Болезнь Кикучи—Фуджимото (гистиоцитарный некротизирующий лимфаденит) — редкий патологический процесс, который характеризуется подострой некротизирующей регионарной лимфаденопатией, лихорадкой, ночной потливостью и часто ошибочно диагностируется как лимфопролиферативное заболевание, туберкулез или лимфаденит при системной красной волчанке [1].

Впервые гистиоцитарный некротизирующий лимфаденит был описан M. Kikuchi и Y. Fujimoto в 1972 г. [2, 3]. Заболевают лица молодого возраста (средний возраст пациентов 27,4 года, соотношение мужчин и женщин 1:1,6) [4—6]. Болезнь Кикучи—Фуджимото (БКФ) обычно манифестирует шейной лимфаденопатией (83% больных), реже поражаются подмышечные, паховые лимфатические узлы и лимфатические узлы средостения [7]. Известны единичные случаи экстранодальной локализации с вовлечением в патологический процесс печени, селезенки, кожи. Пораженные лимфатические узлы безболезненные при пальпации, а регионарная лимфаденопатия может сопровождаться умеренной лихорадкой, ознобом, миалгией, тонзиллитом и кожной сыпью, что в некоторых случаях требует проведения дифференциальной диагностики с корью и крапивницей. В 25% случаев клиническое течение БКФ у больных сопровождается анемией, нейтропенией, лимфоцитозом. Тем не менее БКФ — доброкачественное заболевание с хорошим прогнозом, саморазрешение болезни наступает в течение нескольких недель, рецидивы редки [4, 8].

Этиопатогенез БКФ изучен недостаточно. Предполагается, что вирусные инфекции (вирус Эпштейна—Барр, цитомегаловирусная инфекция, парвовирус B19, вирус герпеса человека 6-го типа и др.) могут выступать в роли триггерных факторов, способствующих манифестации заболевания [9—11]. K. Ohshima и соавт. [12], показали, что в острой стадии БКФ повышена сывороточная концентрация гамма-интерферона, интерлейкина-6 (ИЛ-6) и других провоспалительных цитокинов. При гистологическом исследовании биопсийного и операционного материала в пораженных лимфатических узлах находят очаги паракортикальных коагуляционных некрозов неправильной формы с кариорексисом гистиоцитов и макрофагальной инфильтрацией. В очаге поражения отсутствуют эозинофильные и нейтрофильные гранулоциты. Капсула лимфатического узла утолщена, рисунок строения частично стерт. Очаги некрозов окружены скоплениями гистиоцитов, иммунобластов, плазмоцитоидных дендритных клеток (ПДК) и малых лимфоцитов. Такая гистологическая картина может быть ошибочно интерпретирована как лимфома или миелоидная саркома. T. Kuo [5] выделил три стадии БКФ: пролиферативную, некротизирующую и ксантоматозную. Пролиферативная стадия характеризуется гиперплазией паракортикальной зоны с большим количеством гистиоцитов и ПДК. При некротизирующей стадии в пораженном лимфатическом узле появляются очаги некроза разной степени протяженности. Некротизирующая стадия может сменять пролиферативную. Если при гистологическом исследовании пораженного лимфатического узла видны скопления пенистых гистиоцитов независимо от наличия и отсутствия участков некроза, то такое состояние предлагают трактовать как ксантоматозная стадию.

При иммуногистохимическом окрашивании гистиоциты могут быть выявлены в реакции с антителами к CD14, CD68, лизоциму и миелопероксидазе. Лимфоцитарные инфильтраты паракортикальной зоны содержат преимущественно CD8-позитивные T-лимфоциты.

Морфологическая диагностика БКФ предполагает обнаружение ПДК, они среднего размера, с округлым ядром и мелкодисперсной структурой хроматина, амфофильной цитоплазмой. ПДК обычно находят в лимфатическом узле в виде скоплений вне зон некроза (рис. 1). В ряде работ описана «атипичная» морфология ПДК при БКФ, что в сочетании с измененной гистоархитектоникой лимфатического узла требует дифференциальной диагностики с лимфомой высокой гистологической степени злокачественности [13, 14].

Рис. 1. Фрагмент лимфатического узла при болезни Кикучи—Фуджимото.

а — фокус некроза с кариорексисом (справа), ×230; б — клеточный состав гистиоцитарного некротизирующего лимфаденита. Окраска гематоксилином и эозином, ×330.

Важный иммуногистохимический маркер для выявления ПДК — цитоплазматическая экспрессия α-цепи рецептора ИЛ-3 (CD123) [15]. Также эти клетки экспрессируют CD68, CD303 и не экспрессируют миелопероксидазу (рис. 2).

Рис. 2. Иммуногистохимические маркеры, характерные для плазмоцитоидных дендритных клеток.

а — окраска гематоксилином и эозином; б — CD123; в — MNDA; г — TCL1A, ИГХ-окрашивание по методу SIMPLE, ×450.

Попытки изучить происхождение и функцию ПДК были предприняты исследователями в разное время [16—18]. Известно, что с помощью toll-подобных рецепторов ПДК способны распознавать вирусные ДНК и РНК, продуцировать интерфероны I и III типов [9]. ПДК выполняют функцию в работе противовирусного иммунитета, реализации патологических аутоиммунных реакций [10]. Несмотря на диагностическую значимость ПДК, их иммунофенотип при БКФ изучен недостаточно, что и предопределило цель работы.

Цель исследования — выявить фенотипическую гетерогенность субпопуляций CD123-позитивных клеток в лимфатических узлах у больных гистиоцитарным некротизирующим лимфаденитом (болезнь Кикучи—Фуджимото) методом последовательного иммунопероксидазного окрашивания и стирания (A Sequential Immunoperoxidase Labeling and Erasing Method — SIMPLE).

Материал и методы

Исследованы лимфатические узлы, полученные от 3 больных с клинически и гистологически подтвержденным диагнозом БКФ. Из парафиновых блоков на ротационном микротоме изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм. При иммуногистохимическом окрашивании использовали первичные антитела фирм «DAKO» (Дания) и «Thermo Scientific» (США). Для визуализации антител применяли систему EnVision («DAKO», Дания) или Quanto («Thermo Scientific», США). Проявление пероксидазной метки осуществляли хромогеном Vector NovaRed («Vector laboratories», США). Докрашивание гематоксилином, дегидратация и заключение под бальзам гистологических препаратов выполняли по стандартной методике. Полученные гистологические препараты переводили в цифровой формат с помощью лабораторного сканирующего микроскопа (сканера) Pannoramic 250 Flash III («3DHISTECH», Венгрия). После получения оцифрованных изображений с гистологических препаратов снимали покровное стекло, гидратировали их и помещали в буфер, содержащий 2% SDS, 0,8% β-меркаптоэтанол и 62,5 ммоль/л трис-HCl; pH 7,5. На промытые в TBS гистологические препараты наносили следующие по списку первичные антитела (см. таблицу), дальнейшее окрашивание среза выполняли по методике, приведенной выше.

Состав панели антител и очередность окрашивания

Из каждого гистологического препарата, последовательно окрашенного антителами, получено 4 оцифрованных изображения, окрашенных с антителами к CD123, MNDA, CD68, TCL1A. В программе Pannoramic Viewer («3DHISTECH», Венгрия) во всех оцифрованных изображениях находили одинаковые поля зрения. Выбранные поля зрения фотографировали и экспортировали в JPG-формат. На микрофотографиях с экспрессией CD123-антигена отмечали окрашенные хромогеном клетки для их идентификации на остальных микрофотографиях, демонстрирующих экспрессию других 3 маркеров. Для анализа иммунофенотипа CD123-позитивных клеток составляли таблицу, в которую заносили экспрессируемый антигенный профиль каждой отмеченной клетки.

Результаты и обсуждение

На основе оценки колокализации экспрессии исследованных антител выявлены 4 субпопуляции клеток, экспрессирующих CD123 (рис. 3—6):

№1: CD68+/MNDA+/TCL1A+;

№2: CD68+/MNDA+/TCL1A–;

№3: CD68+/MNDA–/TCL1A+;

№4: CD68–/MNDA–/TCL1A+.

Рис. 3. Популяции CD123-позитивных клеток, выявленные с использованием SIMPLE, стрелка — субпопуляция №1 (CD123+/CD68+/MNDA+/TCL1A+).

ИГХ-реакция с: а — CD123; б — CD68; в — MNDA; г — TCL1A, ×950.

Рис. 4. Популяции CD123-позитивных клеток, выявленные с использованием SIMPLE, стрелка — субпопуляция №2 (CD123+/CD68+/MNDA+/TCL1A–).

ИГХ-реакция с: а — CD123; б — CD68; в — MNDA; г — TCL1A, ×950.

Рис. 5. Популяции CD123-позитивных клеток, выявленные с использованием SIMPLE, стрелка — субпопуляция №3 (CD123+/CD68+/MNDA—/TCL1A+).

ИГХ-реакция с: а — CD123; б — CD68; в — MNDA; г — TCL1A, ×950.

Рис. 6. Популяции CD123-позитивных клеток, выявленные с использованием SIMPLE, стрелка — субпопуляция №4 (CD123+/CD68–/MNDA–/TCL1A+).

ИГХ-реакция с: а — CD123; б — CD68; в — MNDA; г — TCL1A, ×950.

При гистологическом исследовании всех эксцизионных биопсий лимфатических узлов был поставлен диагноз «гистиоцитарный некротизирующий лимфаденит; некротизирующая стадия». В 1 случае среди CD123+-клеток были выявлены субпопуляции №3 (CD123+/CD68+/MNDA–/TCL1A+) и №4 (CD123+/CD68–/MNDA—/TCL1A+), в остальных 2 случаях преобладали субпопуляции №1 (CD123+/CD68+/MNDA+/TCL1A+) и №2 (CD123+/ CD68+/MNDA+/TCL1A–), а субпопуляции №3 и 4 были представлены малочисленными рассеянными CD123+-клетками.

Полученные в некоторых исследованиях данные позволяют предположить существование двух источников происхождения ПДК: из клетки-предшественника лимфопоэза и миелоидной клетки-предшественника [19—23]. Обнаружено, что ПДК, сформированные из клетки-предшественника миелопоэза, способны вырабатывать больше интерферона I типа, чем ПДК лимфоидной линии дифференцировки [24]. Важную функцию в развитии и дифференцировке ПДК выполняет цитокиновый рецептор Flt3 (CD135) и лиганд Flt3L. У мышей с генетически обусловленной недостаточностью лиганда Flt3L наблюдается снижение количества ПДК. Инъекции лиганда Flt3L способствуют повышению количества ПДК в крови, что подтверждено у людей in vivo [25]. P. Sathe и соавт. [20], установили, что Flt3L даже в отсутствие других стимулирующих факторов, способствует коммитированию ПДК из клеток-предшественников лимфо- и миелопоэза.

Субпопуляция ПДК, экспрессирующая MNDA и CD68, вероятно, может развиваться из предшественника макрофагов и дендритных клеток [26]. Наличие ПДК, которые не экспрессируют MNDA и (или) CD68, косвенно свидетельствует о происхождении ПДК из лимфоидной клетки-предшественника. Представленные результаты последовательного иммуногистохимического окрашивания лимфатических узлов в 3 случаях БКФ подтверждают и дополняют данные P. Rodrigues и соавт. [27], полученные с помощью секвенирования тотальной РНК и РНК-секвенирования одиночных клеток мышиной модели. В этой работе авторы выделили две субпопуляции ПДК, которые различаются способностью вырабатывать интерферон I типа и осуществлять антигенпрезентирующую функцию. Большая часть ПДК развивается из IL-Rα«+» клетки-предшественника, относящейся к лимфопоэзу (пре-плазмоцитоидная дендритная клетка). 5—10% клеток, которые дифференцируются из миелоидной клетки-предшественницы и фенотипически схожи с ПДК и классическими дендритными клетками, авторы предложили называть плазмоцитоидными дендритно-подобными клетками [27].

T-Cell Leukemia Protein 1 (TCL-1) — протоонкоген, его цитоплазматическое и ядерное окрашивание можно увидеть при иммуногистохимическом исследовании новообразований из ПДК, T- и B-клеточных лейкозов и лимфом [28—30]. Функции TCL-1 изучены мало, известно, что этот белок действует как регулятор Akt-киназы, экспрессируется B- и T-лимфоцитами во время их созревания, но отсутствует в зрелых T-лимфоцитах, зрелых клетках миелоидного ростка, моноцитах и дендритных клетках, имеющих моноцитарное происхождение [29, 30]. M. Narducci и соавт. (2000) показали, что экспрессия TCL-1 может наблюдаться в неопухолевых B-лимфоцитах и ПДК [30, 31]. Полученные данные о наличии популяций ПДК с имеющейся и отсутствующей экспрессией TCL-1 подтверждают существование фенотипически гетерогенных подгрупп.

Заключение

Метод последовательного иммуногистохимического окрашивания SIMPLE показал, что CD123-позитивные клетки в пораженных лимфатических узлах при БКФ имеют разный иммунофенотип при сходной морфологии. Для выявления возможной связи экспрессии MNDA, CD68 и TCL-1 с линейной принадлежностью ПДК к лимфоидному или миелоидному ростку необходимы дальнейшие морфологические и молекулярно-генетические исследования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.Н.С., Ю.А.К.

Сбор и обработка материала — И.Н.С., З.П.А.

Написание текста — И.Н.С., З.П.А.

Редактирование — Ю.А.К.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.