

а — синуклеинпозитивные включения в нервных волокнах (стрелки), ×400; б — тельце Леви (стрелка), локализованное вне пигментированного нейрона, ×1000. Иммуногистохимическая реакция на α-Syn-p129, докрашивание крезиловым фиолетовым.

Рис. 3. Патологические белковые агрегаты и белок рецепторов трансферрина (CD71) в черном веществе мозга лиц контрольной группы (а) и пациентов с болезнью Паркинсона (б).

Стрелки — локализация синуклеинпозитивных включений в отростках нейронов, звездочки — локализация белка CD71 вдоль поверхности тел нейронов. Двойное иммунофлюоресцентное окрашивание на α-Syn-p129 (зеленым) и белок рецепторов трансферрина CD71 (красным), ×400.

Определение типа глиальных клеток, в которых локализовался ферритин, показало, что во всех изученных случаях и в контрольной группе, и у лиц с БП он располагался в нейропиле вокруг клеток астроглии, содержащей GFAP (т.е. был солокализован с продуктом GFAP-реакции и изображения накладывались), и в клетках микроглии (рис. 4, 5). При оценке реакции на белок активированной микроглии CD68 отмечено, что в контрольной группе ферритин выявлялся в единичных клетках микроглии (см. рис. 5, а), а у лиц с БП он определялся во множестве микроглиальных клеток (см. рис. 5, б). Проведение иммуногистохимических реакций на выявление ферритина и глиоспецифических белков в структурах черного вещества головного мозга не позволило обнаружить ферритин в клетках олигодендроглии, но помогло выявить его в нейронах как контрольной группы (см. рис. 5, а), так и лиц с БП (см. рис. 4, б; 5, б).

Рис. 4. Ферритин в клетках ретикулярной части черного вещества головного мозга лиц контрольной группы (а) и пациентов с болезнью Паркинсона (б).

Локализация ферритина в микроглии (стрелки), в цитоплазме нейрона (звездочка). Двойное иммуногистохимическое окрашивание на GFAP-позитивную астроглию (коричневым) и ферритин (красным), докрашивание гематоксилином, ×400.

Рис. 5. Ферритин в клетках компактной части черного вещества головного мозга лиц контрольной группы (а) и пациентов с болезнью Паркинсона (б).

Ферритин в микроглии (стрелки), в цитоплазме нейронов (звездочки). Двойное иммуногистохимическое окрашивание на белок микроглии CD68 (коричневым) и ферритин (красным), докрашивание гематоксилином, ×400.

Проведенное исследование помогло обнаружить соединения железа (II) и тяжелую цепь ферритина в клетках нейроглии и нейропиле компактной части черного вещества в контрольной группе и у больных БП, но при БП интенсивность реакции при выявлении железа была выше, и исследуемые соединения определялись во многих клетках нейроглии. По данным литературы, соединения железа при физиологическом старении накапливаются как в нейронах, так и в нейроглии [16], но при БП их концентрация в структурах черного вещества по сравнению с физиологическим старением увеличивается в 2 раза [17]. Следовательно, сопоставляя наши результаты с данными литературы, можно предположить, что при БП железо может избыточно накапливаться как в нейронах, так и нейроглии черного вещества головного мозга. На это указывает и тот факт, что в нашем исследовании у больных БП по сравнению с контролем метаболиты, содержащие тяжелую цепь ферритина — белка, связывающего ионы железа, — в значительном количестве локализовались в клетках нейроглии компактной части черного вещества. Если принять во внимание, что при БП происходит избыточная экспрессия тяжелой цепи ферритина, которая катализирует быстрое окисление железа (II) до трехвалентной формы (III) [18], и при этом железо (III) не восстанавливается, то эта ситуация будет усиливать окислительный стресс и усугублять нейродегенерацию. В литературе показана роль железа в регуляции экспрессии эндогенного альфа-синуклеина [19] и установлено, что его фосфорилированная форма накапливается у больных БП в телах и отростках нейронов компактной части черного вещества головного мозга [20]. Результаты нашего гистохимического и иммуногистохимического исследования структур головного мозга при БП — интенсивная реакция на железо в клеточных элементах и нейропиле, выявление скоплений α-Syn-p129 в телах и отростках нейронов и окружающем их нейропиле — не дают достаточных оснований для оценки роли соединений железа в увеличении экспрессии фосфорилированного альфа-синуклеина. Однако они позволяют установить, что указанные метаболиты (соединения железа и α-Syn-p129) накапливаются в структурах компактной части черного вещества головного мозга при нейродегенерации, а обнаруженные изменения при БП устойчивы и необратимы, что хорошо согласуется с данными литературы [21]. Кроме того, удалось показать, что в единичных случаях α-Syn-p129 может концентрироваться в нигростриатных структурах головного мозга и у лиц пожилого возраста без неврологических симптомов при жизни, что также соотносится с источниками литературы [4]. Вместе с тем такое накопление может указывать и на развитие ранней стадии БП, характеризующейся отсутствием отчетливой клинической симптоматики со стороны центральной нервной системы.

Результаты, полученные при изучении локализации и экспрессии гликопротеина CD71 (трансферринового рецептора) в клеточных структурах черного вещества головного мозга, свидетельствуют о том, что его локализация и экспрессия в указанных структурах при БП по сравнению с контролем не изменяются. В связи с этим можно предположить, что при БП по сравнению с физиологическим старением транспорт железа в клетках компактной части черного вещества не затрудняется и даже не блокируется на поздних стадиях заболевания. Так как по мере развития БП железо продолжает поступать в клетки и его содержание по сравнению с физиологическим старением увеличивается, то это может перенасыщать сайты хелатирования нейромеланина в пигментированных нейронах [22] и способствовать гибели этих нейронов. Железо из гибнущих нейронов будет накапливаться в ферритинпозитивной микроглии [23], однако превышение буферной способности ферритина микроглиальных клеток, как и нейромеланина пигментированных нейронов, может усиливать нейротоксичность [24].

Заключение

Сравнительное гистохимическое и иммуногистохимическое исследование структур компактной части черного вещества головного мозга человека, проведенное на аутопсийном материале пациентов с БП и лиц с не выявленной при жизни неврологической симптоматикой (контрольная группа), позволило обнаружить:

— устойчивое накопление в мозге пациентов с БП патологической формы фосфорилированного альфа-синуклеина (α-Syn-p129), который локализовался в телах и отростках пигментированных нейронов и окружающем их нейропиле;

— устойчивое накопление в мозге пациентов с БП соединений железа (II), которые локализовались преимущественно в нейроглии и нейропиле, а в нейронах они определялись лишь в единичных клетках;

— избыточное накопление в мозге пациентов с БП тяжелой цепи ферритина, которая обнаруживалась в клетках нейроглии, что может способствовать повышению концентрации реактивной формы железа в структурах черного вещества и приводить к усилению нейротоксичности;

— равномерную мембранную реакцию клеточных структур черного вещества на гликопротеин CD71 как в контроле, так и у пациентов с БП, свидетельствующую о сохранности транспорта железа в эти структуры при БП.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.Н. Сальков, Р.М. Худоерков

Сбор и обработка материала — В.Н. Сальков, Д.Н. Воронков, В.Б. Соболев

Подготовка рисунков — Д.Н. Воронков

Написание текста — В.Н. Сальков, Р.М. Худоерков

Редактирование — Р.М. Худоерков

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.