Один из методов лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) — использование ингибиторов иммунных контрольных точек (ИКТ) PD-1 и PD-L1.

Поскольку ИКТ эффективны только у 15—25% пациентов с прогрессирующим НМРЛ, необходима оценка экспрессии PD-L1 для выбора пациентов, которые потенциально могут ответить на эту терапию [1]. Иммуногистохимическая оценка экспрессии PD-L1 была использована в большинстве клинических исследований, определяющих эффективность ингибиторов контрольных точек [2].

В большинстве систем оценки PD-L1 используется непрерывная переменная, выраженная в процентах окрашенных клеток в определенной клеточной популяции [3]. Патологу необходимо учитывать наличие экспрессии в разных типах клеток (опухолевых или иммунных), а также использованный клон антитела для тестирования. Каждый из этих параметров имеет значение и влияет на воспроизводимость результатов теста. Кроме того, оценка PD-L1 в архивном материале через несколько лет не отражает характер взаимодействия опухоли и иммунной системы на момент лечения.

Исследование Keynote-042 показало, что преимущество от назначения пембролизумаба в 1-й линии получают пациенты с экспрессией PD-L1 выше 50% в опухолевых клетках при использовании клона антитела 22С3.

Вариабельность количественного определения PD-L1 между различными исследователями, которые оценивали одни и те же микропрепараты, возможно, связана с трудностью распознавания слабой или неполной мембранной окраски [4]. Это может способствовать неточной стратификации пациентов и неправильной интерпретации влияния экспрессии PD-L1 на клинический исход. Субъективные решения количественной оценки экспрессии могут привести к радикально различающейся терапевтической стратификации.

Цифровой анализ изображений и алгоритмы нейросетевого анализа дают большую точность, воспроизводимость, стандартизацию критериев и результатов включения в исследование [5].

В исследовании на основании собственного опыта работы с алгоритмом выполнен анализ согласия количественной оценки экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках с помощью нейросети в биоптатах немелкоклеточных карцином легкого.

Материал и методы

Изучены 96 биоптатов легких у пациентов с диагнозом НМРЛ без клинически значимых мутаций в генах EGFR, ALK, ROS1, MET, определенных методом ПЦР.

Распределение гистологических подтипов рака в биоптатах было следующее: 24% (n=23) аденокарциномы, 76% (n=73) плоскоклеточных карцином.

Иммуногистохимическое окрашивание с антителом к PD-L1 (клон 22C3 pharmDx, Dako) проведено с применением автоматического стейнера Dako Autostainer Link 48 (система визуализации Envision FLEX) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем [6]. В качестве позитивного контроля использована ткань миндалины. После окраски микропрепараты изучал врач-патологоанатом, имеющий сертификат для оценки экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках с помощью клона 22C3. После этого гистологические микропрепараты оцифрованы с помощью сканирующего микроскопа (сканера) Panoramic Flash 250 (3D Histech) с объективом х 20, полученные цифровые копии микропрепаратов проанализированы, для этого использовали программное обеспечение QuPath и модуль нейросетевого анализа Artificial Neural Network (ANN_MLP) (рис. 1).

Рис. 1. Модуль нейросетевого анализа Artificial Neural Network программного обеспечения QuPath.

Fig. 1. Neural network analysis module Artificial Neural Network software QuPath.

Обучение расчетного модуля осуществляли с помощью режима Train pixel classifier путем создания врачом-патологоанатомом не менее 3 аннотаций (рис. 2) для опухолевой ткани (Tumor) и стромы (Stroma). Зоны артефактов обозначали категорией Ignore и не учитывали в анализе. Полученный алгоритм загружали в проект и проводили подсчет опухолевых клеток (TC) на модуле Positive Cell Detection с использованием режима Score compartment — Cytoplasm DAB OD-mean (возможен для мембранного окрашивания) с настройками по умолчанию на всей площади скана для опухоли.

Рис. 2. Пример работы алгоритма нейросетевого анализа с категориями Tumor (красный), Stroma (зеленый) и Ignore (серый).

Fig. 2. An example of work of the neural network analysis algorithm with the categories Tumor (red), Stroma (green), and Ignore (grey).

Мануальную разметку на оцифрованной копии гистологического микропрепарата осуществлял эксперт в режиме аннотаций в программе QuPath по категориям Tumor и Stroma, затем анализировали площадь категорий в каждом случае.

Статус PD-L1 определяли как положительный, когда при оценке визуальным методом 1% и более опухолевых клеток имели мембранное окрашивание.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения R Studio версия 3.3, с применением пакетов IRR, функции вычисления коэффициента Agree и Maxwell’s RE coefficient для анализа воспроизводимости количественной оценки между патологом и программным обеспечением. Комплектация компьютера для анализа включала двухъядерный процессор Intel i3, 2,8 GHz, 8 Гб оперативной памяти DDR2.

Результаты

Экспрессия PD-L1 показала выраженную меж- и внутриопухолевую гетерогенность. При сравнительном анализе мануальных аннотаций эксперта и выделенных нейросетью зон по категориям опухоль, строма и артефакты алгоритм показал достаточную согласованность с экспертом, коэффициент согласия составил 92%.

Все результаты визуальной или нейросетевой оценки экспрессии белка PD-L1 разделены на группы: 1-я — отсутствие экспрессии, 2-я — низкая экспрессия (от 1 до 49% опухолевых клеток) и 3-я — высокая экспрессия (более 50% опухолевых клеток).

По данным визуальной оценки 42% случаев были отрицательными, 37% отнесены в группу низкой экспрессии, в 21% случаев определена группа высокой экспрессии.

При использовании модуля нейросетевого анализа изображений проанализировано в среднем 190 000 опухолевых клеток в 1 биоптате. В 32% случаев выявлено отсутствие экспрессии, в 49% — низкая экспрессия, в 19% — высокая. При сравнении с визуальным методом анализа 11% случаев были переклассифицированы нейросетью как позитивные, отнесенные во 2-ю группу; 3-я группа визуального анализа практически полностью совпала с 3-й группой нейросетевого анализа (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительная характеристика оценки уровня экспрессии PD-L1 по данным визуального и нейросетевого анализа в группах

Тип анализа	1-я группа (отсутствие экспрессии), %	2-я группа (низкая экспрессия), %	3-я группа (высокая экспрессия), %
Визуальный	42	37	21
Нейросетевой	32	49	19

Коэффициент согласия (Agreement) составил 72% без разделения на группы, однако при подгрупповом визуальном и нейросетевом анализе для 1-й группы — 58%, для 2-й и 3-й групп — 71 и 96% соответственно (табл. 2).

После обучения нейросети скорость получения результата одного биоптата составила в среднем 36±18 мин на компьютере с указанными характеристиками.

Обсуждение

Оценка экспрессии PD-L1 вошла в повседневную практику врача-патологоанатома для выбора оптимальной тактики лечения пациента. Все большее распространение получают компьютерные алгоритмы для анализа изображений с целью диагностики, а также количественной оценки предиктивных и прогностических иммуногистохимических биомаркеров.

Выбранный алгоритм нейросетевого анализа продемонстрировал высокий коэффициент согласия для оценки статуса положительной экспрессии PD-L1 во 2-й и 3-й группах. Однако коэффициент согласия в 1-й группе был ниже 0,6, что говорит о недостаточном согласии (см. табл. 2).

Таблица 2. Распределение по группам коэффициентов согласия результатов оценки экспрессии визуальным и нейросетевым методами

Группа	Коэффициент согласия, %	Коэффициент Максвелла
1-я	58	0,53
2-я	71	0,76
3-я	96	0,92

Алгоритм оценки нейросетевого анализа экспрессии позволяет определить гораздо больше опухолевых клеток, чем визуальный количественный способ, поскольку исключает строму из анализа. Одна из составляющих нейросетевого анализа — обучение нейросети. Это требует формирования больших объемов структурированных данных, где должны быть представлены категории опухоли, строма, а также артефакты на всей площади цифровой копии препарата. Одно из ограничений нейросетевого метода связано с трудностью распознавания внутриопухолевой лимфоцитарной и гистиоцитарной инфильтрации, которая, возможно, стала причиной более высокой доли позитивных случаев в группе низкой экспрессии в сравнении с визуальным методом.

Вклад врача имеет решающее значение для создания наборов данных, необходимых для обучения нейросети. Скорость анализа будет зависеть от вычислительной мощности компьютера, при которой проводится обработка данных. В другом исследовании мы показали, что скорость количественного анализа зависит также от алгоритмов используемых программных продуктов [7]. Применение мощных рабочих станций или вычислительных облачных платформ по типу Aiforia или HALO AI сократит время нейросетевого анализа до приемлемого в рутинной практике.

Заключение

Алгоритм нейросетевого анализа модуля QuPath способен выделить на оцифрованной копии гистологического микропрепарата опухоль, строму и артефакты, а также количественно охарактеризовать экспрессию биомаркера PD-L1.

Алгоритм нейросетевого анализа программы QuPath обеспечивает удовлетворительный уровень согласия с визуальным методом оценки для опухолей с высокой экспрессией PD-L1. Это создает предпосылки автоматизации количественной оценки экспрессии, когда патолог сталкивается с необходимостью тестирования предиктивных или прогностических биомаркеров. Необходимо дальнейшее совершенствование алгоритма нейросетевого анализа для повышения воспроизводимости оценки количественной экспрессии на больших объемах данных с клинической валидацией.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.А. Кушнарев

Сбор и обработка материала — В.А. Кушнарев, Н.А. Матяшина, В.А. Шапкина, А.С. Артемьева

Статистическая обработка — В.А. Кушнарев

Написание текста — В.А. Кушнарев, Н.А. Матяшина, Е.А. Кушнарева, Ю.А. Криволапов

Редактирование — А.С. Артемьева, Ю.А. Криволапов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.