Прошедшая эпидемия высокопатогенного гриппа A/H1N1 вновь подтвердила особую значимость проблемы острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) — непосредственной причины летальных исходов [1, 2]. Несмотря на достижения современной реаниматологии, многие вопросы патогенеза и как следствие лечения синдрома остаются открытыми, делая фундаментальные исследования в этом направлении особенно актуальными [3, 4].

Причины ОРДС подразделяют на две группы: легочные (пневмония, аспирация жидкостей, ингаляция токсичных веществ и др.) и внелегочные (сепсис, шок, политравма и др.), при этом изучаются различия в механизмах развития и исходах форм синдрома [3—5]. В последние годы выделяют раннюю, трудно диагностируемую стадию ОРДС — острое повреждение легких (ОПЛ). Пусковым звеном патогенеза внелегочного ОПЛ/ОРДС считается повреждающее действие на эндотелий капилляров органа медиаторов системной воспалительной реакции с инициацией диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС). А ключевым событием развития легочной формы синдрома является альтерация альвеолярного эпителия, ведущая к увеличению проницаемости аэрогематического барьера, и только затем — стимуляция эндотелия с развитием ДВС [3, 4].

На наш взгляд, есть все основания считать представленную точку зрения на патогенез легочного ОПЛ/ОРДС в отношении развития ДВС-синдрома спорной. В последние годы расширен список клеточных элементов, способных экспрессировать тканевый фактор (tissue factor — TF) и инициировать процесс свертывания крови: это не только макрофаги и элементы сосудистой стенки (активированный эндотелий, гладкомышечные клетки, фибробласты), но и тромбоциты, нейтрофилы, альвеолярный и бронхиальный эпителии [6—11]. Наши предыдущие исследования показали, что уже на ранних этапах развития ОПЛ/ОРДС при гриппозной пневмонии в крови увеличивается содержание ингибитора пути TF (TFPI) [12], что может происходить только в ответ на увеличение экспрессии TF [6, 13]. В связи с этим целью работы явилось изучение экспрессии TF клетками легких в зависимости от фазы развития ОПЛ/ОРДС, осложнившего течение гриппозной пневмонии.

В исследовании были использованы парафиновые блоки секционного материала 35 умерших больных во время эпидемии гриппа A/H1N1 2009—2010 гг. в Забайкальском крае. Среди них были 16 мужчин и 19 женщин в возрасте от 18 до 45 лет. У всех больных диагноз гриппа A/H1N1 был дополнительно подтвержден посмертно путем обнаружения в образцах тканей антигенов вируса методом полимеразной цепной реакции. Анализировали протоколы патологоанатомических исследований и патологоанатомические диагнозы аутопсий, учитывали наличие сочетанной, фоновой и сопутствующей патологии. Вирусная пневмония была выявлена у 26 (74%) человек, вирусно-бактериальная — у 9 (26%), во всех случаях были обнаружены патоморфологические маркеры ОРДС. Наиболее частой причиной коинфекции являлся Staphylococcus aureus [3]. Умершие были разделены на 3 группы: 1-я (n=10) — имеющие морфологические маркеры экссудативной (острой) стадии ОРДС; 2-я (n=16) — критерии пролиферативной (подострой) фазы; в паренхиме легких больных 3-й группы (n=9) были выявлены начальные признаки фибротической стадии [3].

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах легочной паренхимы иммунопероксидазным методом по общепринятой методике. Для демаскировки антигена проводили двукратную обработку срезов в микроволновом режиме при мощности 650 Вт в течение 15 мин с интервалом 4 мин между процедурами для охлаждения в цитратном буфере с pH 6,0 («Dako», Дания). В качестве первичных использовали мышиные моноклональные антитела к TF человека, клон TF9-10H10 («Santa Cruz biotechnology», США), в рабочем разведении 1:500. В качестве вторичных применяли биотинилированные козьи антимышиные антитела в составе рекомендованной производителем системы визуализации LSAB Staining System («Santa Cruz biotechnology», США), использующей хромоген 3,3-диаминобензидина тетрахлорид. Дополнительную докраску срезов проводили водным раствором гематоксилина Гаррисона. Использовали рекомендованные контрольные срезы: без первичных антител для исключения неспецифического окрашивания; в качестве положительного контроля — фрагмент дна глазного яблока умершего больного с декомпенсированным сахарным диабетом 1-го типа, осложненным в том числе пролиферативной ретинопатией.

Величину экспрессии TF в срезе определяли для всех продуцирующих клеток раздельно: при 400-кратном увеличении проводили подсчет не менее 100 целевых клеточных элементов в 10 случайно выбранных полях зрения.

В каждом поле количественную оценку экспрессии антигена проводили в баллах по следующей шкале: отрицательный уровень — позитивных клеток менее 10% в поле зрения; 1 балл — 10—25% клеток; 2 балла — 25—50% клеток; 3 балла — 50—75% клеток; 4 балла — в случае окрашивания более 75% клеток [14].

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ Biostat 3.03. При сравнении групп использовали критерий χ², различия считали значимыми при р<0,05. Результаты представлены в виде процента полей зрения с соответствующим уровнем экспрессии антигена по отношению к исследованному числу полей в срезе.

В 1-й группе при наступлении летального исхода на 1—3-и сутки от начала заболевания (5 наблюдений) в паренхиме легких развивался комплекс морфологических изменений в виде неравномерно выраженного острого диффузного десквамативно-макрофагального альвеолита. Максимально был выражен интерстициальный компонент отека легочной паренхимы, также отмечался диффузный, но неравномерный альвеолярный отек. В просвете альвеол отечная жидкость содержала значительное количество белка, наблюдались клетки системы мононуклеарных фагоцитов, десквамированные альвеолоциты, нейтрофилы и эритроциты. В мелких бронхах и бронхиолах, помимо комплекса воспалительных изменений и множественных зон десквамации, отмечалась трансформация мерцательного эпителия: клетки рыхлого эпителиального пласта с беспорядочно расположенными элементами принимали оплывшую форму. На поверхности слизистых оболочек наблюдались наложения фибриновых пленок и слизи с эритроцитарно-лейкоцитарной примесью. В сосудах микроциркуляторного русла встречались тромбы различных сроков давности, но значительно чаще — агрегация и сладжирование форменных элементов крови. У умерших на 5—7-е сутки от начала заболевания (5 случаев) дополнительно фиксировались гиалиновые мембраны. Преимущественно с данного срока регистрировались патологические изменения, характерные для присоединения вторичной инфекции: формирование гнойно-геморрагической пневмонии нередко с фокусами микроабсцедирования. В этой стадии наибольшая экспрессия TF отмечалась в эндотелиоцитах. В равной степени, но менее активно гликопротеин экспрессировали нейтрофилы, бронхиальный эпителий и альвеолоциты 2-го типа. Одинаково слабо экспрессировали TF макрофаги и клетки метаплазированного эпителия. В альвеолоцитах 1-го типа этот прокоагулянт обнаружен не был (рис. 1; табл. 1).

У пациентов 2-й группы летальный исход наступал преимущественно на 9—11-е сутки заболевания. В легких умерших, помимо отека, отмечались инфильтрация паренхимы нейтрофилами и макрофагами, признаки повреждения аэрогематического барьера, одномоментные организация и лизис гиалиновых мембран. Кроме того, регистрировалась пролиферация сохранившихся альвеолоцитов 2-го типа с их гиперплазией. По мере разрешения отека и развития репаративных процессов появлялись признаки дифференцировки больших альвеолоцитов в клетки 1-го типа. В просвете альвеол, помимо клеток воспалительного ряда и десквамированного эпителия, выявлялись отдельные 2—3-ядерные элементы. В зонах перехода терминальных бронхиол в альвеолы регистрировались небольшие подушкообразные разрастания из нескольких слоев уплощенных клеток недифференцированного эпителия. На этом фоне TF обнаруживался в тех же клетках, что и в предыдущей стадии синдрома. Самая высокая экспрессия TF по-прежнему была в эндотелии. Слабее всех гликопротеин экспрессировался в бронхиальном и метаплазированном эпителии (рис. 2;табл. 2).

Пациенты 3-й группы умерли на 14—16-е сутки от начала заболевания. Микроскопически в паренхиме легких у них фиксировались начавшиеся процессы фиброзирования с деформацией и нарушением архитектоники значительной части ацинусов, формированием множественных эмфизематозных зон, а также признаки модификации микроциркулярного русла. В интерстиции фиксировались небольшие зоны скопления фибро- и миофибробластов, воспалительный инфильтрат сокращался в размере и приобретал лимфоцитарно-макрофагальный характер. Сосуды за счет утолщения миоинтимальных слоев приобретали извитую форму. В этой стадии активнее остальных TF экспрессировали эндотелий, нейтрофилы и макрофаги (рис. 3; табл. 3).

При сопоставлении уровня экспрессии TF клетками в зависимости от стадии ОРДС динамика отмечена только в макрофагах (р=0,01) и эндотелиоцитах (р=0,006). В макрофагах в пролиферативной стадии отмечали увеличение экспрессии фактора (р=0,009), который сохранялся на этом уровне и в начале фибротической фазы (р=0,62).

В эндотелии во 2-й стадии происходило увеличение экспрессии TF (р=0,000), при развитии фиброза она уменьшалась (р=0,000) и становилась ниже, чем в экссудативной фазе процесса (р=0,024).

Известно, что экссудативная стадия ОРДС (собственно ОПЛ) при адекватной терапии является потенциально обратимой [3]. В этой фазе нами была зафиксирована достаточно высокая экспрессия ТF всеми клетками, но первенство принадлежало эндотелию, несмотря на то что ОПЛ/ОРДС развился вследствие легочных причин. Значимый вклад в локальное повышение концентрации TF вносили клетки альвеолярного и бронхиального эпителия, а также нейтрофилы. В последние годы наличие TF в полиморфно-ядерных лейкоцитах не вызывает сомнений, однако обсуждается его происхождение [6, 8, 9, 11, 15]. Триггерным звеном развития ОПЛ являются выраженная адгезия нейтрофилов к эндотелию сосудов малого круга кровообращения и инфильтрация ими паренхимы легких, а также выход в просвет альвеол [3, 8, 16]. Поэтому независимо от генеза в них TF нейтрофильные гранулоциты вносят весомый вклад в локальное повышение концентрации гликопротеина и потенциальную активацию внешнего пути свертывания крови. Обратимость ОПЛ доказывает, что тромбогенная направленность сдвига гемостаза в легких в этот момент необходима для изоляции инфекционного патогена и отграничения воспалительного процесса.

Пролиферативная стадия ОРДС характеризуется развитием структурных повреждений аэрогематического барьера. Есть данные, что в ответ на экспрессию TF при дистресс-синдроме альвеолярный эпителий способен лишь увеличивать секрецию (но не синтез) TFPI, в итоге местная концентрация ингибитора становится относительно недостаточной [17]. В этой фазе синдрома нами была зафиксирована самая высокая локальная экспрессия TF (за счет прироста в эндотелиоцитах и макрофагах), что, безусловно, вносит дополнительный вклад в смещение равновесия в системе и запуск каскада образования фибрина внутри альвеол.

Тромбин, образующийся на месте экспрессии TF, важен не только для гемостаза, он одновременно стимулирует такие клеточные функции, как хемотаксис и митогенез, является необходимым для восстановительных или репаративных процессов [6, 13]. Зафиксированная нами в 3-й стадии ОРДС экспрессия TF клеточными элементами легких, безусловно, вносит свой вклад в развитие фиброза органа.

1. При ОПЛ/ОРДС на фоне гриппозной пневмонии при всех стадиях процесса наибольшей является экспрессия TF в эндотелии сосудов легких.

2. Самая высокая локальная экспрессия TF наблюдается в пролиферативной стадии ОРДС.

3. Значительный вклад в локальное повышение концентрации TF вносят нейтрофилы и альвеолоциты 2-го типа.