Под амиантоидной трансформацией (АТ) или дегенерацией понимают образование скоплений пучков аномально толстых, как правило, взаимопараллельных волокон в гиалиновых хрящах, опухолях, сухожилиях [1—7]. Такие волокна называют амиантоидными или асбестоидными. Во многих работах эти участки обозначают как очаги фибриллярности хряща. Коллагеновая природа амиантоидных волокон (АВ) показана рядом авторов, применявших световую и электронную микроскопию, а также рентгеновскую дифракцию [2, 8]. АВ имеют типичную для коллагена поперечную исчерченность с периодом в 67 нм и диаметр, превышающий таковой нормальных коллагеновых фибрилл хряща и других соединительных тканей вплоть до 10 раз, что связано с латеральной агрегацией типичных коллагеновых фибрилл. Функциональное значение АТ остается неизвестным. Предполагают, что она может быть либо результатом реорганизации матрикса, либо его дегенеративных изменений [2, 9].

Врожденные деформации грудной клетки (ВДГК) детей, к которым относятся воронковидная (pectus excavatum) и килевидная (pectus carinatum) деформации, помимо косметического дефекта, приводят к патологии органов дыхания и сердечно-сосудистой системы [10]. Этиология и патогенез ВДГК выяснены недостаточно, но ряд исследователей относят их к проявлениям дисплазии соединительной ткани [11] и считают важнейшим фактором в их генезе структурно-функциональные изменения хрящевой части ребер [12, 13]. Морфологические исследования реберных хрящей при ВДГК немногочисленны и весьма противоречивы. В единственной работе есть указание на присутствие в матриксе хряща «асбестоидных фибрилл», выявленных при трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) [14]. Других исследований, посвященных АТ при ВДГК, нами больше не обнаружено. Таким образом, на сегодняшний день отсутствует достаточная информация о функциональном значении АТ реберных хрящей и ее роли в патогенезе врожденных деформаций грудной клетки.

Целью исследования явилось изучение морфологических особенностей АТ реберного хряща у детей с нормальной и килевидной грудной клеткой.

Для световой микроскопии и гистохимии использованы образцы ткани реберного хряща IV и V ребер от 5 пациентов обоего пола в возрасте от 13 до 16 лет с килевидной деформацией грудной клетки (II—III степени), полученные при реконструктивной торакопластике. В исследование не были включены пациенты с тяжелыми травмами грудной клетки в анамнезе, синдромами Тернера и Нуннан, рахитом и другими заболеваниями опорно-двигательного аппарата, а также с заболеваниями, приводящими к изменениям размеров органов грудной клетки. В качестве контроля изучены аутопсийные образцы реберных хрящей IV и V ребер, взятых у 6 детей обоего пола в возрасте от 8 до 17 лет без деформаций и травм грудной клетки.

Фрагменты тканей фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина, декальцинировали в Electrolytic decalcifying solution («Bio Optica», Италия). В парафин добавляли модификатор парафина гистомикс для улучшения качества срезов, («БиоВитрум», Россия). Из всех образцов изготавливали поперечные и продольные серийные срезы толщиной 4—5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, пикросириусом, методом Маллори в модификации Gallego на коллагеновые волокна, толуидиновым синим на кислые гликозаминогликаны (ГАГ). Изучение, анализ и микрофотографирование гистологических препаратов проводили с использованием микроскопа Leica DM4000 BLED, оснащенного цифровой видеокамерой Leica DFC7000 T c программным обеспечением LAS V4.8 («Leica Microsystems», Швейцария). Препараты изучали при световой, фазово-контрастной, темнопольной, поляризационной и флюоресцентной микроскопии (ртутная металлогалогеновая лампа (Leica EL6000, кубический фильтр L5).

В целях объективизации полученных результатов проведено морфометрическое исследование микрофотографий 29 поперечных срезов реберных хрящей (7 при килевидной деформации, 22 являлись контролем). Всю площадь срезов фотографировали при темнопольной микроскопии при увеличении 100 (объектив HC PL FLUOTAR 10×/0,30 PH1; площадь области снимка 1245×934 мкм, площадь фотографии 2 764 800 пикселей). Каждому изображению присваивали порядковый номер с формированием серии из 20—40 микрофотографий на каждый микропрепарат. Далее с помощью генератора случайных чисел (http://randstuff.ru/number/) были отобраны по 10 микрофотографий из каждой серии. Затем для каждого типа АТ в выбранных полях зрения проводили оценку частоты встречаемости в полях зрения (в %), а также средней относительной площади АТ по формуле (1). Измерение площади АТ производилось вручную при помощи программы Adobe Photoshop CS6 (инструмент «Магнитное лассо»).

Х = a10∙0,42 мкм²/пиксель (в мкм²), (1)

где X — средняя относительная площадь участков АТ в 10 полях зрения (в мкм²), а — сумма площади участков АТ в 10 полях зрения (в пикселях), 0,2 мкм²/пиксель —коэффициент перерасчета пикселей в мкм².

Результаты морфометрического исследования анализировали статистически с использованием стандартного пакета программ IBM SPSS Statistics 20. Расчет 95% ДИ частот встречаемости различных типов АТ в группе контроля и в группе пациентов с килевидной деформацией проводили по формуле (2) [15] с помощью программы Excel программного пакета Microsoft Office 2010.

95% ДИ = P±1,96∙√P,(1 – P)N + 0,5N∙100 (в %), (2)

где P — выборочная доля (в долях единицы), N — общее число наблюдений.

Оценка разницы средней относительной площади АТ в двух группах осуществлялась посредством сравнения ДИ 95% для средних значений. Для оценки корреляции между возрастом и средней относительной площадью разных типов АТ, а также между средней относительной площадью различных типов АТ применялся двусторонний критерий Спирмена при уровне значимости р равном 0,05.

Гистологическое изучение продольных и поперечных срезов реберного хряща у детей как с нормальной, так и с килевидной грудной клеткой выявило участки АТ, состоящие из аномальных коллагеновых волокон (АВ) разных размеров, формы и строения.

Выделено 4 типа АТ (табл. 1). Все они мозаично располагаются в хрящевой ткани. Наиболее известный, по данным литературы, тип участков АТ (обозначен как «классический») представляет собой пучки прямых (реже извитых) взаимопараллельных АВ, образующих крупные скопления в виде дуг, полуколец, колец и лентовидных разветвлений, а также других причудливых форм, видимые лучше на поперечных срезах хряща. Участки А.Т. имеют относительно четкие границы и располагаются преимущественно в межтерриториальном матриксе глубокой зоны хряща. При окраске гематоксилином и эозином АВ характеризуются базофилией, реже встречаются эозинофильные волокна (рис. 1, а). Они слабо фуксинофильны при окраске пикрофуксином по Ван Гизону и окрашиваются в разные оттенки красного при окраске пикросириусом. При окраске по Маллори в модификации Gallego АВ окрашиваются в разные оттенки синего при розовом цвете остального матрикса хряща. Все это свидетельствует, что на молекулярном и фибриллярном уровнях структура коллагена в АВ не претерпевает заметных изменений. Окраска толуидиновым синим дает мозаичную картину содержания кислых ГАГ в различных участках АТ. В одних участках АТ метохромазия матрикса ослабляется, в других — усиливается или не меняется по сравнению с нативным матриксом. Различия между АВ и нативным матриксом в оптической плотности и преломляющей способности позволяют хорошо их визуализировать с помощью фазово-контрастной (см. рис. 1, б) и темнопольной (см. рис. 1, в) микроскопии. Также для АВ характерно выраженное двойное лучепреломление (анизотропия), свойственное коллагену, которое позволяет их выявлять на фоне нативного матрикса с помощью поляризационной микроскопии. Причем анизотропия значительно усиливается при предварительной окраске срезов пикросириусом (см. рис. 1, г). Флюоресцентная микроскопия выявляет в АВ аутофлюоресценцию такой же интенсивности, как у нативного матрикса.

Межклеточный матрикс вокруг «классических» участков АТ часто имеет тонковолокнистую структуру, которая особенно четко визуализируется при темнопольной и фазово-контрастной микроскопии (см. рис. 1, в, рис. 2, а, б). Такая структура не свойственна известной структуре нативного матрикса гиалинового хряща, в котором при световой микроскопии в отличие от электронной волокна не видны. По нашему мнению, такие участки представляют собой другой тип АТ — тонковолокнистый. Часто они занимают значительную площадь, превышая размеры «классического» типа А.Т. Содержание ГАГ в этих участках, как правило, увеличено, по сравнению с нативным матриксом реберного хряща. При большом увеличении (в 1000 раз) в тонковолокнистом типе АТ видны скопления хаотично расположенных волоконец, среди которых встречаются волокна игольчатой формы (см. рис. 2, б). Местами видно, что такие волокна стремятся выстроиться параллельно друг другу и слиться между собой, формируя более толстые переплетенные волокна (см. рис. 2, в). Эти структурные особенности позволяют выделить подобные участки в самостоятельный тип АТ — переплетенный. Нередко они входят в состав «классических» участков. Иногда в них встречаются скопления звездчатой формы (см. рис. 2, г).

Хондроциты, окружающие их лакуны и матрикс в области АТ часто подвергаются различным деструктивным изменениям разной степени. Местами участки «классической» АТ вокруг зон деструкции матрикса формируют своеобразную «корону» (см. рис. 1, б, рис. 2, а). В крупных очагах «классической» АТ между АВ нередко видны овальные или щелевидные полости (см. рис. 1, а). Они заполнены аморфным, тонковолокнистым или зернистым содержимым, структура которого лучше видна при использовании специальных методов микроскопии, таких как флюоресцентная (рис. 3, а), темнопольная и фазово-контрастная микроскопия. По форме, размерам и наличию капсулы эти полости соответствуют крупным изогенным группам, которые также располагаются вблизи (реже внутри) участков «классического» типа (см. рис. 3, б). Как правило, эти группы состоят из 10 хондроцитов и более, которые (как и отдельные клетки, не формирующие группы) подвергаются разным формам повреждения: жировой дистрофии, вакуолизации, некробиозу и апоптозу. В результате деструкции клеток образуются овальные или щелевидные пространства, заполненные клеточным детритом либо звездчатыми АВ и иногда хаотично переплетены (см. рис. 3, в). Они также хорошо выявляются при фазово-контрастной (см. рис. 3, г) и темнопольной (см. рис. 1, в) микроскопии. Вышеописанный вариант АТ мы обозначили как внутрилакунарный тип. Нередко в подобных лакунах отмечаются деструкция капсулы (см. рис. 3, г) и признаки слияния АВ внутрилакунарных и «классических» участков (см. рис. 1, в). Часто все типы АТ связаны с дистрофически измененными хондроцитами, однако редко встречаются участки АТ в бесклеточных зонах.

Следует отметить, что наблюдаются существенные различия в количестве, размерах (площади), форме, ориентации и внутренней структуре участков АТ в разных ребрах одних людей и даже в разных участках одного среза реберного хряща. Для объективной оценки различий частоты встречаемости и площади АТ в норме и при килевидной деформации грудной клетки было проведено морфометрическое исследование с использованием методов математической статистики.

Результаты статистической обработки данных морфометрии (табл. 2) свидетельствуют о достоверном увеличении частоты встречаемости всех (кроме внутрилакунарного) типов АТ и средней относительной площади тонковолокнистого типа при килевидной деформации грудной клетки по сравнению с нормой. При килевидной деформации площадь других типов имеет тенденцию к увеличению (без статистически значимых отличий).

Корреляционный анализ между возрастом и средней относительной площадью АТ показал наличие статистически значимых корреляций в обеих группах (для всех типов — 0,531 (p=0,003), для «классического» — 0,85 (p<0,001) и переплетенного типов — 0,391 (p=0,036)) и в группе контроля для «классического» типа — 0,868 (p<0,001).

При анализе корреляций между различными типами АТ выявлены статистически значимые корреляции в обеих группах (между «классическим» и переплетенным — 0,422 (p=0,023), «классическим» и внутрилакунарным — 0,461 (p=0,012), а также между переплетенным и внутрилакунарным типом — 0,498 (p=0,006)), в группе контроля (между «классическим» и переплетенным — 0,463 (p=0,03), «классическим» и внутрилакунарным — 0,534 (p=0,01), а также между переплетенным и внутрилакунарным типом — 0,587 (p=0,004)) и в группе с килевидной деформацией (между «классическим» и переплетенным — 0,422 (p=0,023), «классическим» и внутрилакунарным — 0,461 (p=0,012), а также между переплетенным и внутрилакунарным типом — 0,498 (p=0,006)).

Анализ данных литературы и результатов собственных исследований показывает, что утолщение коллагеновых структур вплоть до образования АВ — достаточно частый феномен в реберных хрящах нормальной грудной клетки, появляющийся в детском возрасте и усиливающийся при взрослении [1, 2, 6, 9]. Его причины еще недостаточно изучены, а состав АВ неизвестен. Иммуногистохимических исследований АВ реберного хряща нами не обнаружено. Скорее всего этот феномен связан с возрастными изменениями реберных хрящей и, по-видимому, с характером и интенсивностью механических нагрузок, которые испытывает хрящ в ходе роста и функционирования.

Существует точка зрения, что АВ формируются в результате латеральной агрегации из уже сформированных коллагеновых фибрилл [2, 9]. Следует подчеркнуть, что понятие «волокна» подразумевает видимые в световой микроскоп коллагеновые структуры в отличие от понятия «фибриллы», которые видны лишь при электронной микроскопии. Тенденция к слиянию коллагеновых структур матрикса хряща подтверждается нами при фазово-контрастной микроскопии при увеличении 1000, а также промежуточными результатами других наших исследований с использованием атомно-силовой, трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопий.

Известно, что прочность соединительной ткани зависит от толщины и ориентации коллагеновых волокон [16]. Толстые и параллельно ориентированные коллагеновые волокна имеют большую прочность на разрыв при растяжении, в то время как переплетенные тонкие фибриллы нативного матрикса гиалинового хряща (например суставного) обеспечивают его упругость. Реберный хрящ в отличие от суставного испытывает иные нагрузки (изгиб, ротация, растяжение) и, что, возможно, отражается на его структуре в виде компенсаторного образования АВ — более толстых, чем типичные коллагеновые структуры нативного матрикса. Вероятно, в тех участках, которые испытывают наибольшее напряжение, АВ образуют взаимопараллельные скопления с ориентацией, соответствующей направлениям нагрузки (что особенно характерно для «классического» типа). Это объясняет мозаичный характер и разнонаправленность хода волокон в АТ. По-видимому, такая структура обеспечивает устойчивость хряща к разнонаправленным механическим нагрузкам.

Отличительной особенностью этой работы является то, что, помимо «классического» типа, мы впервые выделили другие типы АТ матрикса: тонковолокнистый, переплетенный и внутрилакунарный. Этому способствовало применение фазово-контрастной (особенно при большом увеличении), темнопольной и поляризационной микроскопии. Эти методы, основанные соответственно на интерференции, преломлении и поляризации света, выявляют АВ, резко отличающиеся от нативного матрикса оптическими свойствами. Также выявлены статистически достоверные связи между «классическим» типом и возрастом в норме, между различными типами АТ (кроме тонковолокнистого) как в норме, так и при килевидной деформации, между АТ (кроме внутрилакунарного типа) и килевидной деформацией.

Особое значение при формировании АВ имеют взаимоотношения хондроцитов и матрикса. На наш взгляд существует три возможных механизма таких взаимоотношений. Первый предполагает первичное повреждение хондроцитов (в виде дистрофии, некробиоза, вакуолизации, апоптоза), вызванное гипоксией, характерной для глубоких отделов хряща, в сочетании с механическим воздействием. Поврежденные хондроциты или их фрагменты могут менять метаболизм и спектр коллагенов матрикса, приводя к появлению в нем АВ в составе «классического», переплетенного и тонковолокнистого типов АТ. В ответ на повреждение в таких участках появляются крупные изогенные группы (неполноценная регенерация). Деструкция хондроцитов этих групп вызывает образование внутрилакунарного типа АТ, который сливается с «классическим» при полном разрушении их капсулы.

Второй вариант предполагает первичное повреждение матрикса с формированием в нем АВ с последующим повреждением хондроцитов. Это приводит к изменениям матриксно-клеточных взаимодействий, неполноценной регенерации и способствует образованию А.В. Замыкается порочный круг. Третий вариант предполагает одновременное протекание и взаимное влияние вышеуказанных процессов.

Следует думать, что разные типы АТ являются стадиями единого процесса: постепенного перехода от тонковолокнистого к переплетенному и, наконец, к «классическому» типу, который появляется с возрастом. Необходимо отметить, что тонковолокнистый тип АТ наиболее распространен в хряще, однако его площадь не коррелирует ни с одним из других типов. В то же время площади других типов АТ имеют положительные корреляции друг с другом. Это может свидетельствовать о том, что наличие тонковолокнистого типа — необходимый, но недостаточный фактор для последующего развития других типов АТ.

В литературе дискутируется вопрос об адаптивной или патологической природе АТ, о чем свидетельствует термин «амиантоидная дегенерация» [2]. По нашему мнению, АТ, начинаясь как приспособительное ремоделирование матрикса, постепенно приобретает патологические черты, так как нельзя исключить, что она формируется при «изнашивании» матрикса под влиянием возрастающей нагрузки.

По данным литературы [6, 13], периоды формирования АТ и килевидной деформации грудной клетки совпадают. Нами обнаружено статистически достоверное увеличение частоты встречаемости и площади АТ в реберных хрящах при килевидной деформации. Подобное ремоделирование матрикса хрящевой ткани либо изменяет ее механические свойства, способствуя деформации, либо отражает неадекватную для нее нагрузку деформированной грудной клеткой. Однако и во втором случае изменения хряща могут способствовать прогрессированию деформации (механизм положительной обратной связи). Не исключено, что взаимосвязь АТ и килевидной деформации может быть связана с общей первопричиной, возможно, с дисплазией соединительной ткани. По нашему мнению, взаимосвязь АТ и килевидной деформации свидетельствует об усилении процессов ремоделирования хряща.

1. В реберном хряще в норме и при килевидной деформации обнаружены аномальные коллагеновые структуры (амиантоидные волокна), формирующие участки амиантоидной трансформации разных типов: «классический», тонковолокнистый, переплетенный и внутрилакунарный. Они связаны между собой и, по-видимому, являются стадиями морфогенеза АТ.

2. Фазово-контрастная, темнопольная и поляризационная микроскопия выявляет особенности структуры АВ и может быть использована для дифференциации АТ.

3. Статистический анализ результатов морфометрического исследования выявил достоверное увеличение частоты встречаемости и площади АТ при килевидной деформации по сравнению с нормой, что, по нашему мнению, свидетельствует о роли АТ в патогенезе заболевания.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда по гранту № 14−25−00055.

Авторы выражают благодарность Университету Маккуори (Сидней, Австралия) за предоставление А.Е. Гуллер исследовательской стипендии iMQRes.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.В.К., А.Б.Ш., А.Е.Г., В.C.П.

Сбор и обработка материала: А.В.К., А.Б.Ш., В.А.П.

Статистическая обработка данных: А.В.К., А.Е.Г.

Написание текста: А.В.К., А.Б.Ш.

Редактирование: А.Б.Ш., А.Е.Г., В.С.П.

Конфликт интересов отсутствует.