Студенникова В.В.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)

Севергина Л.О.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)

Коровин И.А.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)

Рапопорт Л.М.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)

Крупинов Г.Е.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)

Новиков И.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»

Ультраструктурная характеристика механизмов варикозной трансформации вен различной локализации

Журнал: Архив патологии. 2020;82(6): 16-23

Просмотров : 610

Загрузок : 3

Как цитировать

Студенникова В.В., Севергина Л.О., Коровин И.А., Рапопорт Л.М., Крупинов Г.Е., Новиков И.А. Ультраструктурная характеристика механизмов варикозной трансформации вен различной локализации. Архив патологии. 2020;82(6):16-23.
Studennikova VV, Severgina LO, Korovin IA, Rapoport LM, Krupinov GE, Novikov IA. Ultrastructural characteristics of the mechanisms of varicose transformation of veins of different localization. Arkhiv Patologii. 2020;82(6):16-23.
https://doi.org/10.17116/patol20208206116

Авторы:

Студенникова В.В.

ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет)

Все авторы (6)

Варикозное расширение вен нижних конечностей (ВРВНК) и варикоцеле (ВЦ) — одни из самых распространенных заболеваний сосудистой системы невоспалительной природы. На сегодняшний день исследователи выделяют различные механизмы варикозного расширения вен, однако особый интерес представляют первичные или генетически детерминированные, когда имеет место системное нарушение коллагеногенеза еще в эмбриональном периоде в рамках синдрома недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ). Таким образом, можно говорить о единообразии морфогенетических механизмов в рамках варикозной трансформации вен различной локализации.

В качестве доказательства наличия роли НДСТ в одном из исследований [1] авторы рассматривали врожденную слабость сосудистой стенки и недостаточность клапанного аппарата при ВРВНК в качестве аналога развития геморроя и ВЦ.

V. Bharath и соавт. [2] провели анализ данных, представленных в 38 публикациях и подтвердили наличие у пациентов с ВРВНК признаков полиморфизма генов, кодирующих синтез структурных компонентов стенок вен и отвечающих за процессы их ремоделирования. Так, были обнаружены признаки мозаичности генов, кодирующих синтез матриксных металлопротеиназ (MMP), которые определяют состояние внеклеточного матрикса; тканевого ингибитора металлопротеиназы (VEGF), ответственного за формирование стенок сосудов и процесс ангиогенеза в целом, а также генов, кодирующих синтез нескольких типов коллагенов. Таким образом, можно говорить о мозаичности генов, отвечающих за развитие варикозной трансформации вен за счет нарушения состоятельности каркаса сосудистой стенки [2]. Подобное исследование, посвященное роли наследственной предрасположенности к ВРВНК, провели и отечественные генетики; авторы проанализировали локусы rs11121615, rs6712038, rs507666, rs966562, rs7111987, rs6062618 и rs6905288 для установления связи между какими-либо фенотипическими признаками варикозного расширения вен и наличием основных сигналов GWAS (genome-wide association studies). Авторы отметили, что большая часть локусов с признаками полиморфизма локализовалась внутри или вблизи генов, оказывающих влияние на развитие и ремоделирование сосудов [3]. Кроме того, была найдена единственная работа, посвященная исследованию ремоделирования стенок при варикозном расширении вен, в которой кратко были представлены результаты электронно-микроскопических исследований (ЭМИ). Так, в мышечном слое выявлено нерегулярное расположение пучков гладкомышечных клеток (ГМК) с заполнением пространств между ними неравномерно и хаотически расположенными коллагеновыми волокнами. Данные изменения, по мнению авторов, вызывают потерю стенками вен мышечного тонуса в результате структурных нарушений за счет дезорганизации коллагеновых волокон и ГМК [4].

Схожесть механизмов варикозной трансформации вен различной локализации указывает на генетическую обусловленность процесса, в основе которого лежат прежде всего формирование «незрелых» коллагеновых волокон, а также изменения и других компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Таким образом, прослеживается прямая связь между наличием у пациента синдрома НДСТ и развитием ВЦ и ВРВНК. [5]. Согласно критериям, разработанным Т.И. Кадуриной («Диагностический коэффициент и коэффициент информативности признаков дисплазии соединительной ткани»), варикозное расширение вен различной локализации относится к проявлениям синдрома НДСТ — к так называемым малым феномам. Однако определяющая роль синдрома НДСТ в развитии варикозной трансформации вен на сегодняшний день признается не всеми исследователями. Вероятнее всего, это связано с тем, что клинические проявления синдрома НДСТ часто бывают размытыми за счет наличия большого количества стигм — больших и малых феномов, различные комбинации которых затрудняют проведение диагностического поиска.

Цель исследования — подтверждение роли синдрома НДСТ в развитии варикозной трансформации вен посредством изучения биоптатов их стенок на ультраструктурном уровне.

Материал и методы

Изучен биопсийный материал — фрагменты яичковой вены и поверхностной вены голени, полученные от 25 пациентов мужского пола, включая детей, подростков и мужчин молодого возраста, страдающих левосторонним ВЦ и ВРВНК. Возраст больных колебался от 6 до 26 лет; средний возраст составил 19 лет.

Все пациенты были разделены на три группы.

В 1-ю группу вошли 10 пациентов с левосторонним ВЦ:

— 5 пациентов 6—14 лет (дети и младший подростковый возраст), находящихся на лечении в отделении урологии и плановой хирургии ДГКБ №13 им. Н.Ф. Филатова;

— 5 пациентов 14—25 лет (старший подростковый возраст и взрослые), оперированных во 2-м урологическом отделении Института урологии и репродуктивного здоровья человека Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Степень выраженности заболевания у пациентов данной группы, согласно классификации Н.А. Лопаткина, распределилась следующим образом: ВЦ II степени — 1 мальчик и 3 мужчины, III степени — 2 мальчика и 4 мужчины. Всем детям была проведена лапароскопическая перевязка яичковых вен слева с сохранением путей лимфоотока с интраоперационным иссечением фрагмента вены. Всем мужчинам выполнено микрохирургическое вмешательство — операция Мармара.

Во 2-ю группу включены 10 пациентов с диагнозом ВРВНК:

— 5 пациентов 3—14 лет (дети и младший подростковый возраст), госпитализированных в отделение микрохирургии №2 РДКБ ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России;

— 5 пациентов 14—25 лет (старший подростковый возраст и взрослые), получавших лечение в отделении кардиохирургии УКБ №1 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Степень выраженности ВРВНК по классификации В.С. Савельева: II степень — 3 мальчика и 2 мужчины, III степень — 2 мальчика и 3 мужчины (в соответствии с классификацией В.С. Савельева). Всем мальчикам проведена минифлебэктомия по Варади, мужчинам выполнена комбинированная флебэктомия — операция Нарата.

В группах сравнения у всех пациентов диагноз был поставлен лечащим врачом и подтвержден дуплексным сканированием вен.

В группу контроля включены 5 практически здоровых мужчин в возрасте от 16 до 26 лет, погибших в результате дорожно-транспортного происшествия. Забор материала проведен во время вскрытия, которое проводилось не позднее первых суток на базе ГБУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения города Москвы». У каждого погибшего брали 2 образца ткани (2 типа вен): фрагмент левой яичковой вены и поверхностной вены голени.

Следует отметить, что для реализации так называемой чистоты эксперимента во все группы пациентов, страдающих варикозным расширением вен, включены только больные мужского пола. Известно, что наиболее значимыми провоцирующими факторами для развития данной патологии у молодых женщин являются беременность и роды. У всех мужчин проведен тщательный сбор анамнеза и исключены предрасполагающие факторы: особенности профессии (длительное стояние на ногах, перенос тяжестей), а также значительные физические нагрузки во время занятий спортом.

Материал (фрагменты стенок вен) был разделен на две части — первую фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине с последующей рутинной гистологической проводкой и окрашиванием гематоксилином и эозином, трихромом по Масону. Вторую часть для проведения ЭМИ фиксировали в 2,5% глутаральдегиде на PBS (Phosphate buffered saline или натрий-фосфатный буфер) в течение 48—72 ч. У каждого пациента проведен отбор двух фрагментов стенок вен, наиболее сохранного (максимального по толщине) и наиболее истонченного участка; дополнительно каждый из участков разрезали на поперечные микрофрагменты. Всю толщину поперечного среза стенки вены делили на 3—4 микрофрагмента для изучения всех продольно и поперечно ориентированных слоев мышечного слоя. Внутренний слой — эндотелиальные клетки и прилежащий тонкий слой внутренних продольных ГМК; средний — слой циркулярно расположенных ГМК; наружный — продольно ориентированные ГМК. Всего исследовано 108 микрофрагментов (32 — ВЦ, 41 — ВРВНК, 35 — контроль). Образцы разрезали на блоки размером не более 1 мм (поперечные срезы) с последующей рутинной проводкой — процедура их обезвоживания, заливки в смолу и изготовление серийных полутонких и ультратонких срезов до 70 нм с использованием микротома Reichert-Jung Optische Werke AG (Австрия). Затем фрагменты стенок вен помещали в медные решетки 3,5 мм и изучали с использованием сканирующего электронного микроскопа Zeiss EVO LS10 («Zeiss», Германия) и установленным детектором для просвечивающей микроскопии (STEM). Изображения получали в режиме высокого вакуума без предварительного напыления образца при ускоряющем напряжении 21,5 кВ и токе на образце 14—80 пА (катод LaB6).

В рамках ЭМИ во всех исследованных образцах проведен морфометрический анализ: замер толщины пучков коллагеновых волокон, а также продольного и поперечного размера ГМК, расстояния между отдельными клетками в участках наибольшей и наименьшей толщины стенок; выполнен статистический анализ полученных показателей.

Статистический анализ результатов исследования проведен с помощью программы IBM SPSS Statistics 23. Для описательной статистики количественные признаки представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение. Статистически значимыми считали различия при ρ<0,5.

Результаты и обсуждение

При морфологическом исследовании биоптатов стенок вен пациентов с ВЦ и ВРВНК как у детей, так и у взрослых пациентов обнаружены схожие характерные морфологические и морфометрические изменения, значительно отличающиеся от группы контроля.

На светооптическом уровне в обеих группах исследования выявлены аналогичные изменения, достаточно подробно описанные в ряде ранее опубликованных работ: неравномерность толщины стенок вен вплоть до их значительного истончения; наличие хорошо сформированных фиброзно-мышечных валиков, расположенных на одной стороне сосуда, часто в наиболее широких участках его стенки. В толще валиков выявлена характерная ориентация пучков ГМК и коллагеновых волокон перпендикулярно стенке сосуда. Кроме того, обнаружена неравномерная гипертрофия ГМК преимущественно в широких участках стенок, чередующаяся с фокусами атрофии части клеток. В наиболее истонченных участках стенки определены признаки межмышечного склероза разной степени выраженности вплоть до формирования соединительнотканных муфт вокруг как пучков ГМК, так и отдельных клеток с потерей их контактности. У пациентов старше 20 лет клапаны вен имели «вялую» текстуру и провисали в просвет сосуда, отмечались признаки их истончения и склероза. Такое изменение структуры стенок вен мы рассматриваем как процесс их ремоделирования — он является проявлением адаптивного ответа на повышение гидростатического давления венозной крови вкупе с несостоятельностью их стенок, в основе которой изначально лежит генетически детерминированная несостоятельность коллагеновых волокон в рамках синдрома НДСТ.

Для подтверждения концепции «неполноценности» соединительнотканного каркаса стенок вен и наличия признаков дезорганизации коллагеновых волокон на ультраструктурном уровне проведено комплексное ЭМИ, в рамках которого анализировали ряд параметров, прежде всего структуру, ориентацию и толщину пучков коллагеновых волокон в относительно сохранных участках (имеющих максимальную толщину) стенок вен. Кроме того, по тем же параметрам оценены пучки коллагеновых волокон, расположенные между ГМК в участках наибольшего истончения стенок с выявленными признаками выраженного межмышечного склероза на светооптическом уровне; также определены продольный и поперечный размеры ГМК, расстояние между отдельными клетками (в более широких и максимально истонченных фрагментах).

Для более информативной ультраструктурной оценки объема отдельных структур — пучков коллагеновых волокон и ГМК, а также для их ориентации в пространстве применяли сканирующий электронный микроскоп, который позволяет представить своеобразную 3D-модель исследуемой структуры.

По результатам проведенного исследования выявлены существенные изменения в структуре стенок варикозно-расширенных вен в обеих группах сравнения по сравнению с контрольными образцами. Даже в наиболее широких участках стенок вен, которые можно считать относительно сохранными, отмечены признаки дезорганизации и хаотического расположения как отдельных коллагеновых волокон, так и их пучков; кроме того, в части пучков имело место изменение их структуры по типу разрыхления, т.е. расширение межволоконных пространств за счет накопления межуточного вещества. Следует отметить, что в одном из биоптатов обнаружено значительное увеличение количества коллагеновых волокон в пучках (рис. 1). Также выявлены характерные ультраструктурные изменения ГМК в виде неравномерности толщины как отдельных клеток, так и их пучков, наличия между ними соединительнотканных прослоек различной толщины (рис. 2).

Рис. 1. Варикоцеле (взрослые), широкий фрагмент стенки.

Феномен «структурного хаоса» с дезориентацией и разрыхлением пучков коллагеновых волокон. Пучки имеют извилистый ход; количество фибрилл в пучках значительно увеличено. Сканирующая электронная микроскопия.

Fig. 1. Varicocele (adults), a wide wall fragment.

The phenomenon of structural chaos with disorientation and loosening of collagen fiber bundles. The bundles have a tortuous course; the number of fibrils is significantly increased in the bundles. Scanning electron microscopy.

Рис. 2. Варикозное расширение вен нижних конечностей (дети), широкий фрагмент стенки.

а — зияющий просвет вены (в центре) и пучки ГМК различной толщины продольного и циркулярного слоя. Сканирующая электронная микроскопия; б — пучки ГМК разной толщины (часть циркулярного и продольного слоев), хаотическая ориентация некоторых пучков, слабовыраженный межмышечный склероз. Сканирующая электронная микроскопия.

Fig. 2. Varicose veins in the lower extremities (children), a wide wall fragment.

a — the patulous lumen of a vein (in the center) and longitudinal and circular SMC bundles of different thickness Scanning electron microscopy; b — SMC bundles of different thickness (some of the circular and longitudinal layers); chaotic orientation of some bundles; mild intermuscular sclerosis.

Замер толщины пучков коллагеновых волокон как в наиболее широких, так и в максимально истонченных участках стенок проведен с использованием просвечивающей электронной микроскопии. По итогам морфометрического исследования выявлена значительная вариабельность числового ряда от 1,543 до 74,879 мкм в обеих группах исследования (рис. 3). Вследствие столь выраженного разброса показателей подсчет средних значений и оценка достоверности измерений не представлялись возможными. Такая разница полученных значений напрямую связана с определенными морфологическими изменениями. Имели место вариабельность количества коллагеновых волокон в пучках (максимально оно достигало 37, в группе контроля не превышало 5). Структура коллагеновых волокон по типу их разрыхления также менялась в виде расширения межволоконных пространств вследствие накопления межуточного вещества. Кроме того, ранее мы упоминали наличие обрывистости ввиду извитого хода и хаотического расположения как отдельных коллагеновых волокон, так и пучков в целом, безусловно, данные изменения также напрямую повлияли на результаты замеров. В группе контроля толщина пучков коллагеновых волокон колебалась от 1,226 до 10,098 мкм, а поперечник одного коллагенового волокна варьировал от 1 до 3 мкм, что соответствует нормальным значениям (см. рис. 3).

Рис. 3. Значения толщины пучков коллагеновых волокон.

Fig. 3. Collagen fiber bundle thickness values.

Помимо изучения качественных и количественных параметров коллагеновых волокон проведена оценка состояния ГМК продольных и циркулярного слоев стенок вен. Следует отметить, что в широких, структурно наиболее сохранных участках стенки размеры большинства ГМК практически не отличались от нормальных параметров клеток в биоптатах группы контроля, однако встречались отдельные пучки гипертрофированных клеток с большими значениями их продольных и поперечных замеров (рис. 4). Поскольку колебания средних показателей по сравнению с группой контроля были незначимы, мы посчитали возможным не приводить все полученные результаты.

Рис. 4. Варикозное расширение вен нижних конечностей (дети), широкий участок стенки.

Слабовыраженный склероз между пучками ГМК, отдельные клетки увеличены в объеме — гипертрофированы. Просвечивающая электронная микроскопия.

Fig. 4. Varicose veins in the lower extremities (children), a wide wall section.

Mild sclerosis between the SMC bundles; individual cells are increased in volume — hypertrophied. Transmission electron microscopy.

Что же касается состояния ГМК в участках максимального истончения стенок вен, то отмечено уменьшение их продольного и поперечного размера, т.е. уменьшение их объема. Также выявлено значительное расширение межклеточных пространств за счет увеличения количества коллагеновых волокон, отдельные пучки которых располагались хаотически и имели неравномерную толщину (рис. 5, 6, а, б).

Рис. 5. Варикозное расширение вен нижних конечностей (взрослые), истонченный участок стенки.

Выраженный межмышечный склероз. «Обрывистость» и хаотичное расположение пучков коллагеновых волокон, расположенных между ГМК, вакуолизация цитоплазмы ГМК. Просвечивающая электронная микроскопия.

Fig. 5. Varicose veins in the lower extremities (adults), a thinned wall section.

Severe intermuscular sclerosis. Abruptness and chaotic arrangement of collagen fiber bundles located between the SMCs; SMC cytoplasmic vacuolization. Transmission electron microscopy.

Рис. 6. Варикозное расширение вен нижних конечностей (дети), истонченный участок стенки.

ГМК различной толщины с вакуолизированной цитоплазмой, разделенные плохо сформированными пучками хаотически ориентированных коллагеновых волокон. Просвечивающая электронная микроскопия.

а — циркулярный слой ГМК; б — продольный слой ГМК.

Fig. 6. Varicose veins in the lower extremities (children), a thinned wall section.

SMCs of different thickness with vacuolated cytoplasm, which are separated by the poorly formed bundles of chaotically oriented collagen fibers. Transmission electron microscopy.

a — the circular layer of SMC; b — the longitudinal layer of SMC.

Результаты промеров ГМК, полученные в рамках проведенного морфометрического исследования, приведены в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Количественные параметры ГМК стенок вен при ВЦ

Возраст пациентов, годы

Продольный размер, мкм

Поперечный размер, мкм

Расстояние между ГМК, мкм

6—14

9,720±1,328

5,469±0,734

2,700±0,353

15—25

12,513±1,726

6,591±0,975

4,017±0,724

Контроль

18,164±1,634

9,719±0,605

1,212±0,410

Таблица 2. Количественные параметры ГМК стенок вен при ВРВНК

Возраст пациентов, годы

Продольный размер, мкм

Поперечный размер, мкм

Расстояние между ГМК, мкм

3—14

11,332±1,064

4,644±1,064

3,896±1,046

15—25

12,484±1,412

6,093±0,554

4,262±0,691

Контроль

21,563±4,850

9,715±0,691

0,885±0,501

Следует отметить, что во всех биоптатах группы контроля стенки вен имели равную толщину на всем протяжении циркулярного среза; отмечены четкая структуризация мышечного слоя стенок вен и тесное расположение пучков ГМК. Между ними определялись тонкие прослойки соединительной ткани — прослеживались четкая ориентация пучков коллагеновых волокон, равномерность их толщины на всем протяжении фрагмента. Очевидно, что представленные показатели обеих групп явно отличаются от таковых в группе контроля. Продольные и поперечные замеры клеток в обеих группах исследования меньше, а расстояния между клетками больше, таким образом, имеет место нарушение структуризации стенок, а также и контактности клеток в пучках ГМК за счет синтеза коллагеновых волокон и нарастания склеротических изменений. Данные изменения связаны с адаптивным ответом стенок вен на повышение гидростатического давления венозной крови, что как раз и характерно для II—III стадии заболевания, после активации ГМК синтетического типа и образования ими коллагеновых волокон происходит обратный эффект с «замуровыванием» пучков ГМК и отдельных клеток в соединительную ткань. Затем формируются так называемые муфты и последующая атрофия клеток. В финале процесса развиваются ригидность и несостоятельность стенки. Интересно, что изучение процесса ремоделирования стенок вен при варикозной болезни насчитывает вековую историю — еще в начале XX века А.М. Заблудовский [6] высказывал предположение о том, что в стенках вен при их варикозном расширении преобладает разрастание соединительной ткани.

По итогам статистического анализа параметров ГМК выявлены достоверные различия между исследуемыми показателями в обеих группах и группы контроля. Следует подчеркнуть, что не обнаружено существенных отличий средних арифметических значений при разной степени выраженности ВЦ и ВРВНК, а также между различными возрастными группами.

Интересно, что в источниках литературы удалось найти лишь одно подобное исследование, которое проводилось в Белорусском медицинском университете. С использованием ЭМИ авторы провели морфометрический анализ ГМК срединной оболочки стенки аорты и проанализировали количество клеток с целью выявления закономерности их возрастных изменений и определения двух фенотипов (сократительного и синтетического). Однако для определения размеров и формы ГМК авторами использован только косвенный метод — кариометрия изолированных клеток, полученных с использованием метода щелочной диссоциации, состояние соединительнотканного каркаса аорты не оценивалось. Кроме того, авторы работали с аутопсийным материалом, что могло повлиять на точность измерений [7].

Таким образом, проведенные комплексное электронно-микроскопическое исследование и морфометрический анализ можно считать приоритетными с точки зрения оценки взаимосвязи врожденной неполноценности соединительной ткани с варикозной трансформацией вен, поскольку именно ультраструктурный уровень позволяет увидеть изнутри морфогенетическую основу данных изменений.

Заключение

По результатам проведенного ЭМИ биоптатов стенок варикозно-расширенных вен выявлены характерные количественные и качественные изменения их соединительнотканного каркаса. Таковыми можно считать значительную вариабельность толщины пучков коллагеновых волокон за счет неравномерного распределения волокон в них; феномен «структурного хаоса» с фокусами неупорядоченного (непараллельного) расположения групп коллагеновых волокон; обрывистость отдельных волокон ввиду их извилистого хода; участки дезорганизации пучков (по типу разволокнения) и расширение части межволоконных пространств. Кроме того, следует отметить, что перечисленные изменения характерны как для «первичных» коллагеновых волокон, находящихся в наиболее сохранных (максимальных по ширине) участках стенки, так и для вновь синтезированных активными ГМК в наиболее истонченных участках. Этот факт указывает на ключевую роль генетически детерминированной несостоятельности соединительной ткани.

Изменение количественных параметров ГМК стенок варикозно-измененных вен, выявленное по результатам проведенного морфометрического исследования, в сочетании с явлениями выраженного межмышечного склероза в участках максимального истончения стенок является признаком перестройки структуры ткани или процесса ремоделирования. Данное изменение развивается в ответ на повышение гидростатического давления и характерно для стадии истощения компенсаторных механизмов.

Полученные результаты позволяют говорить о том, что роль синдрома НДСТ в развитии варикозной трансформации вен различной локализации можно считать доказанной; это дает возможность объединить эти заболевания в одно — системную варикозную болезнь.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — В.В. Студенникова, Л.О. Севергина

Сбор и обработка материала — В.В. Студенникова, Л.О. Севергина, И.А. Новиков

Статистическая обработка данных — В.В. Студенникова, И.А. Коровин

Написание текста — В.В. Студенникова, Л.О. Севергина

Редактирование — Л.О. Севергина, Л.М. Рапопорт, Г.Е.Крупинов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail