Неоваскуляризация при «артериите» отмечалась еще в конце XIX века W. Koester [1]. Последующие наблюдения подтвердили наличие неокапилляров в атеросклеротических бляшках [2]. Было высказано предположение, что неоангиогенез может играть роль в развитии атеросклеротических бляшек и их осложнений [3, 4]. Плотность vasa vasorum выше в артериях с атеросклеротическими поражениями и является ранним событием в атерогенезе [5]. Более того, доставка аденовирусов, кодирующих фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor — VEGF), вызывает неоангиогенез и гиперплазию интимы [6], тогда как ингибиторы ангиогенеза ослабляют рост бляшек [7].
При гиперплазии интимы в атеросклеротических поражениях преобладает ангиогенный механизм — прорастание неокапилляров из ранее существовавших vasa vasorum [3]. Ангиогенный процесс может быть инициирован гипоксией, которая индуцирует экспрессию и высвобождение ангиогенных факторов (например, VEGF). При восстановлении нормоксии ангиогенез снижается [8]. Неоваскуляризация позволяет доставлять питательные вещества в сосудистую стенку, способствует отложению в ней липидов, инфильтрации ее макрофагами и развитию воспаления [9]. Высказано предположение, что неполное созревание и хрупкость новообразованных сосудов — причина кровоизлияний внутри бляшки, которые могут привести к ее дестабилизации и разрыву [10, 11]. Важно, что стабильные фиброзно-кальцинозные бляшки в отличие от нестабильных содержат меньшее количество сосудов [12]. Этот факт может указывать на инволюцию ангиогенеза после утилизации атероматозных масс.
Следует отметить, что сравнительные иммуноморфологические исследования о влиянии неоваскуляризации на формирование нестабильной атеросклеротической бляшки у человека практически отсутствуют.
Поэтому цель настоящей работы — изучение морфологических особенностей неоангиогенеза в начальных атеросклеротических поражениях, в нестабильных и стабильных атеросклеротических бляшках, а также выяснение роли в неоваскуляризации такого ангиогенного фактора, как VEGF.
Материал и методы
Материалом исследования послужили образцы, полученные во время 20 аутопсий мужчин в возрасте от 65 до 72 лет, умерших от острой сердечно-сосудистой недостаточности атеросклеротической этиологии. Обязательным условием для отбора материала являлось отсутствие тяжелых сопутствующих заболеваний, способных оказывать воздействие на иммунологическую реактивность.
Исследовали сегменты аорты (из дуги, грудного и брюшного отделов), коронарные артерии и артерии основания головного мозга (a. basilaris) — всего 45 образцов ткани.
Иссеченные кусочки фиксировали в 4%-м забуференном параформальдегиде. Иммуноморфологическое и микроскопическое исследования проводили на парафиновых и криостатных срезах толщиной 4—6 мкм.
Для верификации типов атеросклеротических поражений с целью отбора нестабильных, обладающих признаками прогрессирующего роста бляшек, проводили окрашивание препаратов для выявления липидов красителем Oil Red O (Dako).
Вновь образованные сосуды в стенке изучаемых артерий, а также степень инфильтрации сосудистой стенки мононуклеарами выявляли с помощью окрашивания срезов гематоксилином Майера с докраской водно-спиртовым раствором эозина.
Исследование активности VEGF выполняли на парафиновых срезах высокочувствительным двухступенчатым стрептавидин-биотиновым методом с использованием поликлональных антител к VEGF (IgG-фракция; концентрация 50 мкг/мл; Sigma). Продукт реакции выявляли с помощью готового набора реагентов R&D Systems (Cell&Tissue Staining Kit, HRP-DAB System). Докрашивание ядер проводили метиловым зеленым (готовый раствор Methyl Green, Dako). С целью корректного анализа результатов применяли отрицательный контроль по антителам на параллельных срезах: вместо первичных антител использовали разбавитель антител — 0,1% фосфатный буфер, далее окрашивание препаратов проводили согласно стандартному протоколу.
Полученные препараты исследовали с помощью светового микроскопа Leica DM 2500. Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 420 и компьютерной программы Leica Application Suite v. 3.4.0.
Результаты и обсуждение
В результате сравнительного гистологического исследования удалось установить, что в фиброзной покрышке нестабильных атеросклеротических бляшек во всех типах изучаемых артерий наблюдаются многочисленные микрососуды, просвет которых заполнен эритроцитами (рис. 1а). Важно, что вокруг этих микрососудов, как правило, располагаются выраженные воспалительные мононуклеарно-клеточные инфильтраты. Сами микрососуды в поврежденной покрышке часто выявляются в виде столбиков — от более глубоких ее отделов к поверхностным (рис. 1б). Очевидно, что такое их расположение может способствовать истончению, хрупкости фиброзной покрышки и последующему ее разрыву. Более углубленное изучение воспалительных мононуклеарно-клеточных инфильтратов показало, что в поверхностных отделах поврежденной покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки в зоне активной неоваскуляризации преобладают макрофаги, а в более глубоких участках этой же фиброзной покрышки — малые и средние лимфоциты (рис. 1в, 1г). Важно, что одновременно под нестабильными поражениями в соответствующих участках адвентиции выявляются многочисленные vasa vasorum, окруженные такими же мононуклеарно-клеточными инфильтратами (рис. 1д). В то же время ни в фиброзной покрышке стабильных атеросклеротических бляшек, ни в нормальных участках интимы артерий человека образование новых микрососудов не наблюдается (рис. 1е).
Рис. 1. Неоваскуляризация в различных атеросклеротических поражениях у человека.
а — многочисленные микрососуды, заполненные эритроцитами в фиброзной покрышке нестабильной атеросклеротической бляшки; б — микрососуды в поверхностном отделе поврежденной покрышки нестабильной бляшки, ×350; в — макрофаги (стрелки) в микрососудах и мононуклеарно-клеточных инфильтратах в поверхностных отделах интимы нестабильной бляшки; г — лимфоциты (стрелка) в микрососудах и мононуклеарно-клеточных инфильтратах в глубоких отделах интимы нестабильной бляшки; д — многочисленные vasa vasorum и мононуклеарно-клеточные инфильтраты в адвентиции под нестабильными атеросклеротическими поражениями; е — отсутствие микрососудов в фиброзной покрышке стабильной бляшки; а — е — окраска гематоксилином и эозином; а, д, е — ×200; в, г — ×500.
Fig. 1. Neovascularization in various human atherosclerotic lesions.
Полученные результаты свидетельствуют об активных процессах неоваскуляризации в покрышке и подлежащих отделах адвентиции в нестабильных атеросклеротических поражениях. Причем этот процесс, как правило, сочетается с выраженной воспалительной клеточной реакцией, которая, возможно, и способствует его развитию.
Иммуногистохимический анализ VEGF показал, что при отсутствии VEGF в нормальных участках сосудистой стенки не выявляются вновь образованные микрососуды (рис. 2а). Примечательно, что в интиме липидных пятен также отсутствуют VEGF и микрососуды. И напротив, в адвентиции того же липидного пятна обнаруживаются многочисленные микрососуды, эндотелиальные клетки которых активно экспрессируют VEGF (рис. 2б). На начальных стадиях формирования нестабильной атеросклеротической бляшки в ее фиброзной покрышке выявляются немногочисленные микрососуды с эндотелиальными клетками, экспрессирующими VEGF (рис. 2в). Их количество резко возрастает в поврежденной соединительнотканной покрышке сформировавшейся нестабильной бляшки (рис. 2г). Интересно, что одновременно рядом с такими микрососудами наблюдаются многочисленные мононуклеарные клетки, также активно экспрессирующие VEGF (рис. 2д). В отличие от нестабильных поражений в мощной фиброзной покрышке стабильных атеросклеротических бляшек отсутствует неоваскуляризация и не выявляется VEGF (рис. 2е).
Рис. 2. Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) в норме и в различных атеросклеротических поражениях у человека.
а — отсутствие VEGF и микрососудов в интиме нормального участка аорты; б — многочисленные микрососуды с эндотелиальными клетками, экспрессирующими VEGF в адвентиции под липидным пятном, ×350; в — единичные микрососуды с эндотелиальными клетками, экспрессирующими VEGF (стрелки) в покрышке липидно-фиброзной бляшки; г — многочисленные микрососуды с эндотелиальными клетками, экспрессирующими VEGF в поврежденной покрышке нестабильной бляшки; д — мононуклеары, экспрессирующие VEGF, рядом с микрососудами в фиброзной покрышке нестабильной бляшки; е — отсутствие микрососудов и VEGF в фиброзной покрышке стабильной бляшки; а — е — иммуногистохимический метод; а, е — ×200; в, г, д — ×400.
Fig. 2. Vascular endothelial growth factor (VEGF) in human health and in various atherosclerotic lesions.
Все эти факты свидетельствуют о том, что одним из механизмов, вызывающих активную неоваскуляризацию в атеросклеротических поражениях, может быть VEGF.
VEGF, известный также как фактор сосудистой проницаемости, является специфическим митогеном для клеток эндотелия сосудов и приводит к неоваскуляризации и повышению проницаемости капилляров [13]. Причем повышенная проницаемость может быть связана с экспрессией VEGF макрофагами при воспалительной реакции в бляшках [14]. Увеличение его уровня отмечается при ишемии миокарда в период реваскуляризации и при неоваскуляризации атеросклеротической бляшки [15]. Известно, что терапия статинами в ранние сроки после реваскуляризации миокарда стабилизирует состояние атеросклеротической бляшки посредством снижения экспрессии VEGF [15].
Важно, что в районе неоваскуляризации в нестабильных атеросклеротических бляшках обнаруживаются выраженные мононуклеарно-клеточные инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоцитов и макрофагов. Известно, что клетки воспаления играют важную роль в дестабилизации атеросклеротической бляшки у человека [16, 17], а ее неоваскуляризация благоприятствует притоку мононуклеаров в бляшку. Кроме того, воспалительные клетки выделяют матриксные металлопротеиназы, которые нарушают структуру внеклеточного матрикса и высвобождают связанный с ним VEGF. Всегда важно иметь в виду, что внутрибляшечные неососуды не покрыты или только частично покрыты перицитами и гладкомышечными клетками, поэтому они хрупкие и склонны к повреждению [9]. Следует согласиться с А.Н. Евдокименко и соавт. [14], что при оценке роли неоваскуляризации в атерогенезе значение может иметь не только калибр новообразованных сосудов, но и особенности их локализации в бляшке. Авторы приходят к заключению, что увеличение плотности сосудов в поверхностных отделах бляшки может быть маркером повышенного риска кровоизлияний и активации воспалительной реакции.
Таким образом, появление неососудов, вероятно, тесно связано с уменьшением стабильности атеросклеротической бляшки, образованием в ее покрышке кровоизлияний, что в конечном итоге приводит к ее разрыву [18]. Следствием таких изменений является развитие нестабильной стенокардии и других острых клинических симптомов ишемической болезни сердца.
Заключение
Полученные результаты свидетельствуют об активных процессах неоваскуляризации в покрышке и подлежащих отделах адвентиции в нестабильных атеросклеротических поражениях. Этот процесс, как правило, сочетается с выраженной воспалительной клеточной реакцией, которая, возможно, и способствует его развитию. Не вызывает сомнения факт, что вновь образованные микрососуды будут способствовать истончению, хрупкости фиброзной покрышки и последующему ее разрыву. Показано, что одним из механизмов, вызывающих активную неоваскуляризацию в атеросклеротических поражениях, является VEGF. В поврежденных фиброзных покрышках нестабильных атеросклеротических бляшек выявлена триада: микрососуды, мононуклеарно-клеточные инфильтраты и VEGF. Такие изменения в атеросклеротической бляшке могут приводить к развитию нестабильной стенокардии и других острых клинических симптомов ишемической болезни сердца.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — П.В. Пигаревский, В.А. Снегова
Сбор и обработка материала — Н.Г. Давыдова, С.В. Мальцева, О.Г. Яковлева
Написание текста — П.В. Пигаревский, Р.А. Ворожбит, В.А. Гусева
Редактирование — П.В. Пигаревский, В.А. Снегова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.