Демура С.А.

ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздрава России

Коган Е.А.

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва

Пауков В.С.

Кафедра патологической анатомии ГБОУ "Первый МГМУ им. И.М. Сеченова"

Морфология и молекулярные основы повреждения ниши стволовых клеток респираторного ацинуса при идиопатических интерстициальных пневмониях

Журнал: Архив патологии. 2014;76(6): 28-36

Просмотров : 84

Загрузок : 4

Как цитировать

Демура С. А., Коган Е. А., Пауков В. С. Морфология и молекулярные основы повреждения ниши стволовых клеток респираторного ацинуса при идиопатических интерстициальных пневмониях. Архив патологии. 2014;76(6):28-36.
Demura S A, Kogan E A, Paukov V S. The morphology and molecular bases of damage to the stem cell niche of respiratory acini in idiopathic interstitial pneumonias. Arkhiv Patologii. 2014;76(6):28-36.

Авторы:

Демура С.А.

ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздрава России

Все авторы (3)

Доказано, что от глубины и характера повреждения зависят тип регенерации и выраженность развивающихся склеротических изменений [1, 6]. Согласно современным представлениям, в ремоделировании легочной ткани участвуют стволовые клетки как тканевого, так и костномозгового происхождения, прежде всего мезенхимальные стволовые костномозговые клетки. В тканях стволовые клетки располагаются в определенных структурных компартментах, называемых нишами стволовых клеток (НСК), которые обеспечивают их жизнедеятельность в активном и дормантном состоянии, а также участие в процессах репарации [8, 10]. В респираторных отделах легких существует несколько зон, в которых формируются НСК и обнаруживаются стволовые клетки [9]. Такими зонами НСК респираторного ацинуса являются бронхиолярно-альвеолярная переходно-клеточная зона (БАПЗ), где располагаются клетки Клара (КК) и интерстициальные клетки (ИК), зона стыка альвеол (ЗСА), где находятся пневмоциты 2-го порядка (Пн2п), и межальвеолярные капилляры [9]. Важная роль в осуществлении репаративных процессов, помимо стволовых клеток, принадлежит и прогенеторным клеткам мезенхимального и эпителиального происхождения, перицитам и эндотелию сосудов, а также компонентам экстрацеллюлярного матрикса и базальным мембранам [9]. В связи с этим изучение повреждения зон НСК в патогенезе идиопатических интерстициальных пневмоний (ИИП) представляет особый интерес, поскольку эта гетерогенная группа заболеваний неуточненной этиологии характеризуется преобладанием диффузного и обычно хронического поражения интерстиция респираторных отделов легких, прежде всего альвеол и бронхиол [2, 5].

Согласно международной клинико-морфологической классификации 2001 г. (ATS, ERS, 2001), ИИП относят к интерстициальным болезням легких (ИБЛ), характеризующимся преимущественно хроническим течением, наличием воспаления, приводящего к нарушению структур альвеолярных перегородок, эндотелия легочных капилляров, перивазальных и перилимфатических тканей [7]. В подгруппу ИИП входят следующие заболевания: идиопатический легочный фиброз (ИЛФ), имеющий морфологическую картину обычной интерстициальной пневмонии (ОИП), и другие ИИП, отличающиеся от ИЛФ: десквамативная интерстициальная пневмония (ДИП), криптогенная организующаяся пневмония с облитерирующим бронхиолитом (КОП с ОБ), неспецифическая интерстициальная пневмония (НСИП) и другие варианты ИИП [7].

Вместе с тем известные в настоящее время механизмы прогрессирования ИИП от стадии альвеолита до стадии выраженного фиброза (так называемого сотового легкого) оставляют без ответа ряд принципиально важных вопросов, затрудняющих разработку методов их эффективной терапии. Нет единого мнения об особенностях патогенеза и морфогенеза заболеваний этой группы. Одновременно существуют воспалительная и репарационная теории патогенеза ИИП [4, 5, 11]. Вопрос о значении зон НСК в повреждении респираторного ацинуса и в прогрессировании фиброза и аденоматоза при ИИП, а также молекулярно-морфологические особенности зон НСК остаются не изученными. Однако именно эти знания могут помочь в диагностике и выборе тактики лечения.

В связи с этим целью исследования являлось изучение морфологических и молекулярно-биологических особенностей повреждения зон НСК респираторных отделов легких и значения возникших в них изменений в патогенезе хронических ИИП, включая ИЛФ, ДИП, КОП с ОБ и НСИП.

Материал и методы

Проведен ретроспективный клинико-морфологический анализ открытых трансторакальных (181) и трансбронхиальных (71) биопсий легких от 194 пациентов, страдающих ИИП, лечившихся в клиниках Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. В качестве контроля исследовали открытые биопсии легких от 10 пациентов с неподтвержденным диагнозом саркоидоза легких. В соответствии с морфологической картиной были диагностированы ИЛФ - 118 (61%) случаев, НСИП - 35 (18%), ДИП - 23 (12%), КОП с ОБ - 18 (9%) случаев.

Серийные парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по ван Гизону, а также использовали для проведения иммуногистохимического выявления антигенов иммунопероксидазным методом со стрептовидиновой меткой по общепринятой методике (А. Janice, 1983).

В качестве первичных антител применяли моноклональные антитела к MMP 1, 2, 7, Apo-Cas («Novocastra», концентрация 1:100), Виментину (Vimentin), SMA («LabVision», концентрация 1:100), TGFβ , CD68, EMA («Dako», концентрация 1:100), TNFα, Oсt-4, СD117, CD34 («Dako», концентрация 1:50). В качестве вторичных антител применяли биотинилированные антитела к иммуноглобулинам мыши и кролика («Dako» LSAB + KIT, PEROXIDASE). Рабочая концентрация вторичных антител составила 1:200. Ядра докрашивали гематоксилином. Ставили позитивные и негативные контрольные реакции. Результаты иммуногистохимических реакций оценивали в процентах клеток одного типа с позитивными реакциями, а также с применением полуколичественного метода в баллах. Интенсивность ангиогенеза рассчитывали по количеству сосудов в 10 полях зрения при увеличении в 400 раз.

В исследовании особое внимание уделяли изучению процессов повреждения респираторных отделов легкого, включая апоптоз, некроз, а также оценивали агрессивность альвеолярных макрофагов и выраженность воспалительного ответа. При этом учитывали локализацию и выраженность этих процессов в зонах НСК. Различия глубины, локализации и выраженности повреждения при разных ИИП подтверждали данными иммуногистохимического исследования.

Статистическая обработка данных выполнена на персональном компьютере с помощью электронных таблиц Microsoft Excel и пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0, «StatSoft Inc.» (США). Все полученные количественные и полуколичественные данные обработаны методом вариационной статистики.

Количественные показатели были проверены на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (δ), ошибка среднего (m), медиана (Ме), 95% доверительный интервал. Данные приведены в виде M±m. Для сравнения количественных данных (после их проверки на нормальное распределение) использовали t-критерий Стьюдента для двух независимых выборок. Для сравнения непараметрических данных применяли критерий Манна-Уитни (для двух групп) для несвязанных совокупностей. Статистически значимыми считали отличия при р<0,05 (95% уровень значимости) и при р<0,01 (99% уровень значимости). Связь между изучаемыми показателями оценивали по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона (r) или Спирмена (R) и последующим установлением его значимости по критерию t.

Результаты и обсуждение

1. Морфологические и молекулярно-биологические особенности ОИП

При ОИП патологические изменения респираторных отделов легких локализовались в БАПЗ и зоне стыка альвеол, где эпителиальная выстилка отсутствовала, что нередко сочеталось с разрушением базальной мембраны (рис. 1, а)

Рисунок 1. ОИП. а - БАПЗ с отсутствием эпителиальной выстилки, разрушением базальной мембраны и МФБ. Окраска гематоксилином и эозином. ×400.
. Обнаруживали воспалительный инфильтрат с большим содержанием альвеолярных и интерстициальных макрофагов (экспрессирующих CD68), с примесью полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ), а также лимфоцитов (см. рис. 1, б)
Рисунок 1. ОИП. б - экспрессия в альвеолярных и тканевых макрофагах CD60. ×200.
с образованием в легочной ткани «лимфоидных фолликул». В просвете альвеол определялись ПЯЛ. Участки разрушенной базальной мембраны замещались SMA (рис. 2, а)
Рисунок 2. Экспрессия SMA и CD34 в ОИП. а - экспрессия SMA в МФБ. ×200.
и виментинпозитивными миофибробластами, некоторые из которых экспрессировали CD117, Oct-4 и CD34 (см. рис. 2, б)
Рисунок 2. Экспрессия SMA и CD34 в ОИП. б - экспрессия в МФБ CD34. ×200.
. Имел место тромбоз микрососудов, сопровождающийся ишемией ацинарных отделов, что усиливало повреждение. Процесс распространялся на несколько зон НСК: стык альвеол, БАПЗ и микрососуды интерстиция. При ОИП экспрессия Apo-Cas отчетливо была выражена в зонах НСК: в БАПЗ, зонах стыка альвеол и вокруг микрососудов (капилляров и венул). Средний уровень экспрессии Apo-Cas в этих зонах в альвеолярном эпителии (АЭ) составил 0,7±0,2%, в эпителии аденоматозных структур (АдЭ) - 12,7±1,6%, в бронхиолярном эпителии (БЭ) - 8,2±1,6%, в альвеолярных макрофагах (АМФ) - 4,5±0,8% и миофибробластах (МФБ) - 2±0,6% (рис. 3, 4, а)
Рисунок 3. ОИП: экспрессия Apo-Cas. ×400.
Рисунок 4. Средние значения экспрессии маркеров повреждения в различных клетках при ИЛФ. ОИП (а, б), КОП и ОБ (в, г), ДИП (д, е), НСИП (ж, з) и в контроле (и, к). ГЭ - эпителиоидные клетки гранулем, КПЛ - клетки Пирогова-Лангханса, ЛФ - лимфоциты.
. Обнаружена прямая корреляционная зависимость уровней экспрессии в АМФ, БЭ и МФБ (p≤0,05). ОИП достоверно отличался от контроля высокими уровнями экспрессии Apo-Cas (р≤0,05) (см. рис. 4, и). ОИП характеризовался достоверно более высокими уровнями экспрессии и других маркеров повреждения в отличие от контроля (см. рис. 4, к). Средние уровни экспрессия TGFβ в НСК в АЭ составил 3,4±0,1%, в АдЭ - 5,2±0,1%, в БЭ - 5,4±0,1%, в АМФ - 4,5±0,1%, в ФБ - 4,4±0,2%, в МФБ - 5,2±0,1% и в эндотелии (Энд) - 5,2±0,1% (см. рис. 4, а). Прямые корреляционные зависимости были обнаружены между уровнями экспрессии TGFβ в различных клетках зон НСК при ОИП (p≤0,05): АЭ, БЭ, МФБ, АМФ и Энд. Уровень экспрессии TGFβ в АМФ и МФБ напрямую коррелировал с уровнем экспрессии в этих клетках Apo-Cas.

Экспрессия TNFα при ОИП обнаруживалась в тех же зонах и типах клеток, что и Apo-Cas, и TGFβ. Были зафиксированы следующие средние уровни экспрессии TNFα в клетках зон НСК: в АЭ 0,4±0,1 балла, в АдЭ 0,8±0,1 балла, в БЭ 5,4±0,1 балла, в АМФ 4,5±0,2 балла, в ФБ 1,7±0,2 балла, в МФБ 3,9±0,2 балла и в Энд 2,9±0,2 балла (см. рис. 4, б). Были обнаружены прямые корреляционные зависимости между уровнями экспрессии TNFα в АЭ и БЭ, МФБ и фибробластами (ФБ), а также обратные корреляционные взаимодействия между уровнями экспрессии в БЭ и МФБ, а также в БЭ и ФБ (р≤0,05).

Уровни экспрессии металлопротеаз были относительно высокими. ММР7, отвечающая за реализацию эффектов TGFβ, экспрессировалась в тех же зонах НСК, что и Apo-Cas, TGFβ и TNFα. Экспрессию ММР7 обнаруживали в следующих клетках зон НСК: в АЭ (1,6±0,2 балла), АдЭ (2,6±0,3 балла), БЭ (1,3±0,2 балла), АМФ (1,5±0,3 балла), ФБ (1,0±0,2 балла) (см. рис. 4, б). Уровень экспрессии ММР7 коррелировал с экспрессией TGFβ в ФБ, МФБ и Энд (р≤0,05). Прямая корреляционная зависимость обнаружена между экспрессией MMP7 и TNFα в АЭ, МФБ, ФБ, АМФ (р≤0,05). ММР2 - протеаза, разрушающая мембраны, синтезирующаяся клетками воспалительного инфильтрата и в очагах неоангиогенеза при репарации, была обнаружена в участках разрушения базальных мембран в зонах НСК как в экстрацеллюлярном матриксе, так и в АЭ (1,7±0,2 балла), АдЭ (2,0±0,3 балла), БЭ (0,4±0,1 балла), АМФ (3,6±0,2 балла), ФБ (4,6±0,2 балла), МФБ (4,0±0,2 балла) и Энд (4,5±0,2 балла) (см. рис. 4, б). Уровень экспрессии ММР2 обратно коррелировал с уровнем экспрессии Apo-Cas и TNFα в АМФ, ФБ, МФБ и Энд (р≤0,05) и коррелировал с экспрессией TGFβ и ММР7 в АЭ, АМФ, МФБ и ФБ (р≤0,05). Экспрессия ММР1, «макрофагальной» протеазы вызывающей повреждение респираторных отделов ацинуса, обнаруживалась при ОИП в АЭ (0,9±0,1 балла), АдЭ (2,9±0,2 балла), БЭ (0,9±0,2 балла), АМФ (1,2±0,2 балла) и МФБ (4,1±0,2 балла) (см. рис. 4, б). Уровни ее экспрессии в клетках зон ниш НСК коррелировали с уровнями экспрессии MMP7, MMP1, TNFα и TGFβ (р≤0,05).

Морфологическая картина ОИП, уровни экспрессии иммуногистохимических маркеров повреждения и локализация этой экспрессии свидетельствуют о глубоком повреждением зон НСК на всех уровнях респираторных отделов легкого, которое захватывает и БАПЗ, и ЗСА, и микрососуды и сопровождается разрушением базальных мембран всего респираторного ацинуса, выраженным апоптозом эпителиоцитов и высоким уровнем экспрессии металлопротеаз. Такие клетки, как АМФ, МФБ и ФБ, вероятно, играют ключевую роль при развитии первичного и вторичного повреждения, судя по данным корреляционного анализа.

2. Морфологические и молекулярно-биологические особенности КОП с ОБ

При КОП с ОБ на уровне бронхиол и альвеол имеет место экссудативное серозное воспаление с карнификацией и облитерацией их просветов на этой территории, некроз и апоптоз эндотелия альвеолярных капилляров и эпителия альвеол, что подтвердило иммуногистохимическое исследование на экспрессию Apo-Cas. При этом базальная мембрана в области зон НСК (БАПЗ и стыка альвеол) сохранялась.

При КОП с ОБ экспрессия маркеров повреждения в целом была ниже по сравнению с ОИП. Позитивно окрашенные клетки представлены АМФ, ЭД и ФБ, обнаруживаемыми в основном в просвете альвеол как в экссудате, так и в зонах карнификации. Средний уровень экспрессии Apo-Cas в клетках в зонах НСК БЭ составил 9,4±1,2%, в АМФ - 5,4±0,7%) (см. рис. 4, в). Обнаружена прямая корреляционная зависимость уровней экспрессии в Apo-Cas в АМФ и БЭ (p≤0,05).

Средние уровни экспрессия TGFβ при КОП с ОБ в АЭ составил 4±0,2%, АдЭ - 4±0,2%, БЭ - 6±0,0%, АМФ - 4±0,2%, ФБ - 6±0,0% (см. рис. 4, в). Прямая корреляционная зависимость обнаружена между уровнями экспрессии TGFβ в БЭ и МФБ (р≤0,05). Уровень экспрессии TGFβ в АМФ и БЭ напрямую коррелировал с уровнем экспрессии в этих клетках Apo-Cas (р≤0,05).

Экспрессия TNFα при КОП с ОБ обнаруживалась в тех же зонах и типах клеток, что и Apo-Cas, и TGFβ. Были зафиксированы следующие средние уровни экспрессии TNFα в клетках зон НСК: в АЭ 2±0,0 балла, БЭ 2,8±0,2 балла, АМФ 2,8±0,2 балла, ФБ 1,2±0,2 балла и Энд 2,4±0,2 балла (см. рис. 4, г). Были обнаружены прямые корреляционные зависимости между уровнями экспрессии TNFα в БЭ, АМФ и Энд (р≤0,05) и прямые корреляционные зависимости для экспрессии Apo-Cas, TGFβ и TNFα в БЭ и АМФ (р≤0,05).

ММР7 обнаруживалась в следующих клетках зон НСК: АЭ (0,8±0,3 балла), БЭ (3,2±0,4 балла), АМФ (1,6±0,1 балла), ФБ (2±0,3 балла) (см. рис. 4, г). Уровень экспрессии ММР7 при КОП с ОБ в БЭ коррелировал с таковым в АМФ (р≤0,05). Уровень экспрессии ММР7 в БЭ и АМФ коррелировал с экспрессией предыдущих маркеров в этих же клетках (р≤0,05). ММР2 при КОП с ОБ выявлена в АЭ (0,4±0,1 балла), БЭ (1,2±0,2 балла), АМФ (2,4±0,4 балла), ФБ (3,2±0,2 балла) и Энд (3,8±0,3 балла) (см. рис. 4, г). Прямая корреляционная зависимость обнаруживалась между уровнями экспрессии MMP2 в БЭ, АМФ, Энд и ФБ (р≤0,05) и между экспрессией в этих клетках MMP2, MMP7, Apo-Cas, TGFβ и TNFα (р≤0,05). Экспрессия ММР1 зафиксирована при КОП с ОБ в АЭ (0,8±0,1 балла), БЭ (1,6±0,4 балла), АМФ (1,6±0,3 балла) и ФБ (0,4±0,1 балла) (см. рис. 4, г). Уровни ее экспрессии в БЭ и АМФ коррелировали с уровнями экспрессии ММР2, MMP7, TNFα, TGFβ и Apo-Cas (р≤0,05).

При КОП с ОБ отмечено достоверное отличие от контроля более высокой экспрессией Apo-Cas в БЭ и АМФ (р≤0,05), ММР7 в БЭ, АМФ и ФБ (р≤0,05), ММР2 в БЭ, АМФ, ФБ и Энд (р≤0,05), ММР1 в БЭ и АМФ (р≤0,05). КОП с ОБ достоверно отличался от ОИП более низким уровнем экспрессии Apo-Cas в АЭ (р≤0,05), TGFβ и TNFα в АЭ, АдЭ, БЭ, АМФ, ФБ, МФБ и Энд (р≤0,05), MMP7 в АЭ, БЭ и ФБ (р≤0,05), ММР2 в АЭ, БЭ и АМФ (р≤0,05), ММР1 в БЭ и АМФ (р≤0,05).

Таким образом, КОП с ОБ характеризуется локализацией повреждения преимущественно на уровне респираторных бронхиол с экссудацией и организацией экссудата в просветах бронхиол и прилегающих альвеол. За счет сохранения базальных мембран такие зоны НСК, как БАПЗ и ЗСА, не повреждаются. Прямые корреляционные связи уровней экспрессии маркеров повреждения и воспаления делают АМФ и клетку Клара (БЭ) ключевыми игроками в процессе повреждения и воспаления при КОП с ОБ.

3. Морфологические и молекулярно-биологические особенности ДИП

При ДИП повреждение и лимфогистиоцитарный воспалительный инфильтрат выявляли в респираторных отделах легкого, но уже на уровне альвеол, включая НСК, располагающиеся в области их стыка (ЗСА). Имели место выраженная десквамация пневмоцитов и разрушение базальной мембраны альвеол. Десквамированные EMA-позитивные пневмоциты скапливались в просвете альвеол вместе с альвеолярными CD68-позитивными макрофагами. Вместе с этим поврежденные участки замещали Пн2п и SMA-позитивные МФБ, часть из которых экспрессировала CD117, Oct-4 и CD34.

При ДИП экспрессия маркеров повреждения в целом была ниже, чем при ОИП. Позитивно окрашенные клетки располагались в зоне стыка альвеол в местах разрушения базальных мембран, а также в просвете альвеол.

При ДИП высокие уровни экспрессии Apo-Cas определялись только в клетках зоны стыка альвеол. Средний уровень экспрессии Apo-Cas в клетках в зонах НСК в АЭ составил 0,5±0,1%, в десквамированном эпителии (ДЭ) - 12,5±0,5%, в АдЭ - 12,5±0,5%, в БЭ - 2,5±2,3%, в АМФ - 9,4±1,2% (см. рис. 4, д). Обнаружена прямая корреляционная зависимость уровней экспрессии в Apo-Cas в АМФ, ДЭ и АдЭ (p≤0,05).

Средние уровни экспрессии TGFβ при ДИП в АЭ составили 3±0,2%, ДЭ - 4±0,0%, АдЭ - 4±0,0%, БЭ - 5±0,2%, АМФ - 4±0,0%, ФБ - 3±0,7%, МФБ - 4±0,0%, Энд - 5±0,2% (см. рис. 4, д). Прямая корреляционная зависимость была обнаружена между уровнями экспрессии TGFβ в АЭ, ДЭ, АдЭ, АМФ и МФБ (р≤0,05). Уровень экспрессии TGFβ в АМФ напрямую коррелировал с уровнем экспрессии Apo-Cas (р≤0,05). Обратная корреляционная зависимость обнаружена между уровнями экспрессии TGFβ в МФБ, ФБ и Энд и уровнями экспрессии Apo-Cas в тех же клетках (р≤0,05).

Средние уровни экспрессии TNFα при ДИП составили в АЭ 1,8±0,3 балла, ДЭ 2,6±0,2 балла, АдЭ 2,6±0,2 балла, АМФ 6±0,0 балла (см. рис. 4, е). Были обнаружены прямые корреляционные зависимости между уровнями экспрессии TNFα в АЭ, ДЭ, АдЭ и АМФ (р≤0,05) и для экспрессии Apo-Cas, TGFβ и TNFα в АдЭ, АЭ и АМФ (р≤0,05).

Средние уровни экспрессии ММР7 при ДИП составили в АЭ 2±0,0 балла, ДЭ 2,0±0,0 балла, АдЭ 2,0±0,0 балла, АМФ 2±0,0 балла, ФБ 1,0±0,2 балла и МФБ 3,2±0,2 балла (см. рис. 4, е). Уровень экспрессии ММР7 в АМФ напрямую коррелировал с таковым в МФБ, АЭ, ДЭ и АдЭ (р≤0,05). Уровень экспрессии ММР7 в АЭ, ДЭ, МФБ, ФБ и АМФ коррелировал с уровнями экспрессии в этих же клетках TGFβ и TNFagr; (р≤0,05). Прямая корреляция обнаружена также между экспрессией Apo-Cas и ММР7 в АМФ, АдЭ и ДЭ (р≤0,05). Уровень экспрессии ММР2 при ДИП был в АЭ 1±0,2 балла, ДЭ 2±0,0 балла, АдЭ 2±0, АМФ 2±0,0 балла, ФБ 2±0,0 балла, МФБ 3,2±0,2 балла и Энд 2±0,0 балла (см. рис. 4, е). Прямая корреляционная зависимость обнаруживалась между уровнями экспрессии MMP2 в АЭ, АМФ, МФБ и Энд (р≤0,05) и между экспрессией в этих клетках MMP2, MMP7, TGFβ и TNFα (р≤0,05). Экспрессия ММР1 зафиксирована при ДИП в АЭ (2,3±0,1 балла), ДЭ (2,3±0,1 балла), АдЭ (2,3±0,1 балла), АМФ (2,6±0,2 балла), ФБ (1±0,2 балла), МФБ (2,5±0,2 балла) и Энд (1,0±0,2 балла) (см. рис. 4, е). Обнаружена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ММР1 в АЭ, ДЭ, АдЭ, АМФ и МФБ (р≤0,05). Уровни экспрессии ММР1 в АЭ и АМФ коррелировали с уровнями экспрессии ММР2, MMP7, TNFα, TGFβ и Apo-Cas (р≤0,05).

ДИП достоверно отличался в бóльшую сторону от контроля уровнями экспрессии Apo-Cas в АЭ, АдЭ и АМФ, уровнем экспрессии ММР7 в ФБ, уровнем экспрессии ММР2 в АЭ, БЭ, АМФ, ФБ и Энд (р≤0,05) и уровнем экспрессии ММР1 в АЭ, АМФ, ФБ и Энд. ДИП достоверно отличался от ОИП более низким уровнем экспрессии Apo-Cas в БЭ и в АМФ (р≤0,05), уровнями экспрессии TGFβ и TNFα в АЭ, АдЭ, АМФ, ФБ и МФБ (р≤0,05), MM 7 в БЭ (р≤0,05), уровнями экспрессии ММ 2 и ММ 1 в АЭ, БЭ, АМФ, ФБ и МФБ (р≤0,05). От КОП с ОБ ДИП достоверно отличался уровнем экспрессии Apo-Cas в АЭ, БЭ и АМФ (р≤0,05), уровнями экспрессии TGFβ и ММР2 в АЭ, БЭ, ФБ и Энд (р≤0,05), уровнями экспрессии TNFα в АдЭ, БЭ, АМФ, ФБ и Энд (р≤0,05), уровнями экспрессии ММР7 в АЭ, БЭ, ФБ и Энд (р≤0,05), и ММР1 в АЭ, БЭ, АМФ, ФБ и Энд (р≤0,05).

Таким образом, морфологическая и иммуногистохимическая картина при ДИП свидетельствует о преимущественном поражении ЗСА с вовлечением в процесс Пн2п и разрушение альвеолярных базальных мембран в ЗСА с меньшей степенью активности апоптоза и металлопротеаз. БАПЗ остается практически интактна в отличие от ОИП. Корреляционный анализ показывает, что ключевую роль в процессе повреждении и воспаления, так же как и при ОИП, принадлежит АМФ, МФБ и ФБ.

4. Морфологические и молекулярно-биологические особенности НСИП

При НСИП обнаруживали мелкие фокусы фибриноидного некроза в интерстициальной ткани легкого, лимфомакрофагальную инфильтрацию, а также мелкие сосуды с утолщенными стенками с плазморрагией и участками фибриноидного некроза, а также периваскулярные лимфогистиоцитарные инфильтраты. Базальные мембраны респираторного ацинуса оставались сохранными.

При НСИП экспрессия Apo-Cas не обнаруживалась (см. рис. 4, ж). Уровни экспрессии TGFβ были очень низкими и составили в АЭ 1,2±0,2%, АдЭ 1,1±0,2%, БЭ 0,6±0,2%, АМФ 2,3±0,2% и ФБ 2,6±0,2% (см. рис. 4, ж). Обнаружены прямые корреляционные взаимодействия между уровнями экспрессии TGFβ в АЭ, АМФ и ФБ (р≤0,05).

Экспрессия TNFα при НСИП обнаруживалась в АЭ (0,6±0,2 балла), АМФ (2,1±0,2 балла) и ФБ (1,4±0,2 балла) (см. рис. 4, з). Уровень экспрессии TNFα в АМФ прямо коррелировал с таковым в ФБ (р≤0,05), а также с уровнем экспрессии TGFβ в тех же клетках (р≤0,05).

Экспрессию ММР7 при НСИП определяли в БЭ (0,7±0,2 балла) и АМФ (0,7±0,2 балла) (см. рис. 4, з). Уровень экспрессии ММР7 в АМФ коррелировал с уровнем экспрессии в АМФ и ФБ TGFβ и TNFα (р≤0,05). Экспрессию ММР2 обнаруживали в АМФ (0,7±0,2 балла), ФБ (2,0±0,0 балла) и Энд (0,7±0,2 балла) (см. рис. 4, з) с прямыми корреляционными взаимодействиями между ними (р≤0,05). Уровень экспрессии ММР2 в АМФ напрямую коррелировал с уровнем экспрессии в АМФ TGFβ, TNFα и ММР7 (р≤0,05). При НСИП позитивное окрашивание на ММР1 обнаруживали только в АМФ (1,3±0,2 балла) (см. рис. 4, з). Уровень экспрессии ММР1 при НСИП в АМФ коррелировал с уровнями экспрессии в этих клетках TGFβ, TNFagr; , ММР7 и ММР2 (р≤0,05).

НСИП практически не отличался от контроля по уровням экспрессии маркеров повреждения. НСИП отличалась от других ИИП отсутствием экспрессии Apo-Cas (р≤0,05) и значительно более низкими уровнями экспрессии TGFβ, TNFα, ММР7, ММР2 и ММР1 (р≤0,05).

Таким образом в отличие от других ИИП НСИП характеризуется повреждением микрососудов легочного интерстиция с вторичным вовлечением эпителиоцитов, с сохранными базальными мембранами, мелкими очагами фибриноидного некроза и низким уровнем апоптоза и экспрессией металлопротеаз. Ключевой клеткой повреждения остается АМФ.

Результаты

Результаты проведенного исследования позволили установить, что в патогенезе и морфогенезе интерстициальных заболеваний легких важнейшую роль играет вовлеченность в повреждение и воспаление зон НСК легочной ткани. Распространенность повреждения с захватом одной или нескольких зон одновременно, его глубина с разрушением или с сохранностью эпителиальных базальных мембран в последующем определяют ход репаративных процессов, структурные перестройки и, в конечном счете, исход заболевания [1, 3, 4].

Ключевой и маркерной клеткой повреждения зон НСК в легких и срыва процесса репарации является МФБ [11] или, по нашим данным, некая мезенхимальная клетка с признаками миофибробластической дифференцировки, которая, скорее всего, является важнейшей клеткой в цепочке трансформаций от стволовой мезенхимальной клетки до зрелой дифференцированной эпителиальной клетки [8, 9]. Подтверждением этому является обнаруженная нами в данном типе клеток не только экспрессия VIM, SMA, но и CD34, CD117, Осt-4, экспрессия которых характерна для стволовых клеток. Вероятно, мезенхимальная клетка с признаками миофибробластической дифференцировки участвует в мезенхимально-эпителиальной трансформации, о чем свидетельствуют обнаруженный в этой работе факт о «латании дыр» МФБ в поврежденной базальной мембране и возможная экспрессия данными клетками маркеров эпителиальной дифференцировки - цитокератинов одновременно с маркерами мезенхимальной дифференцировки [9, 10]. Данное предположение согласуется с данными других авторов [9, 10].

Основываясь на двух вышеизложенных положениях, становятся понятными не только гетерогенность интерстициальных заболеваний в клиническом и морфологическом аспекте, но и различия в их патогенезе, морфогенезе и исходах. Наиболее тяжелые изменения и наихудший прогноз, по данным литературы, имеет ОИП [2, 11], что, по нашим данным, можно объяснить развитием повреждения во всех зонах НСК в паренхиме легкого с глубоким некрозом и разрушением базальных мембран. Участие стволовых клеток в процессе повреждения и воспаления подтверждается при ОИП появлением миофибробластических фокусов, описанных в литературе [3, 4]. Менее тяжелые и не столь распространенные поражения зон НСК были отмечены и при других вариантах ИИП. КОП с ОБ и НСИП, которые отличаются, по данным литературы, более благоприятным прогнозом по сравнению с ОИП [2], морфологически характеризуются повреждением с сохранением базальных мембран и зон НСК, как БАПЗ и ЗСА, без появления миофибробластических фокусов. ДИП характеризуется вовлечением в процесс ЗСА и участием в процессах репарации МФБ. Эти факты позволили определить роль повреждения НСК в патогенезе ИИП (рис. 5)

Рисунок 5. Роль повреждения НСК в патогенезе ИИП.
. Вероятно, повреждение легочной ткани при ИИП развивается под воздействием на респираторные отделы легкого неустановленного этиологического фактора, вызывающего инициальное повреждение, и гиперактивированных клеток воспалительного инфильтрата, прежде всего макрофагов, МФБ и ФБ, способных генерировать факторы агрессии (факторы, вызывающие апоптоз и/или некроз), разрушающие ткани [4, 5]. В результате в ответ на персистирующее повреждение развивается хроническое воспаление, репаративная и патологическая регенерация с выходом в интерстициальный склероз (см. рис. 5).

Таким образом, развитие ИИП связано с разной степенью разрушения или сохранности НСК ацинуса и некрозом и апоптозом КК и Пн2п, разрушение базальных мембран, что потенцирует ангиогенез, активацию мезенхимальных клеток с миофибробластической дифференцировкой и выработку ММР, а ММР в свою очередь оказывают вторичное повреждающее действие. Некроз и апоптоз эндотелиоцитов капилляров с образованием тромбов и кровоизлияниями приводят к появлению ишемического фактора, который в свою очередь потенцирует и ангиогенез и запускает порочный круг повреждений за счет экспрессии ММР. Одновременно ишемия и сама оказывает повреждающее действие, вторично разрушая НСК. Полученные результаты позволяют утверждать, что особенности клинического течения и выраженность морфологических изменений при ИИП легких непосредственно зависят от тяжести и глубины повреждения зон НСК респираторного ацинуса.

Выводы

1. Сравнительный анализ вариантов ИИП показывает, что заболевания входящие в эту группу, отличаются локализацией и выраженностью инициального и вторичного повреждения респираторного ацинуса, обусловленными степенью агрессивности воспалительного инфильтрата и распространенностью повреждения на различные зоны НСК, участвующие в регенерации легочной ткани.

2. ОИП отличается от других ИИП более глубоким повреждением ниш стволовых клеток на всех уровнях респираторных отделов легкого, которое распространяется и на БАПЗ, и на ЗСА, и на микрососуды, и сопровождалось разрушением базальных мембран всего респираторного ацинуса, выраженным апоптозом эпителиоцитов и высоким уровнем экспрессии металлопротеаз. При этом, судя по данным корреляционного анализа экспрессии маркеров повреждения и воспаления, в развитии первичного и вторичного повреждения играют ключевую роль такие клетки, как АМФ, МФБ и ФБ.

3. ДИП и КОП с ОБ отличаются от ОИП меньшей глубиной и распространенностью повреждения в респираторных отделах легких.

a. При ДИП по сравнению с ОИП преимущественно страдают ЗСА с вовлечением в процесс повреждения Пн2п и разрушения альвеолярных базальных мембран в ЗСА с меньшей степенью активности апоптоза и металлопротеаз и практически интактная БАПЗ. Корреляционный анализ показывает, что ключевую роль в процессе повреждении и воспаления, так же как и при ОИП, принадлежит АМФ, МФБ и ФБ.

б. При КОП с ОБ экссудативное воспаление развивается преимущественно на уровне респираторных бронхиол с экссудацией и организацией экссудата в просветах бронхиол и прилегающих альвеол. Базальные мембраны при этом остаются сохранными, что предотвращает повреждение таких НСК, как БАПЗ и ЗСА. Прямые корреляционные связи уровней экспрессии маркеров повреждения и воспаления делают АМФ и КК (БЭ) ключевыми структурами в процессе повреждения и воспаления при КОП с ОБ.

4. НСИП характеризуется повреждением микрососудов легочного интерстиция с вторичным вовлечением эпителиоцитов, с сохранными базальными мембранами, мелкими очагами фибриноидного некроза и низким уровнем апоптоза и экспрессией металлопротеаз. Ключевой клеткой повреждения остается АМФ.

5. Мезенхимальные клетки с миофибробластической дифференцировкой можно считать маркерными клетками глубокого повреждения НСК, цитогенетически связанными с мезенхимальной стволовой клеткой, что подтверждается экспрессией Oct-4, Vimentin, CD117, CD34.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.А.Д., Е.А.К., В.С.П.

Сбор и обработка материала: С.А.Д., Е.А.К.

Статистическая обработка данных: С.А.Д.

Написание текста: С.А.Д., Е.А.К., В.С.П.

Редактирование: Е.А.К., В.С.П.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail