Павленко И.А.

ГБУ Ростовской области "Патологоанатомическое бюро", Ростов-на-Дону

Завалишина Л.Э.

ФГБУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена" Минздравсоцразвития России

Повилайтите П.Е.

ГБУ Ростовской области "Патологоанатомическое бюро", Ростов-на-Дону

Амплификация гена как механизм возникновения клональной гетерогенности при раке молочной железы

Журнал: Архив патологии. 2019;81(6): 49-55

Просмотров : 1681

Загрузок : 41

Как цитировать

Павленко И. А., Завалишина Л. Э., Повилайтите П. Е. Амплификация гена как механизм возникновения клональной гетерогенности при раке молочной железы. Архив патологии. 2019;81(6):49-55.
Pavlenko I A, Zavalishina L É, Povilaĭtite P E. gene amplification as a mechanism of clonal heterogeneity in breast cancer. Arkhiv Patologii. 2019;81(6):49-55.
https://doi.org/10.17116/patol20198106149

Авторы:

Павленко И.А.

ГБУ Ростовской области "Патологоанатомическое бюро", Ростов-на-Дону

Все авторы (3)

Введение

Современная онкология рассматривает HER2/neu как важное звено патогенеза развития рака молочной железы (РМЖ) [1]. Точечные мутации этого гена встречаются редко, однако амплификация наблюдается приблизительно в 15% случаев РМЖ. Опухоли с амплификацией HER2/neu, или HER2/neu-положительные РМЖ принадлежат к двум молекулярно-генетическим подтипам РМЖ: люминальному В- и HER2 (+)-подтипу [2].

Хорошо известно, что HER2-положительные РМЖ при отсутствии терапии характеризуются агрессивным течением, ранним метастазированием, низкой безрецидивной и общей выживаемостью [1, 2]. Таргетная (target — мишень) терапия гуманизированными моноклональными антителами к белку HER2/neu, такими как трастузумаб и пертузумаб, значительно увеличивает частоту полных патоморфологических регрессий опухолей, снижает риск рецидива, прогрессии и смерти от заболевания [3]. Прорыв в лечении HER2/neu-положительных опухолей привел к тому, что общепринятым методом оценки чувствительности к таргетной терапии стало определение статуса HER2/neu в рамках первичной диагностики РМЖ. На первом этапе HER2/neu-тестирования проводится скрининговое иммуногистохимическое (ИГХ) исследование экспрессии HER2. Результаты ИГХ-реакции оценивают в баллах от 0 до 3+. Опухоли с оценками 0 и 1+ считаются негативными и не подлежат лечению таргетными препаратами, 2+ имеют неопределенный результат, требующий проведения исследования амплификации гена HER2/neu с помощью гибридизации in situ (ISH), 3+ – HER2/neu-положительные опухоли. На следующем этапе проводится определение амплификации гена HER2/neu методом ISH (fluorescence in situ hybridization — FISH или его аналогами). При подтвержденной амплификации HER2/neu (в случаях, когда ИГХ-исследование опухоли дало оценку 3+ или амплификация гена была определена методом ISH) больным показано назначение одного из вариантов таргетной терапии с использованием различных анти-HER2/neu-препаратов. Стандарты HER2/neu-тестирования, в которых прописан четкий алгоритм его проведения и интерпретации результатов, изложены в рекомендациях Американского общества клинической онкологии и Коллегии американских патологов (ASCO/CAP) [4]. Рекомендации ASCO/CAP корректируются раз в несколько лет, если новые исследования дают основания к пересмотру этого документа. Так, например, по сравнению с рекомендациями ASCO/CAP 2013 г. [5] обновленные рекомендации 2018 г. коснулись достаточно редко встречающихся, но сложных для однозначной трактовки результатов ISH. Алгоритм HER2/neu-тестирования изменился в следующих случаях, если при ISH:

— соотношение HER2/CEP17 ≥2 и среднее количество копий гена HER2/neu <4 сигналов на клетку;

— соотношение HER2/CEP17 <2 и среднее количество копий гена 4≤ HER2/neu <6 сигналов на клетку.

Диагностический подход в этих случаях требует комбинированного анализа результатов ISH и ИГХ, а также повторной оценки результатов ISH. При сохранении показателей HER2/CEP17 и количества копий HER2/neu в том же диапазоне результат интерпретируется как HER2/neu-отрицательный. Если при ISH соотношение HER2/CEP17 <2 и среднее количество копий гена HER2/neu ≥6 сигналов на клетку, результат (с теми же условиями, что указаны для вышеописанных случаев) интерпретируется как HER2/neu-положительный. Эти изменения в трактовке результатов важны в первую очередь с клинической точки зрения, так как дают возможность получить необходимую терапию исключительно нуждающимся в ней пациентам [6].

Известно, что опухоли молочной железы демонстрируют значительную вариабельность клеточного состава на генетическом уровне [6, 7]. Амплификация HER2/neu — не исключение и не является устойчивой величиной. Вариабельность числа копий HER2/neu наблюдается как между клетками одной опухоли (пространственная гетерогенность), так и при прогрессии заболевания (временная гетерогенность). Многочисленные исследования указывают на то, что существование в пределах одной опухоли клеток с различным HER2/neu-статусом во многом определяет ответ на таргетную терапию, а также объясняет феномен резистентности к проводимому лечению [6, 8, 9]. Показано, что наибольшее количество гетерогенных опухолей составляют РМЖ с неопределенным с помощью ИГХ- и FISH-метода HER2/neu-статусом [10, 11]. Однако с клинической точки зрения представляют интерес опухоли, по результатам FISH однозначно попадающие в категорию HER2-положительных, поскольку определить эффективность таргетной терапии необходимо именно для них.

Цель исследования — оценить вариабельность амплификации HER2/neu-положительных по статусу РМЖ и объяснить ее с биологической точки зрения.

Материал и методы

В исследование вошли пациенты, которым в 2018 г. в рамках первичной диагностики РМЖ на базе ГБУ РО ПАБ определяли уровень экспрессии и амплификацию гена HER2/neu. С предварительно отобранных парафиновых блоков изготовляли серийные срезы, один из которых подвергали ИГХ-исследованию, а на другом, в случае если ИГХ-оценка статуса HER2/neu дала неопределенный результат (2+), выполняли FISH-исследование. ИГХ-исследование экспрессии HER2/neu осуществляли на автостейнере Ventana Benchmark GX («Ventana», США) по стандартному протоколу компании «Ventana», включающему депарафинизацию, восстановление антигена, окрашивание моноклональными анти-HER2/neu-антителами (клон 4B5, «Ventana», США) и докраску ядер гематоксилином. Оценку уровня экспрессии белка HER2/neu проводили в соответствии с рекомендациями ASCO/CAP в редакции 2018 г. [4].

FISH-исследование проводили с использованием гибридайзера по стандартному протоколу к набору HER2 IQFISH pharmDx («Agilent Technologies», Дания). Коденатурацию тканевой ДНК и смеси зондов осуществляли в течение 10 мин при 66 °C, последующую гибридизацию проводили при 45 °C в течение 90 мин. Препараты оценивали, подсчитывали количество сигналов в 20/40 ядрах опухолевых клеток при увеличении в 400 и 1000 раз, после чего вычисляли соотношение HER2/CEP17.

При описании данных для количественных признаков ввиду отклонения их распределения от нормального рассчитывали медиану и границы 95% доверительного интервала (ДИ), вычисленные при помощи процедуры бутстрепа. Межгрупповые сравнения проводили с применением критериев Манна—Уитни и Краскела—Уоллиса. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Зависимость наличия в опухоли гетерогенности амплификации HER2/neu от соотношения HER2/CEP17 оценивали с помощью модели бинарной логистической регрессии. Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS Statistics (версия 21, SPSS). Графические построения выполнены в пакете GraphPad Prism (версия 8).

Результаты и обсуждение

Согласно рекомендациям ASCO/CAP, оценка результатов FISH-исследования проводится в комбинации с данными ИГХ и базируется на основании подсчета количества копий гена HER2/neu и соотношения HER2/CEP17 в 20/40 ядрах опухолевых клеток. Амплификация считается подтвержденной при значениях HER2/CEP17 ≥2 и числе копий гена HER2/neu ≥4. При этом речь идет о средних значениях. Интересны не только эти показатели, но и количество копий HER2/neu, а также соотношение HER2/CEP17 в каждом учтенном ядре каждой опухоли. На основании этих цифр на материале, полученном от 25 пациентов (500 значений каждого показателя), были построены диаграммы рассеяния (рис. 1, 3),

Рис. 1. Вариабельность количества копий гена HER2/neu у пациентов с амплификацией HER2/neu (n=25). Каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует подсчитанному значению HER2/neu в одном опухолевом ядре.
Рис. 3. Вариабельность отношения HER2/CEP17 у пациентов с амплификацией HER2/neu (n=25). Каждая точка на диаграмме рассеяния соответствует вычисленному значению HER2/CEP17 в одном опухолевом ядре.
графики значений медиан и 95% ДИ (рис. 2, 4).
Рис. 2. Медианы и 95% доверительные интервалы количества копий гена HER2/neu в каждом опухолевом ядре (n=20) образцов РМЖ с амплификацией HER2/neu.
Рис. 4. Медианы и 95% доверительные интервалы соотношения HER2/CEP17 в каждом опухолевом ядре (n=20) образцов РМЖ с амплификацией HER2/neu.
На диаграмме рассеяния количества копий гена HER2/neu очевидны не только значительная вариабельность этого показателя в каждой конкретной опухоли, но и отличия опухолей друг от друга (см. рис. 1). Лишь в опухолях нескольких пациентов расположение точек (каждая точка соответствует подсчитанному значению HER2/neu в одном опухолевом ядре) на диаграмме достаточно компактное. То же самое наблюдается в отношении HER2/CEP17 (см. рис. 3). На графиках значений медиан и 95% ДИ (см. рис. 2, 4) точками обозначены медианные показатели HER2/neu и HER2/CEP17, а «усы» обозначают границы 95% ДИ и почти всегда асимметричны, что указывает на отклонение распределения признаков от нормального. Ширина 95% ДИ (размах «усов») свидетельствует о большой вариативности показателей. Существенные отличия количества копий гена HER2/neu между опухолевыми клетками, находящимися в непосредственной близости друг от друга, отмечены многими исследователями [8, 12, 13]. Наиболее вероятное объяснение такой неоднородности амплификации HER2/neu — повторяющиеся BFB-циклы (Breakage-Fusion-Bridge), лежащие в основе механизма амплификации генов. Каждый BFB-цикл начинается с двухцепочечного разрыва ДНК с последующим образованием нестабильной дицентрической хромосомы, в которой во время анафазы митоза происходит следующий двухцепочечный разрыв [14]. Поскольку количество таких разрывов, как и самих BFB-циклов, в каждой клетке абсолютно случайно, это приводит к вариабельности амплификации, визуально определяющейся методом FISH.

На графиках обращает на себя внимание не только тот факт, что 95% ДИ демонстрируют широкую вариабельность показателей, но и то, что в ряде случаев 95% ДИ вообще не перекрываются друг с другом. Это может указывать на статистически значимые различия между группами. Действительно, при сравнении медианных значений 25 групп между собой с помощью критерия Краскела—Уоллиса установлены достоверные различия как между количеством копий HER2/neu, так и соотношением HER2/CEP17 у разных пациентов (Н(24)=232,4; р<0,001 и Н(24)=267,2; р<0,001 соответственно). Апостериорные попарные сравнения не проводили ввиду того, что количество тестируемых гипотез 300, а при таком их числе существует большая вероятность случайно обнаружить ложную статистическую взаимосвязь.

Однако подсчет соотношения HER2/CEP17 в каждой учтенной опухолевой клетке каждого образца и соотнесение его с количеством копий HER2/neu позволили обнаружить, что в 7 случаях из 25 в образце опухоли присутствуют клетки с соотношением HER2/CEP17 <2 и количеством копий гена HER2/neu 4 ≤ HER2/neu <6. Рекомендации ASCO/CAP в редакции 2018 г. относят такие опухоли (с некоторыми допущениями, как пересмотр результатов ИГХ и трактовка на основе данных ИГХ- и FISH-метода в совокупности, повторный подсчет FISH-сигналов) к HER2/neu-негативным [4]. Поэтому, если в опухоли обнаруживали клетки с соотношением HER2/CEP17 <2 и количеством копий гена 4 ≤ HER2/neu <6, подсчет проводили повторно. Если результат не менялся, интерпретировали его как отсутствие амплификации гена HER2/neu. Опухолевые клетки без амплификации были единичными — их количество в наших образцах составляло от 5 до 15%.

Поделив анализируемую выборку на две группы — имеющих и не имеющих опухолевые клетки без амплификации, обнаружили статистически значимые их различия: критерий Манна—Уитни U(7, 18)=20; р=0,0076. В группе с гетерогенной амплификацией значения HER2/CEP17 были ниже, чем в группе, в которой все учтенные клетки характеризовались наличием амплификации HER2/neu: 2,37 (95% ДИ 2,06—3,43) и 3,93 (95% ДИ 3,39—4,55). Данные группы отличались и по количеству копий гена HER2/neu на ядро: критерий Манна—Уитни U(7, 18) = 24; р=0,0166. Количество копий гена HER2/neu в группе опухолей с гетерогенной амплификацией составило 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45), в группе без таковой — 10,65 (95% ДИ 6,95—12,10).

Зависимость наличия в опухоли клеток без амплификации от показателей среднего значения HER2/CEP17 можно оценить с помощью модели бинарной логистической регрессии. Для наших образцов эта модель описывалась уравнением: y = 1 / (1 + e–(3,2—1,3x)), где у — вероятность наличия в HER2-положительной опухоли клеток без амплификации, х — среднее значение отношения HER2/CEP17 в 20 клетках этой опухоли. Данная зависимость статистически значима: критерий отношения правдоподобия G(1) = 3,8942; р=0,00485.

Пороговое значение HER2/CEP17, при котором в опухоли c положительным HER2/neu-статусом обнаруживаются клетки без амплификации (не важно, в каком количестве), составляет 2,5. Так как во всех проанализированных РМЖ отношение HER2/CEP17 ≥2, а количество копий гена HER2/neu ≥4 (в большинстве случаев 6 и более), они, бесспорно, относятся к категории HER2/neu-положительных, при этом больным показана наиболее эффективная для них таргетная терапия. Однако является ли феномен неоднородности амплификации клинически незначимым?

Применение таргетной терапии при РМЖ — один из великолепных примеров успеха персонализированной медицины и огромный прорыв в онкологии. Использование таргетных препаратов существенно ограничено первичной или приобретенной резистентностью, в основе которой лежит множество факторов, в том числе и генетическая гетерогенность опухоли. Существование генетической гетерогенности — пространственной и временно́й — отличительная черта РМЖ, что отмечается во многих исследованиях [9, 15, 16]. Вероятно, появление нескольких субклонов в пределах одной опухоли является одним из способов изменения ее злокачественного потенциала [17]. В нескольких ретроспективных исследованиях показано, что гетерогенные РМЖ ассоциированы с плохим прогнозом [18, 19]. Авторы объясняют прогрессию заболевания существованием резистентных к терапии субклонов опухоли, получающих конкурентное преимущество на фоне проводимого лечения. Поэтому определение и характеристика таких клонов имеют не только научный интерес, но и непосредственное отношение к прогнозу течения и выбору тактики лечения заболевания.

Определение мутационного статуса различных субклонов опухолей, которое стало возможным благодаря появлению методов полногеномной амплификации и секвенирования нового поколения, убедительно продемонстрировало существование в каждом из них совершенно особых генетических аберраций. Так, клетки без амплификации HER2/neu могут отличаться наличием амплификации других генов — BRF2(8p11-p12) и DSN1(20q13), а также соматическими мутациями HER2/neu [7]. Мутации PIK3CA в HER2/neu-положительных РМЖ с гетерогенной экспрессией HER2/neu также встречаются в тех клетках, где амплификации HER2/neu не наблюдается [20]. Клиническое значение обнаружения этих генетических аберраций пока неясно, но то, что различия между опухолями с разной долей HER2/neu-отрицательных опухолевых клеток в основной популяции с амплификацией HER2/neu существуют, продемонстрировано в нескольких работах. Так, например, показано, что РМЖ с высокой вариабельностью количества копий гена HER2/neu и присутствием клеток без амплификации на фоне доминантной HER2/neu-положительной опухоли имеют более высокий риск прогрессии и развития отдаленных метастазов по сравнению с гомогенными по амплификации HER2/neu-положительными опухолями, а также опухолями с отрицательным HER2/neu-статусом [21]. Эти РМЖ, по-видимому, очень близки описанным M. Ballard и соавт. [22] опухолям с «неклассическими» результатами FISH. Авторы отнесли к ним среди прочих РМЖ с низкой амплификацией, а именно те опухоли, которые при соотношении HER2/CEP17 ≥2 имеют среднее количество копий гена HER2 на ядро от 4 до 6. Проанализировав данные 8000 пациентов, исследователи обнаружили, что время до прогрессирования таких опухолей статистически значимо меньше, чем опухолей с «классической» амплификацией.

Следует отметить, что градации низкой амплификации отличаются в разных исследованиях. Например, в работе А. Borley и соавт. [23] это опухоли с количеством копий гена HER2/neu на клетку от 6 до 12. Авторы отмечают, что они резистентны к таргетной терапии в адъювантном режиме и имеют плохой прогноз по сравнению с РМЖ с более высоким количеством копий HER2/neu. Анализируемая выборка при соотношении HER2/CEP17 ≥2 содержит 6,25 (95% ДИ 4,3—12,45) копии гена HER2/neu на ядро, т. е. соответствует описанным в исследовании [23] опухолям с низкой амплификацией. Хотя причины неэффективности терапии авторами в этой работе не обсуждаются, считаем, что гетерогенность амплификации HER2/neu может играть здесь определенную роль. Амплификация HER2/neu, вероятно, вносит значительный вклад в появление опухолевых клонов de novo, генетическое и клональное разнообразие РМЖ. Таргетная анти-HER2/neu-терапия, действуя на чувствительные к ней HER2/neu-позитивные клетки, может способствовать селективному отбору минорных субклонов с отрицательным HER2/neu-статусом и прогрессии заболевания. В случаях, которые ранее интерпретировались как неопределенные в отношении амплификации HER2/neu (согласно рекомендациям ASCO/CAP, 2013), гетерогенность амплификации, возможно, выражена гораздо сильнее, чем в опухолях с положительным HER2/neu-статусом.

Заключение

Таким образом, амплификация HER2/neu при РМЖ чрезвычайно вариабельна как в пределах одной опухоли, так и между опухолями одного биологического подтипа. Более того, наличие в образце опухоли клона с амплификацией HER2/neu не исключает присутствия минорных субклонов с отрицательным HER2/neu-статусом, которым могут быть присущи другие генетические аберрации. Если при FISH-исследовании с двойной флюоресцентной меткой обнаружена амплификация гена HER2/neu и при этом соотношение HER2/CEP17 составляет 2≤ HER2/CEP17<2,5, образец опухоли с большой вероятностью будет содержать такие минорные субклоны. Показатель степени выраженности гетерогенности опухоли может иметь важное значение при прогнозировании исхода заболевания и выборе тактики лечения РМЖ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Л.Э.З., И.А.П.

Сбор и обработка материала — И.А.П., П.Е.П.

Статистическая обработка — И.А.П.

Написание текста — И.А.П.

Редактирование — Л.Э.З., П.Е.П.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Павленко И.А. — https://orcid.org/0000-0002-4578-8263; e-mail: pavlenko.ir@gmail.com

Завалишина Л.Э. — https://orcid.org/0000-0002-0677-7991

Повилайтите П.Е. — https://orcid.org/0000-0002-0934-0349

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Павленко И.А., Завалишина Л.Э., Повилайтите П.Е. Амплификация гена HER2/neu как механизм возникновения клональной гетерогенности при раке молочной железы. Архив патологии. 2019;81(6):-55. https://doi.org/10.17116/patol201981061

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail