Хроническое облитерирующее заболевание нижних конечностей (ХОЗНК), клинико-морфологическим проявлением которого является хроническая артериальная недостаточность нижних конечностей, представляет собой полиэтиологичный синдром, характеризующийся длительным, стойким, нередко прогрессирующим поражением артерий ног, приводящим к окклюзионно-тромботическим осложнениям, развитию тканевой гипоперфузии и гипоксии. Следствием этого являются дегенеративно-дистрофические и некротические изменения покровов конечности, мышечной и других тканей [1]. Значительный вклад в структуру ХОЗНК вносит атеросклероз, который нередко в качестве неблагоприятного фона связан с сахарным диабетом. Меньшая доля обусловлена аутоиммунным поражением компонентов сосудистой стенки (болезнь Бюргера, поражение периферических сосудов при неспецифическом аортоартериите) и другими патологическими процессами [2].
Патоморфогенез поражения артерий различного диаметра и последующее развитие недостатка циркуляции в тканях конечностей в основном изучены [1, 3]. За рамками внимания патоморфологов, как правило, остаются изменения, формирующиеся в ответ на гипоксическое повреждение в поперечнополосатой скелетной мышечной ткани (ППСМТ). Исследователи отмечают, что мышцы в бассейне окклюзированной артерии подвергаются последовательным изменениям: утрачивается гликоген, происходят некроз, фиброз и атрофия мышечного органа в целом [4]. При анализе клинического материала показано, что во фрагментах тканей обнаруживаются мышечные волокна с центрально расположенными ядрами [5], уменьшается средняя площадь поперечного сечения мышечных волокон [6]. Противоречивые данные получены касательно соотношения сосудов микроциркуляторного русла и мышечных волокон [7, 8], а также преимущественного выживания разных типов мышечных волокон при ХОЗНК [6, 9]. Вместе с тем следует отметить, что ряд закономерностей установлен лишь в эксперименте [10], что не может не отражаться на результатах патоморфологического и морфометрического анализов.
Цель исследования — на материале биопсий икроножной мышцы (медиальная головка), полученных от пациентов с ХОЗНК, оценить патогистологические признаки повреждения и регенерации в поперечнополосатой скелетной мышечной ткани.
Материал и методы
В исследование были включены 44 мужчины с хронической ишемией нижних конечностей IIБ—IV степени (по Покровскому—Фонтейну). У всех пациентов было получено информированное согласие на исследование согласно Хельсинкской декларации (2013). Протокол исследования одобрен Республиканским комитетом по этическим вопросам (протокол №10 от 23.11.05).
Критерии включения: проходимость аортобедренного сегмента и глубокой артерии бедра, в том числе после хирургической реконструкции; возраст 65 лет и моложе; длительность заболевания не менее 6 мес, а также не менее 6 мес, прошедших после последней реконструктивной операции, если она выполнялась.
Критерии невключения: тяжелая сердечно-сосудистая недостаточность; сердечно-сосудистые события в анамнезе сроком <6 мес; сахарный диабет; нарушение сознания; онкологический анамнез; положительные маркеры к вирусным гепатитам и ВИЧ.
Для определения параметров кровоснабжения конечности выполнялись функциональные исследования, в частности тредмил-тест (измерение дистанции безболевой ходьбы) согласно рекомендациям TASC II [2]. Верификация диагноза проводилась при помощи дистальной артериографии нижних конечностей.
В условиях операционной под инфильтрационной анестезией через кожный разрез на уровне середины голени производили биопсию медиальной головки икроножной мышцы размером 0,5×0,5×0,5 см. Поперечные парафиновые срезы ППСМТ окрашивали гематоксилином и эозином для определения морфометрических параметров мышечных волокон. Трихром по Маллори применен для определения доли соединительной ткани. Иммуногистологические исследования выполняли с использованием моноклональных антител к CD34 для установления капиллярной плотности (КП) — количества капилляров и артериол, приходящихся на одно мышечное волокно (клон QBEnd/10, «Novocastra», Великобритания), ядерному антигену пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA, клон PC10, «Dako», Дания), миогенину для визуализации активированных миосателлитоцитов (клон F5D, «Dako», Дания), эффекторной каспазе-3 (клон E87, «Abcam», Великобритания). Выбор антител был обусловлен необходимостью маркировать в тканевых образцах ключевые белки, свидетельствующие о событиях повреждения и (или) регенерации.
Количественные морфометрические показатели выражали в виде медианы (1-й квартиль; 3-й квартиль). Статистический анализ результатов проводили с помощью U-критерия Манна—Уитни в программе Statistica 8.0. с уровнем значимости p<0,05.
В связи с этическими ограничениями получения тканевого материала икроножных мышц от добровольцев в качестве контрольных образцов (n=4) был взят секционный материал у умерших от причин, не связанных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы, без атеросклеротического поражения ветвей аорты.
Результаты
Пациенты, включенные в исследование (n=44) по нозологической форме, приведшей к ХОЗНК, распределились следующим образом: атеросклероз сосудов нижних конечностей — 21, причем у 13 было выявлено поражение артерий дистальных сегментов, а у 8 — так называемое многоэтажное поражение с вовлечением и проксимального сегмента; синдром Лериша был диагностирован у 12 больных; болезнь Бюргера — у 7; поражение периферических сосудов при неспецифическом аортоартериите — у 4.
Средний возраст пациентов на момент включения в исследование составил 54±9,8 года. При раздельном рассмотрении пациентов с атеросклерозом и аутоиммунным поражением сосудов разница средних возрастов составила около 8 лет — 56±7,8 и 48±12,6 года соответственно, что укладывается в общие представления о периодах развития клинически значимых окклюзий при этих нозологических формах. Средняя длительность заболевания составила 4±3 года с диапазоном от 0,5 до 15 лет.
Ранжирование пациентов по степеням заболевания согласно действующей классификации хронической артериальной недостаточности Покровского—Фонтейна приведено в табл. 1. Большая часть заболевших на момент обращения к врачу входили в группу со степенью тяжести IIБ — 77%, при которой без боли в икроножных мышцах пациент проходит не более 200 м. Показатель «лодыжечно-плечевой индекс» (ЛПИ) коррелировал с приведенным распределением пациентов по степеням тяжести. Следует отметить, что в основу клинической классификации степени тяжести заложен субъективный критерий (ощущение боли). Учитывая, что не менее чем у 2/3 пациентов диагностирована одна степень тяжести артериальной недостаточности, а у пациентов с трофическими нарушениями (IV степень, n=3) на тредмил-тесте установлена III степень, патоморфологические изменения в икроножной мышце рассмотрены в целом для каждого варианта патологии без учета степени тяжести.
Таблица 1. Распределение пациентов по степени хронической артериальной недостаточности
| Группа | Клинический вариант | Степень | Средняя дистанция безболевой ходьбы, м |
| Атеросклероз сосудов нижних конечностей (n=33) | Поражение артерий дистальных сегментов (n=13) | IIБ — 10, III — 2 (боли в покое), IV — 1 (некротические изменения) | 87±57 |
| «Многоэтажное» поражение (n=8) | IIБ — 5, III — 2 (боли в покое), IV — 1 (некротические изменения) | 66,5±51,5 | |
| Синдром Лериша (n=12) | IIБ — 9, III — 3 (боли в покое) | 88,8±58 | |
| Аутоиммунное поражение сосудов (n=11) | Неспецифический аортоартериит (n=4) | IIБ — 4 | 80±32 |
| Болезнь Бюргера (n=7) | IIБ — 6, IV — 1 (некротические изменения) | 108±67 | |
| Всего (n=44) | IIБ — 34, III — 7, IV — 3 | 86,7±55,5 | |
Совокупность процессов гипоксического повреждения, некроза и параллельно протекающих явлений внутриклеточной и клеточной регенерации приводит к сдвигу важных морфометрических параметров, характеризующих состояние мышечной ткани (табл. 2). Некротически измененные мышечные волокна, вероятно, вследствие длительно протекающего процесса повреждения не могли быть достоверно определены в гистологических препаратах. Несмотря на различный генез поражения сосудов, параметры ППСМТ у пациентов с ХОЗНК меняются схожим образом без статистически значимых различий между нозологическими формами.
Таблица 2. Морфометрические показатели поперечнополосатой скелетной мышечной ткани медиальной головки икроножной мышцы
| Группа | Клинический вариант | Капиллярная плотность | Площадь поперечного сечения мышечного волокна, мкм2 | Доля центральноядерных мышечных волокон, % | Доля соединительной ткани, % |
| Атеросклероз сосудов нижних конечностей (n=33) | Поражение артерий дистальных сегментов (n=13) | 2,03 (1,82; 2,12) | 1988,14 (1466,65; 2919,09) | 2,82 (1,63; 6,52) | 2,42 (2,11; 3,76) |
| «Многоэтажное» поражение (n=8) | 1,71 (1,49; 1,84) | 2083,48 (1368,81; 2924,51) | 3,25 (2,07; 5,71) | 3,64 (2,51; 4,91) | |
| Синдром Лериша (n=12) | 1,85 (1,64; 2,13) | 1986,59 (1472,15; 2673,56) | 2,10 (1,90; 5,25) | 3,76 (1,90; 4,61) | |
| Аутоиммунное поражение сосудов (n=11) | Неспецифический аортоартериит (n=4) | 1,75 (1,55; 2,37) | 2293,07 (1674,09; 3045,63) | 3,54 (2,47; 10,51) | 4,50 (2,82; 5,29) |
| Болезнь Бюргера (n=7) | 2,05 (1,63; 2,11) | 2300,06 (1533,20; 3215,68) | 4,85 (3,34; 15,55) | 2,58 (2,32; 2,71) | |
| Всего больных | n=44 | 1,88 (1,59; 2,12) | 2019,29 (1753,34; 2594,09) | 3,25 (1,92; 6,52) | 2,96 (2,10; 4,34) |
| Контроль | n=4 | 2,75 (2,42; 3,39) | 2626,69 (1786,65, 3501,21) | 0,00 (0,00; 1,61) | 0,20 (0,05; 0,72) |
Примечание. Все показатели статистически значимо различаются от контроля при p<0,05.
При всех формах ХОЗНК наблюдается снижение капиллярной плотности по сравнению с контролем (рис. 1). В условиях хронической ишемии при всех нозологических формах ХОЗНК установлено нарастание гетероморфии мышечных волокон, проявляющейся в том числе снижением площади их поперечного сечения (рис. 2), сопровождаемое увеличением вариабельности их размеров и форм. Происходящая атрофия может быть связана с истощением регенераторного потенциала ППСМТ на фоне постоянного гипоксического повреждения, а также с гипоксией, индуцируемой активацией апоптоза, о чем свидетельствуют результаты иммуногистохимической реакции с антителами к каспазе-3 (рис. 3, а, б).
Рис. 1. Капиллярная плотность в гистологических срезах медиальной головки икроножных мышц.
а — контроль; б — пациент с «многоэтажным» атеросклерозом, стаж заболевания 6 лет; в — морфометрические данные; * — различия значимы при p≤0,05. НАА — неспецифический аортоартериит. а, б — иммуногистохимическая реакция с антителами к CD34, докраска гематоксилином. ×100.
Рис. 2. Площадь поперечного сечения мышечных волокон, доля центральноядерных мышечных волокон.
а — контроль; б — пациент с «многоэтажным» атеросклерозом, стаж заболевания 6 лет; в, г — морфометрические данные, * — различия значимы при p≤0,05. НАА — неспецифический аортоартериит. а, б — окраска гематоксилином и эозином, ×120.
Рис. 3. Иммуногистохимическая характеристика ППСМТ у пациентов с ХОЗНК.
а, б — реакция с антителами к каспазе-3; в, г — реакция с антителами к миогенину; д, е — реакция с антителами к PCNA. а, в, д — контроль. Докраска гематоксилином. а—г — ×200, д, е — ×100.
Прогрессирующая гибель и атрофия мышечных волокон сопровождаются репаративной регенерацией, которая проявляется формированием на месте гибнущих мышечных волокон очагов-регенератов, состоящих из мышечных волокон небольшого диаметра, мышечных трубочек и миосателлитоцитов с миогенин-положительными ядрами (см. рис. 3, в, г).
Внутриклеточная регенерация мышечных волокон проявляется увеличением количества центральноядерных мышечных волокон (см. рис. 2), кроме того, в образцах мышц пациентов наблюдается позитивная реакция с антителами к PCNA в ядрах клеток рабдомиогенного дифферона, но также в существенном количестве в эндотелиоцитах и клетках стромы (см. рис. 3, д, е). ППСМТ пациентов с аутоиммунным поражением сосудов характеризуется формированием менее зрелых регенератов с высокой долей PCNA+ ядер. Обнаруженные явления свидетельствуют о постоянно активированной регенерации ППСМТ на фоне повторяющихся циклов гипоксического повреждения, результатом которой могут являться прогрессирующий эндомизиальный фиброз (рис. 4) и липоидоз.
Рис. 4. Доля соединительной ткани в гистологических срезах медиальной головки икроножных мышц.
а — контроль; б — пациент с синдромом Лериша, стаж заболевания 15 лет; в — морфометрические данные, * — различия значимы при p≤0,05. НАА — неспецифический аортоартериит. а, б — окраска по Маллори, ×100.
Обсуждение
Капиллярная плотность рассматривается исследователями как одна из морфофункциональных видоспецифичных констант, позволяющих обеспечить оптимальный уровень оксигенации мышечной ткани и прямо коррелирующий с ним [11, 12]. При помощи электронной микроскопии показано, что у нетренированных молодых людей (22—31 год) этот показатель составляет 1,77±0,10, а у спортсменов — 2,49±0,08 [11]. Установлено, что у женщин (четырехглавая мышца) этот показатель несколько больше — 3,04±0,17 и 4,42±0,31 соответственно [13]. Таким образом, капиллярная плотность является весьма вариабельной, ее величина может зависеть от кислородного запроса ткани и одновременно быть лимитирующим фактором, определяющим физические возможности конкретного человека [14], в том числе при других ишемических заболеваниях [15]. В литературе имеются данные, свидетельствующие в пользу как уменьшения капиллярной плотности при ХОЗНК, так и увеличения [4]. Результаты проведенного исследования свидетельствуют в пользу первой группы работ, причем установлено, что значимых различий показателя в зависимости от нозологической формы нет. К сожалению, убедительных данных о динамике показателя в ходе длительной прогрессии заболевания пока нет, следует предполагать противоположную динамику изменения капиллярной плотности на этапах суб- и декомпенсации ишемического процесса.
Гипоксическое повреждение ППСМТ приводит к активации внутриклеточной и клеточной регенерации. Морфометрическим признаком первой являются измеряемые показатели увеличения объема саркоплазмы, детектируемого как средняя площадь мышечного волокна, и появление мышечных волокон с центрально расположенными ядрами. По нашим данным, количество таких волокон увеличивается у пациентов в 2—4 раза, а при болезни Бюргера — в 5—6 раз по сравнению с сопоставимым контролем. Высказано предположение, что эти показатели могут служить морфологическими маркерами ответа мышечной ткани на лечение, в частности при гипотиреоидной миопатии [16]. Кроме того, считается, что нарушение позиционирования ядер в волокне, связанное с перестройкой цитоскелета, может приводить к изменению сократительной способности волокна [17]. Диагностическая трактовка этого явления у исследователей не вызывает разногласий, однако его механизм остается дискутабельным [18]. Современные исследования не отрицают возможности пролиферации так называемых постмитотических ядер мышечных волокон, показанной у многих животных, в том числе млекопитающих [19]. Считается, что усиление пролиферации в ответ на повреждение на уровне ткани можно расценивать как неспецифический признак реактивного состояния ткани, в том числе регенерации [20].
PCNA является вспомогательным белком для α- и ε-ДНК-полимераз, которые принимают участие в репликации ДНК и репаративном ресинтезе ДНК. Позитивная иммуногистохимическая реакция к PCNA трактуется как маркер входа клетки в G1/S-фазы клеточного цикла, а также может указывать на активацию внутриклеточной регенерации [21]. Уровни синтеза PCNA и Ki-67 — другого маркера пролиферации, синтезируемого во всех фазах клеточного цикла, кроме G0, могут отличаться в различных тканях и при разных патологических процессах, однако между ними наблюдается положительная корреляционная связь при репаративном рабдомиогистогенезе [22]. При использовании аутопсийного материала в качестве контроля операционному необходимо учитывать, что со временем иммунореактивность PCNA может снижаться, что потребует калибровки реакции [23].
Активация клеточных источников восстановления ППСМТ сопровождается их пролиферацией, индукцией дифференцировки путем повышения синтеза в них мышечных транскрипционных факторов Myf5 и миогенина с последующим слиянием и образованием молодых мышечных волокон. Принято считать, что результат репаративного процесса в мышцах напрямую связан с соотношением провоспалительных и противовоспалительных молекул в области повреждения, в том числе гипоксического [24]. У пациентов с ХОЗНК даже в случае выполнения фармакологической или хирургической реваскуляризации фактор ишемии, имеющий отношение к атеросклерозу или аутоиммунному поражению сосудистой стенки, не исключается полностью. В связи с этим закономерно, что степень фиброза скелетных мышц нижних конечностей коррелирует с длительностью заболевания и выраженностью артериальной недостаточности [25], что подтверждается и неинвазивными методами визуализации [26, 27]. Полученные морфометрические данные свидетельствуют о гипертрофии эндо- и перимизия.
Заключение
По всем изученным количественным патогистологическим параметрам установлена статистически значимая разница между контрольными биоптатами и биоптатами пациентов с ХОЗНК без значимых различий между нозологиями и группами нозологий. Гистогенетические закономерности повреждения, реактивности и регенерации ППСМТ едины независимо от вызвавшего хроническую ишемию фактора. Динамика наблюдаемых процессов может существенно отличаться при разной длительности заболевания и наличии аутоиммунного компонента патоморфогенеза, установление которых представляет значительные трудности.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.П. Киясов, А.В. Максимов
Сбор и обработка материала — М.О. Мавликеев, М.В. Плотников
Статистическая обработка — М.О. Мавликеев
Написание текста — Р.В. Деев, М.О. Мавликеев
Редактирование — Р.В. Деев
Авторы заявляют об отсутствии конфликта нтересов.