Олюшина Е.М.

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Бяхова М.М.

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России; ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Завалишина Л.Э.

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

Андреева Ю.Ю.

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

Семенова А.Б.

ГБУЗ города Москвы «Городская клиническая онкологическая больница №1 ДЗМ»

Франк Г.А.

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования»

Роль иммуногистохимического маркера p40 при дифференциальной диагностике аденокарциномы и плоскоклеточного неороговевающего рака легкого

Журнал: Архив патологии. 2020;82(5): 50-56

Просмотров : 899

Загрузок : 8

Как цитировать

Олюшина Е.М., Бяхова М.М., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Семенова А.Б., Франк Г.А. Роль иммуногистохимического маркера p40 при дифференциальной диагностике аденокарциномы и плоскоклеточного неороговевающего рака легкого. Архив патологии. 2020;82(5):50-56.
Olyushina EM, Byakhova MM, Zavalishina LE, Andreeva YuYu, Semenova AB, Frank GA. The role of the immunohistochemical marker p40 in the differential diagnosis of adenocarcinoma and nonkeratinizing squamous cell cancer of the lung. Arkhiv Patologii. 2020;82(5):50-56.
https://doi.org/10.17116/patol20208205150

Авторы:

Олюшина Е.М.

ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Все авторы (6)

Рак легкого (РЛ) — одна их основных причин смерти от онкологических заболеваний. Это гетерогенная группа злокачественных новообразований, лечебная тактика при которых напрямую зависит от морфологии и генетических характеристик опухоли [1—3]. Молекулярно-генетическое тестирование активирующих мутаций EGFR (19-й и 21-й экзоны) и транслокаций ALK и ROS1 входит в диагностический алгоритм обследования пациента с верифицированной аденокарциномой или аденоплоскоклеточным раком [4, 5]. Это связано с появлением таргетных препаратов, направленных на ингибирование рецепторных тирозинкиназ EGFR, ALK и ROS1, положительный ответ на лечение данными препаратами зависит от наличия в опухоли указанных генетических нарушений, служащих молекулярными мишенями для направленной терапии и встречающихся преимущественно в железистых карциномах [2, 3]. При исключительно плоскоклеточной дифференцировке в карциноме легкого целесообразно проведение иммуногистохимического (ИГХ) исследования уровня экспрессии PD-L1 для уточнения возможности назначения данному пациенту иммунотерапии. Также, говоря о плоскоклеточном раке, необходимо помнить об особой когорте пациентов, характеризирующихся следующими признаками: молодой возраст, преимущественно женский пол, некурящие или имеющие малый стаж курения в анамнезе, периферическое расположение опухоли. Учитывая описанные клинические особенности плоскоклеточного РЛ в данных случаях, первичное молекулярно-генетическое исследование целесообразнее, чем определение PD-L1-статуса.

Таким образом, своевременность и точность патоморфологической диагностики аденогенных и плоскоклеточных карцином легкого приобретают особое значение, так как в зависимости от поставленного морфологом диагноза зависит дальнейшее обследование и лечение пациента.

Однако при дифференциальной диагностике аденокарциномы и плоскоклеточного РЛ патологоанатом может столкнуться со значительными трудностями, особенно при работе с биопсийным материалом. Солидные аденокарциномы могут демонстрировать плотную эозинофильную цитоплазму, имитируя плоскоклеточную карциному. В низкодифференцированных плоскоклеточных раках, как правило, отсутствуют диагностические морфологические плоскоклеточные признаки, такие как кератинизация, роговые жемчужины и межклеточные мостики [6].

Для правильной верификации таких опухолей, если количество материала это позволяет, необходимо проводить дополнительное ИГХ-исследование с использованием как плоскоклеточных маркеров, так и маркеров пневмоцитов. Наиболее часто применяемые маркеры при РЛ — это p40, p63, CK5/6, TTF1, CK7.

Однако следует отметить, что положительная экспрессия TTF1 наблюдается примерно в 75% аденокарцином легкого, но данный маркер также экспрессируется и в других опухолях легкого, таких как мелкоклеточный и крупноклеточный нейроэндокринный рак, в части карциноидов и в редких случаях фокально — в неороговевающей плоскоклеточной карциноме [6, 7]. Также необходимо иметь в виду, что в солидных аденокарциномах экспрессия TTF1 встречается реже, чем в аденокарциномах стелющегося и папиллярного типа [6].

Среди плоскоклеточных маркеров необходимо выделить p40 и p63.

Ген TP63 (белок p63), расположенный на хромосоме 3q27—29, содержит 15 экзонов и является гомологом гена-супрессора опухолевого роста TP53 (белок р53), кроме того, ген TP63 содержит те же «горячие точки» для мутаций, играющих роль в онкогенезе, что и ген TP53. Физиологическая роль p63 заключается в контроле пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток-предшественников.

TP63 содержит два промотора, кодирующих два класса белков путем альтернативного сплайсинга: TAp63, содержащий домен трансактивации, и ΔNp63 (р40), в котором данный домен отсутствует. Как TAp63, так и ΔNp63 демонстрируют перекрывающееся распределение в эпителиальных тканях. Однако если экспрессия TAp63 более характерна для дифференцированных клеток, то ΔNp63 наблюдается в популяциях стволовых клеток. Оба белка (ΔNp63 и TAp63) экспрессируются в немелкоклеточном РЛ, однако ΔNp63α — достоверно преобладающая изоформа, экспрессируемая в плоскоклеточной карциноме легкого [8, 9].

Анти-р63 широко известен как ИГХ-маркер плоскоклеточного РЛ; несмотря на высокую чувствительность, связанную с тем, что антитела к p63 распознают как белок p63, так и p40, он не обладает достаточной специфичностью [7]. Белок p63 экспрессируется в 30% аденокарцином легкого [6—9] и также может выявляться в нейроэндокринных РЛ, особенно в тех, что обладают крупноклеточной морфологией. Интерпретация результатов ИГХ-исследования с использованием p63 зависит от экспрессии TTF1, поскольку только диффузное окрашивание p63 при отсутствии TTF1 свидетельствует в пользу диагноза «плоскоклеточный рак». В ряде случаев ИГХ-панель, включающая только два маркера (p63 и TTF1), может оказаться недостаточной для подтверждения плоскоклеточного рака, в таких случаях приходится прибегать к использованию дополнительных маркеров плоскоклеточной дифференцировки, что ставит под угрозу сохранение тканей для последующих исследований [8].

Несмотря на то что антитело р40, идентифицирующее наличие белка ΔNp63, сравнительно недавно стали применять для дифференциальной диагностики плоскоклеточного РЛ и аденокарциномы, ряд исследований, проведенных различными авторами, подтвердил, что p40 обладает достаточно высокой специфичностью и чувствительностью [8]. В настоящее время белок p40 признан наиболее спе-цифичным маркером плоскоклеточной дифференцировки и рекомендован для включения в ИГХ-панель при проведении дифференциального диагноза между плоскоклеточными и аденогенными карциномами легкого.

Материал и методы

Материалом для исследования послужили 50 образцов операционного и биопсийного материала РЛ, предоставленные кафедрой патологической анатомии РМАНПО за период с 2015 по 2020 г. Образцы РЛ фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной технологии. Информация о пациентах получена из компьютеризированной системы медицинских карт. Идентификация пациентов оставалась анонимной, и каждый случай был закодирован соответствующим образом. Выборка произведена случайным образом, критериями отбора были: достаточный объем материала, гистологические варианты опухоли — аденокарциномы солидного типа строения (10 случаев) и плоскоклеточные неороговевающие раки (40). Все опухоли имели низкую степень дифференцировки — G3. Неинвазивные формы рака, а также аденоплоскоклеточные карциномы в исследование не включались. В 49 случаях это были первичные опухоли, в 1 случае — метастаз в надключичном лимфатическом узле. Микропрепараты, окрашенные гематоксилином и эозином, оценены двумя патологами согласно классификации ВОЗ 2015 г. для подтверждения диагноза.

В исследовании использовали следующие первичные антитела VENTANA: мышиные моноклональные антитела anti-p40 (BC28); мышиные моноклональные антитела anti-p63 (4A4); мышиные моноклональные антитела anti-Cytokeratin 5/6 (D5/16B4); кроличьи моноклональные антитела CONFIRM anti-Cytokeratin 7 (SP52); мышиные моноклональные антитела CONFIRM anti-Thyroid Transcription Factor-1 (8G7G3/1).

Для первичного антитела anti-p40 (BC28) использован рекомендуемый производителем протокол окрашивания с системой детекции OptiView DAB IHC Detection Kit на приборе BenchMark ULTRA: депарафинирование образца, демаскировка антигена с помощью Cell Conditioning 1 — 32 мин, предварительная обработка ингибитором пероксидазы, инкубация первичного антитела в BenchMark ULTRA — 16 мин при 36°C, HQ linker OptiView — 8 мин, OptiView HRP Multimer — 8 мин, дополнительное окрашивание Hematoxylin II — 4 мин, контрастное окрашивание Bluing — 4 мин. С каждого образца опухоли делали по 2 среза: один — для нанесения первичных антител, второй — для негативного контроля, в качестве внешнего позитивного контроля использовали ткань плоскоклеточной карциномы легкого.

Для первичных антител CONFIRM anti-Thyroid Transcription Factor-1 (8G7G3/1), anti-p63 (4A4), anti-Cytokeratin 5/6 (D5/16B4), CONFIRM anti-Cytokeratin 7 (SP52) использовали стандартный протокол с системой детекции UltraView DAB IHC Detection Kit (VENTANA). С каждого образца опухоли делали по 2 среза: один — для нанесения первичных антител, второй — для негативного контроля, в качестве внешнего позитивного контроля использовали для anti-p63 (4A4), anti-Cytokeratin 5/6 (D5/16B4) — ткань миндалины, для CONFIRM anti-Cytokeratin 7 (SP52) — ткань легкого. Срезы внутрилабораторного позитивного контроля наносили на стекла с изучаемыми образцами.

Результаты и обсуждение

Экспрессия p40 и p63 наблюдалась во всех случаях плоскоклеточного неороговевающего рака и отсутствовала во всех случаях аденокарциномы. ИГХ-реакция с p40 отличалась диффузным характером и выраженной интенсивностью, тогда как реакция с p63 в 8 случаях имела фокальный характер окрашивания умеренной и слабой интенсивности.

CK5/6 в плоскоклеточном неороговевающем раке продемонстрировал положительную экспрессию в 39 случаях, в 1 случае выявлена фокальная экспрессия слабой интенсивности, в 1 случае экспрессия отсутствовала. Во всех аденокарциномах ИГХ-реакция с данным маркером была отрицательная.

CK7 экспрессировался во всех случаях аденокарцином, также наблюдалась умеренная диффузная экспрессия данного маркера в 1 случае плоскоклеточного неороговевающего рака, при этом экспрессия TTF1 отсутствовала.

Экспрессия TTF1 отмечена во всех аденокарциномах и не определялась в опухолевых клетках плоскоклеточных неороговевающих карцином, однако присутствовала в пневмоцитах окружающей ткани (внутренний позитивный контроль) (рис. 1—4).

Рис. 1. Результаты исследования экспрессии p40, p63, CK5/6, CK7 и TTF1 ИГХ-методом.

Рис. 2. Метастаз аденокарциномы легкого солидного строения в надключичном лимфатическом узле, G3. Результаты ИГХ-исследования.

а — аденокарцинома легкого солидного строения, G3. Окраска гематоксилином и эозином; б—е — ИГХ-реакции с антителами к CK5/6, p40, p63, CK7, TTF1; б — отсутствие экспрессии CK5/6 в клетках опухоли; в — отсутствие экспрессии p40 в клетках опухоли; г — отсутствие экспрессии p63 в клетках опухоли, артифициальное фоновое окрашивание; д — выраженная диффузная экспрессия CK7 в клетках опухоли; е — экспрессия различной интенсивности (от слабой до выраженной) TTF1 в клетках опухоли. а—е — ×200.

Рис. 3. Плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3.

Результаты ИГХ-исследования. Отсутствие экспрессии CK7 в клетках опухоли.

а — плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3. Окраска гематоксилином и эозином; б—е — ИГХ-реакции с антителами к CK5/6, p40, p63, CK7, TTF1; б — выраженная диффузная экспрессия CK5/6 в клетках опухоли; в — выраженная диффузная экспрессия p40 в клетках опухоли; г — умеренно выраженная фокальная экспрессия p63 в клетках опухоли; д — отсутствие экспрессии CK7 в клетках опухоли; е — отсутствие экспрессии TTF1 в клетках опухоли. а—е — ×200.

Рис. 4. Плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3.

Результаты ИГХ-исследования. Наличие экспрессии CK7 в клетках опухоли.

а — плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, G3. Окраска гематоксилином и эозином; б—е — ИГХ-реакции с антителами к CK5/6, p40, p63, CK7, TTF1; б — выраженная диффузная экспрессия CK5/6 в клетках опухоли; в — выраженная диффузная экспрессия p40 в клетках опухоли; г — умеренно и слабо выраженная экспрессия p63 в клетках опухоли; д — умеренная диффузная экспрессия CK7 в клетках опухоли; е — отсутствие экспрессии TTF1 в клетках опухоли. а—е — ×200.

Заключение

Резюмируя полученные результаты, необходимо отметить, что в нашем исследовании маркер p40 показал более высокую специфичность по сравнению с другим маркером плоскоклеточной дифференцировки — p63, это подтверждает данные, что для верификации плоскоклеточной карциномы легкого целесообразно использовать маркер p40. При наличии ограниченного объема материала для проведения дифференциальной диагностики между аденокарциномой и плоскоклеточным раком легкого ИГХ-методом оптимальное решение — ограничить ИГХ-панель до двух маркеров — p40 и TTF1. Это позволяет достоверно определить вариант рака и сохранить достаточное количество материала для генетического исследования.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail