Известно, что при старении головного мозга наблюдается пролиферация клеток глии. В работе V. Lombardi и соавт. [1] показано ускорение пролиферативных процессов в клетках микроглии в условиях in vitro под воздействием сыворотки крови пациентов с болезнью Альцгеймера, а M. Nieto-Sampedro [2] выявил схожее воздействие на астроциты экстрактов мозга.

Увеличение активности микроглии, вероятно, имеет универсальный характер и наблюдается как при старении, так и при различных нейродегенеративных состояниях [3]. Сравнительное исследование патолого-анатомических и патофизиологических механизмов при старении и ряде нейродегенеративных заболеваний выявило если не идентичную, то достаточно схожую картину изменений [4]. Таким образом, можно предположить, что с возрастом происходит накопление и/или секреция биологически активных факторов, модифицирующих физиологическое состояние клеток глии.

В связи с этим мы изучили влияние экстрактов головного мозга человека разных возрастных групп на возможные изменения морфологии и поведения клеток в условиях in vitro.

Экстракты головного мозга человека. Образцы мозговой ткани человека получены через 12—24 ч после вскрытия. Фронтальные части коры головного мозга замораживали при –32 °С. Фронтальные части мозга хранили при –30 °С до использования и затем гомогенизировали в трех объемах холодного 25 мМ буфера трис-HCl; pH 7,4, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитола (DTT) и 0,1 мМ пиридоксаль-5’-фосфата. Гомогенаты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 20 мин при 40 °C [5]. M. Arvaniti и соавт. [6] брали экстракт мозга молодых людей (ЭММЛ), умерших в возрасте 22,5±2,7 года, и старых (ЭМСЛ), которым на момент смерти было 80,9±3,0 года. Хранение экстрактов до начала экспериментальной работы осуществляли при –80 °С. Количество экстрактов в группе ЭМСЛ — 9, а в группе ЭММЛ — 4.

Клетки. Культуру клеток нейробластомы SK-N-MC культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Посевная доза клеток составляла 10⁵ клеток/мл. В контрольных исследованиях (в качестве положительного контроля) использовали человеческую сыворотку в дозе 50 мг/мл.

Цитофотометрия ДНК. С помощью микроскопа-фотометра SMP-05 телевизионным методом после окраски препаратов реактивом Шифа по Фельгену определяли количество ДНК (длина волны 575 нм) в ядрах культуры клеток. В качестве диплоидного стандарта использовали нестимулированные лимфоциты человека и выявляли распределение клеток культуры по плоидности. Данная методика удобна для определения нарушений клеточного цикла, а также полиплоидизации [7].

Окраска кислых белков быстрым зеленым (Fast green FCF). Окраску быстрым зеленым применяли согласно Brumberg, Pevzner, 1978. Подобная окраска является количественным методом для определения кислых (негистоновых) белков ядра [8, 9]. С помощью данного метода изучали количество кислых белков цитоплазмы ядра и ядрышка. Содержание кислых белков определяли отдельно в ядре и ядрышках.

Поляризационная микроскопия. Поляризационную микроскопию применяли для изучения морфологических характеристик созревания и дифференцировки клеток в культуре. Данная методика основана на способности двойного лучепреломления и используется для исследования неокрашенных и живых клеток [10].

Исследование токсичности экстрактов привело к выводу, что диапазон концентраций экстракта головного мозга человека, являющийся нетоксичным для клеток SK-N-MC, составляет 0,1—100 мг/мл. При концентрации экстракта головного мозга человека 0,1 мг/мл стимулирующего пролиферацию клеток действия состава выявлено не было. Составы с концентрацией экстракта 100 мг/мл применять нецелесообразно из-за опасности токсического воздействия на клетки и повреждения клеточного монослоя. После нескольких экспериментальных воздействий с различными концентрациями выбрана доза 50 мг/мл. Надо добавить, что в одинаковых концентрациях ЭММЛ несколько более токсичны по сравнению с ЭМСЛ.

Параллельно поставлены опыты с положительным контролем с использованием вместо экстрактов мозга человека сыворотки крови в аналогичных дозах. Однако в изучаемых дозах сыворотка крови человека не вызывала изменений по сравнению с контролем (поэтому при описании дальнейших исследований эти данные не приводятся).

Из таблицы

По данным литературы, контрольная популяцияsk-N-MC в целом псевдодиплоидная — модальное количество хромосом в ней колеблется от 43 до 50, однако примерно 4% клеток культуры полиплоидны, что совпадает с данными R. Seeger и соавт. [11]. На рис. 1 видно,

Под воздействием ЭМСЛ происходит сдвиг гистограммы распределения ядер клеток SK-N-MC по классам плоидности ДНК влево. С учетом данных, касающихся пролиферативных изменений в клетках (см. таблицу), можно заключить, что при воздействии ЭМСЛ происходит деблокирование клеток, находящихся в фазе G₂ (что приводит к увеличению митотической активности культуры). При воздействии ЭММЛ происходят гибель чувствительных клеток и блок некоторых клеток в фазе G₂ (в целом сдвиг происходит на фоне подавления митотической активности культуры).

Одновременно с этим происходят и изменения в морфологии клеток SK-N-MC. Как видно на рис. 2, в

Изменения количественных показателей содержания кислых белков в различных частях клеток в контроле и под воздействием ЭМСЛ представлены на рис. 3.

Под влиянием ЭМСЛ снижается содержание кислых белков в ядре и ядрышке при сохранении их размеров. В цитоплазме происходят обратные процессы — увеличивается содержание кислых белков. При этом под воздействием ЭММЛ эти же показатели в целом остаются без заметных изменений. Одновременно с этим возникают выраженные изменения морфологии и поведения клеток в условиях in vitro — укорачиваются отростки клеток нейронального происхождения и увеличивается их пролиферационная активность. Последнее не в последнюю очередь является следствием деблокирования клеток, находящихся в фазе G₂ при воздействии ЭМСЛ.

Учитывая, что кислые белки чаще всего имеют ферментативную активность и в цитоплазме в основном связаны с синтезом белка (B. Setyono и соавт., 1979) [12], можно предполагать усиление синтетических процессов в клетках SK-N-MC под влиянием ЭМСЛ. Уменьшение количества кислых белков в ядре и ядрышках клеток связано с деблокированием клеток, находящихся в фазе G₂ (следовательно, и с уменьшением количества ДНК) и носит кратковременный характер.

Патология мозга (механическая травма, болезнь или даже нормальное старение) вызывает сильную пролиферативную реакцию, называемую астроглиозом [13]. Астроглиоз можно рассматривать как попытку восстановить гомеостаз в поврежденном мозге с помощью важных функций, включая формирование глиального шрама, регуляцию иммунных реакций и модуляцию выживаемости нейронов [14]. Это приводит к морфологическим и функциональным изменениям клеток нейронального происхождения [15].

Повышение содержания кислых белков в цитоплазме клеток SK-N-MC под воздействием ЭМСЛ свидетельствует, с одной стороны, об активации синтетических процессов в клетке, а с другой — о ее старении [16].

Показано, что ЭММЛ не усиливает (в некоторой степени даже снижает), а ЭМСЛ усиливает пролиферацию клеток культуры. Изменение морфологии клеток под воздействием ЭМСЛ говорит об упрощении структуры клеток.

На сегодняшний день глиальные клетки, поддерживающие цитоархитектуру и гомеостатическую регуляцию, без которых нейроны не могут нормально функционировать в здоровых тканях, являются основными клетками, реагирующими на повреждение ЦНС. Изменения функции глиальных клеток во время ответа на патологию могут сильно влиять на нейронные взаимодействия и функции ЦНС [17]. Таким образом, реакция клеток ЦНС на повреждение рассматривается как одно из проявлений восстановления поврежденной ткани, свойственной практически всем биологическим объектам [17].

Полученные данные свидетельствуют о накоплении с возрастом в мозге человека факторов, ускоряющих пролиферацию клеток в условиях in vitro. Одновременно с ускорением пролиферации клеток происходит изменение метаболической активности и морфологии клеток. Показано, что факторы, стимулирующие подобные реакции, легко экстрагируются и сохраняют свою биологическую активность в условиях in vitro. Действие ЭММЛ является более токсическим и не вызывает усиления пролиферации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Каралян Наира Юрьевна — e-mail: naira_karalyan@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3401-0939