Ботиралиева Г.К.

ООО «Ipsum Pathology»

Шарлай А.С.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Рощин В.Ю.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Сидоров И.В.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Коновалов Д.М.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Рабдомиосаркомы: структурное распределение и анализ иммуногистохимического профиля

Журнал: Архив патологии. 2020;82(5): 33-41

Просмотров : 549

Загрузок : 4

Как цитировать

Ботиралиева Г.К., Шарлай А.С., Рощин В.Ю., Сидоров И.В., Коновалов Д.М. Рабдомиосаркомы: структурное распределение и анализ иммуногистохимического профиля. Архив патологии. 2020;82(5):33-41.
Botiralieva GK, Sharlai AS, Roshchin VYu, Sidorov IV, Konovalov DM. Rhabdomyosarcomas: structural distribution and analysis of an immunohistochemical profile. Arkhiv Patologii. 2020;82(5):33-41.
https://doi.org/10.17116/patol20208205133

Авторы:

Ботиралиева Г.К.

ООО «Ipsum Pathology»

Все авторы (5)

Рабдомиосаркома (РМС) — наиболее распространенная солидная опухоль у детей [1]. РМС составляет 45—60% среди мягкотканных сарком и 5—10% среди всех солидных опухолей у детей [2]. Гистологическая диагностика базируется на данных, полученных при морфологическом, иммуногистохимическом и ультраструктурном исследовании биоптата опухоли [3]. В настоящий момент существует несколько классификаций РМС, но наиболее используемой является классификация ВОЗ, которая включает эмбриональную (ЭРМС), альвеолярную (АРМС), веретеноклеточную/склерозирующую (ВРМС) и плеоморфную (ПРМС) [4, 5]. В 2011 г. группа исследователей описала эпителиоидную рабдомиосаркому (ЭпРМС), которая в настоящее время не включена в классификацию ВОЗ, но рассматривается специалистами как отдельная единица [6, 7]. Кроме того, в 2019 г. была описана новая внутрикостная РМС, для которой характерна аномальная транслокация EWSR1/FUS-TFCP2 [8].

Каждая из РМС определяется как самостоятельная нозологическая форма с индивидуальными особенностями гистологического строения, вариантами иммунофенотипа, генетическими основами и, что является важным следствием, различным клиническим течением и прогнозом [9].

Корректная диагностика РМС требует применения широкого спектра методик, включая иммуногистохимические и генетические исследования (FISH, PCR), однако классические гистологические исследования информативны до определенной степени и недостаточны. Долгое время традиционными маркерами для иммуногистохимической идентификации РМС являлись общие маркеры мезенхимальной дифференцировки и маркеры, ассоциированные с промежуточными филаментами мышечной ткани, — виментин, мышечно-специфический актин (MSA, muscle specific actin), Myosin и Myoglobin. [10, 11]. В то же время эти маркеры не обладают необходимой специфичностью для РМС в связи с присутствием данных белков в ряде иных опухолей. Ядерные транскрипторные факторы, участвующие в миогенезе, такие как MyoD (myf3) и Myogenin (myf4), имеют высокую чувствительность и специфичность и нашли широкое диагностическое применение относительно недавно. Практически во всех случаях РМС отмечается ядерная экспрессия миогенных транскрипторных факторов, в то время как в зрелой здоровой мышечной ткани экспрессия MyoD1 и Myogenin не обнаружена, поскольку действие этих факторов в норме ограничено событиями эмбриогенеза [12, 13].

В то же время РМС демонстрируют экспрессию маркеров, не свойственных мышечной ткани и принадлежащих к иным линиям дифференцировки, что может быть связано с дивергентностью дифференцировки опухолевой ткани [14—17].

Цель работы — качественная и количественная оценка экспрессии транскрипторных миогенных факторов на большой выборке случаев РМС, выявление потенциальных фенотипических различий у разных РМС, а также оценка распространенности и частоты встречаемости аберрантных маркеров, в частности ALK, PAX5, WT1, PCK, CAM5.2, SIX1 и Synaptophysin, в тканях РМС.

Материал и методы

Проведен ретроспективный анализ данных пациентов, у которых за период с 2013 по 2019 г. был верифицирован диагноз рабдомиосаркомы.

На основании полученных сопроводительных документов и результатов исследования микроскопических препаратов из архива отделения были отобраны 250 парафиновых блоков материала, поступившего от пациентов с РМС. Вместе с парафиновыми блоками для каждого случая проведен подбор гистологических стекол, окрашенных гематоксилином и эозином. Диагноз РМС и ее вариант как критерий отбора в исследование повторно определяли три специалиста независимо друг от друга. Отбор архивного материала осуществлялся в соответствии с требованиями этического комитета учреждения и информированным добровольным согласием на исследование пациентов или их представителей. Всего в исследование включены 202 образца опухолевой ткани, 48 образцов исключены из выборки по техническим или иным причинам. Подготовку к микродиссекции опухолевого материала из парафиновых блоков проводили под контролем среза, окрашенного гематоксилином и эозином.

Из полученного объема материала собраны 5 мультиблоков (tissue microarray) для проведения последующих исследований. Материал в блоках картирован с использованием заведомо чужеродных контролей.

Техническую часть исследования осуществляли с помощью EverBio AutoTiss 10C (EverBio Technology Inc., Тайвань), автоматизированной системы для создания тканевых матриц (ТМА) на блоках-реципиентах. Диаметр используемого панча (core) — 2 мм. На полученных серийных срезах ТМА проводили иммуногистохимическое исследование экспрессии Myogenin, MyoD1, ALK (с использованием клонов антител D5F3 и p80), PAX5, WT1, PCK, Synaptophysin, CAM5.2, SIX1.

Интенсивность иммуногистохимических реакций с антигенами ALK (D5F3 и p80), PAX5, WT1, PCK, Synaptophysin, CAM5.2, SIX1 оценивали качественным способом (наличие/отсутствие реакции).

Результаты иммуногистохимической реакции с антителами к транскрипционным факторам Myogenin и MyoD1 оценивали по балльной шкале от 0 до 3, учитывая выраженность ядерной реакции: 0 — отсутствие реакции (0% клеток с позитивной реакцией), 1 — слабая реакция (менее 30% экспрессирующих клеток), 2 — умеренная реакция (30—70% экспрессирующих клеток), 3 — сильная реакция (более 70% экспрессирующих клеток). Также осуществлен анализ экспрессии Myogenin и MyoD1 с помощью программного обеспечения Aperio ImageScope 12.3.3 (Leica Biosystems, США). Алгоритм анализа продемонстрирован на рис. 1.

Рис. 1. Алгоритм анализа экспрессии миогенных транскрипторных факторов (на примере Myogenin).

а — общий вид среза исследуемой ТМА-матрицы, окраска гематоксилином и эозином, ×20; б, в — выделение области интереса, б — ×200, в — ×400; г, д — анализ экспрессии Myogenin в клеточных ядрах с применением математического алгоритма Nuclear v9, г — ×200, д — ×400.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного пакета Statistica 13.0. (StatSoft, Россия). При сравнении исследуемых групп по категориальным признакам использовали критерий χ2 Пирсона. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Клинико-патологическая характеристика пациентов с РМС, включенных в исследование, приведена в табл. 1. РМС была диагностирована у 88 лиц женского пола и у 114 лиц мужского пола в возрасте от 16 дней до 18 лет (медиана возраста составила 5,6 года). В группу исследования вошли 10 детей в возрасте до 1 года, 190 детей в возрасте от 1 года до 18 лет и 2 взрослых пациента (32 и 44 года). Наиболее часто первичная опухоль локализовывалась в области головы и шеи (у 69 пациентов), в урогенитальном тракте (у 44 пациентов), в мягких тканях нижних и верхних конечностей опухоль располагалась у 22 и 16 пациентов соответственно. Другие анатомические области (туловище, грудная клетка, брюшная полость, забрюшинное пространство и таз) были вовлечены реже. У 7 пациентов опухоль затрагивала несколько анатомических областей, а у 11 пациентов локализация опухоли была неизвестна.

Таблица 1. Клинико-патологическая характеристика пациентов с РМС

Характеристика

Количество пациентов, абс. (%)

Возраст, годы:

младше 1 года

10 (5)

1—18

190 (94)

старше 18

2 (1)

Пол:

мужской

114 (56)

женский

88 (44)

Локализация опухоли:

область головы и шеи

69 (34)

верхняя конечность

16 (8)

нижняя конечность

22 (11)

туловище

3 (2)

грудная клетка

3 (2)

забрюшинное пространство

7 (3)

область таза

8 (4)

урогенитальный тракт

44 (22)

брюшная полость

12 (6)

вовлечение нескольких анатомических областей

7 (3)

локализация неизвестна

11 (5)

Вариант РМС:

ЭРМС

103 (51)

АРМС

80 (40)

ВРМС

16 (8)

ЭпРМС

2 (1)

БДУ

1 (0)

ЭРМС была диагностирована в 103 случаях, АРМС — в 80 случаях, ВРМС обнаружена в 16 случаях, ЭпРМС — в 2 случаях. В 1 случае вследствие недостаточного количества гистологического материала не удалось точно верифицировать вариант РМС. Наиболее частая локализация ЭРМС — урогенитальный тракт (39%) и область головы и шеи (34%). АРМС в 28% случаев диагностирована в области головы и шеи, верхние и нижние конечности были затронуты в 15 и 19% случаев соответственно. Для ВРМС характерными локализациями оказались область головы и шеи (31%) и урогенитальный тракт (25%). Более подробное распределение РМС по анатомическим областям отражено в табл. 2.

Таблица 2. Локализация рабдомиосаркомы

Локализация

Количество пациентов

ЭРМС

АРМС

ВРМС

ЭпРМС

Область головы и шеи

40/103

22/80

5/16

1/2

Верхняя конечность

1/103

12/80

3/16

Нижняя конечность

6/103

15/80

1/16

Туловище

1/103

2/80

Грудная клетка

2/80

1/16

Забрюшинное пространство

6/103

1/16

Область таза

7/80

1/16

Урогенитальный тракт

35/103

6/80

4/16

Брюшная полость

9/103

3/80

Несколько анатомических областей

2/103

4/80

1/2

Локализация неизвестна

3/103

7/80

1/16

Результаты иммуногистохимических исследований приведены в табл. 3—6 и проиллюстрированы на рис. 2—6. Ввиду технических особенностей проведения исследований с применением тканевых матриц некоторое количество образцов было утрачено. Таким образом, иммуногистохимические исследования проведены на 75 образцах АРМС из 80, на 87 образцах АРМС из 103. От 0 до 2 образцов ВРМС в зависимости от исследуемого маркера были утеряны, что отражено в табл. 3—6. Для двух образцов ЭпРМС удалось исследовать экспрессию лишь миогенных транскрипторных факторов, ALK и SIX1.

Таблица 3. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии MyoD1 (myf3) в ткани РМС

Вариант РМС

Число позитивных образцов

Интенсивность реакции

1+

2+

3+

Альвеолярная (n=75)

75

32

35

8

Эмбриональная (n=87)

87

54

28

5

Веретеноклеточная/склерозирующая (n=14)

14

8

3

3

Эпителиоидная (n=1)

1

1

0

0

Таблица 4. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии Myogenin (myf4) в ткани РМС

Вариант РМС

Число позитивных образцов

Интенсивность реакции

1+

2+

3+

Альвеолярная (n=75)

75

35

35

5

Эмбриональная (n=87)

87

69

16

2

Веретеноклеточная/склерозирующая (n=15)

15

13

2

0

Эпителиоидная (n=1)

1

1

0

0

Таблица 5. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии аберрантных маркеров в ткани РМС

Вариант РМС

Количество позитивных образцов

ALK (D5F3)

ALK (p80)

PAX5

PCK

WT1

SYP

CAM5.2

SIX1

Эмбриональная

25/87

4/87

0/87

12/87

15/87

9/87

0/87

77/87

Альвеолярная

43/75

7/75

13/75

20/75

15/75

12/75

0/75

62/75

Веретеноклеточная/склерозирующая

3/14

0/14

0/14

2/14

1/14

0/14

1/14

8/14

Эпителиоидная

2/2

2/2

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

1/2

Таблица 6. Результаты исследования паттерна экспрессии ALK в ткани РМС

Вариант РМС

Количество образцов с фокальной/диффузной экспрессией

ALK (D5F3)

ALK (p80)

Эмбриональная

16/25

3/4

Альвеолярная

22/43

5/7

Веретеноклеточная/склерозирующая

1/3

Эпителиоидная

0/2

0/2

Рис. 2. Морфологическая картина различных вариантов РМС.

а—в — эмбриональная рабдомиосаркома (ЭРМС); г—е — альвеолярная рабдомиосаркома (АРМС); ж—и — веретеноклеточная/склерозирующая рабдомиосаркома (ВРМС); г—м — эпителиоидная рабдомиосаркома (ЭпРМС).

а, г, ж, к — окраска гематоксилином и эозином; б, д, з, л — экспрессия myf3; в, е, и, м — экспрессия myf4. а—м — ×400.

Рис. 3. Иммуногистохимическая картина экспрессии миогенина в ткани РМС.

ЭРМС с иммунореактивностью 1+ (а), 2+ (б) и 3+ (в); АРМС с иммунореактивностью 1+ (г), 2+ (д) и 3+ (е); ВРМС с иммунореактивностью 1+ (ж) и 2+ (з). а—з — ×600.

Рис. 4. Иммуногистохимическая картина экспрессии MyoD1 в ткани РМС.

ЭРМС с иммунореактивностью 1+ (а), 2+ (б) и 3+ (в); АРМС с иммунореактивностью 1+ (г), 2+ (д) и 3+ (е); ВРМС с иммунореактивностью 1+ (ж), 2+ (з) и 3+ (и). а—и — ×600.

Рис. 5. Иммуногистохимическая картина экспрессии ALK в ткани РМС.

а — клон D5F3, ×600; б — клон р80, ×400.

Рис. 6. Иммуногистохимическая картина экспрессии PAX5 в ткани АРМС, ×200.

Экспрессия Myogenin и MyoD1 выявлена во всех исследуемых образцах ткани РМС. Для АРМС более характерна интенсивность реакции 1+ и 2+, в то же время более 50% случаев ЭРМС, ВРМС и ЭпРМС характеризуются интенсивностью реакции на уровне 1+ (см. рис. 4 и 5).

Экспрессию ALK исследовали с применением клонов D5F3 и p80. Клон D5F3 показал более интенсивную реакцию по сравнению с клоном p80 (см. рис. 4). Помимо этого наибольшее количество случаев с позитивной реакцией также обнаружено при помощи клона D5F3: в 25 из 87 случаев ЭРМС, в 43 из 75 случаев АРМС, в 3 из 16 случаев ВРМС и во всех случаях ЭпРМС. При использовании клона p80 позитивная реакция отмечена в 4 из 87 случаев ЭРМС, в 7 из 75 случаев АРМС, во всех случаях ЭпРМС. В образцах ВРМС позитивной реакции с помощью клона p80 не выявлено. Разница чувствительности к экспрессии ALK в пользу клона D5F3 оказалась статистически значимой (p<0,05). Отмечена как диффузная, так и фокальная экспрессия ALK в ткани РМС, причем для АРМС и ЭРМС фокальный паттерн экспрессии встречался в 50% образцов или более с положительной реакцией (см. табл. 5). В ткани ВРМС фокальная экспрессия отмечена лишь в 1 случае, а в образцах ЭпРМС фокальный паттерн не обнаружен.

Экспрессия PAX5 выявлена в 13 из 75 случаев АРМС (см. рис. 6). В образцах ЭРМС, ВРМС и ЭпРМС экспрессия не отмечена.

Положительная реакция с анти-PCK определена в 12 из 87 случаев ЭРМС, в 20 из 75 случаев АРМС и в 2 из 14 образцов ВРМС. Статистически значимой разницы в экспрессии PCK между исследуемыми группами не обнаружено.

Экспрессия WT1 выявлена в 15 из 87 образцов ЭРМС, в 15 из 75 образцов АРМС и в 1 из 14 образцов ВРМС. Значимой разницы в экспрессии между группами также не было.

Позитивная реакция с антителами к Synaptophysin отмечена в 9 из 87 случаев ЭРМС и в 12 из 75 случаев АРМС. Разница в экспрессии между ЭРМС и АРМС не выявлена.

В 73% всех случаев РМС определена экспрессия SIX1: в 77 из 87 образцов ЭРМС, в 62 из 75 образцов АРМС, в 8 из 14 образов ВРМС и в 1 из 2 образцов ЭпРМС. Значимой разницы в экспрессии между вариантами РМС не обнаружено.

Экспрессия CAM5.2 выявлена лишь в 1 образце исследуемой выборки.

Обсуждение

Диагностика РМС как наиболее частой мягкотканной саркомы у детей требует тщательного дифференцированного подхода. В качестве чувствительных и специфичных маркеров РМС предложены миогенные транскрипторные регуляторные факторы, в частности Myogenin (myf4) и MyoD1 (myf3). В нашем исследовании все 202 образца имели позитивную ядерную экспрессию обоих маркеров. Причем для АРМС характерна более выраженная качественная и количественная положительная иммуногистохимическая реакция, что согласуется с опубликованными данными [18—20].

Экспрессия аберрантных маркеров наблюдалась в различном соотношении во всех случаях РМС. Это свидетельствует о том, что в определенных ситуациях, сопряженных с нетипичной гистологической картиной, вариантной локализацией и низким уровнем экспрессии миогенных транскрипторных факторов, может произойти диагностическая ошибка.

При этом корреляции между вариантом РМС и определенным аберрантным маркером не обнаружено. Показано, что исследование экспрессии ALK с помощью клона D5F3 позволяет лучше визуализировать и выявлять большее количество позитивных образцов (p<0,05).

Кроме того, для АРМС выявлена устойчивая закономерность между уровнем экспрессии ALK D5F3 и миогенных транскрипторных факторов. Во всех случаях АРМС с фокальной экспрессией ALK D5F3 наблюдался преимущественно низкий или умеренный уровень активности анти-Myogenin и анти-MyoD1.

Экспрессия маркера PAX5 при иммуногистохимическом исследовании обнаружена исключительно у пациентов с АРМС, что, вероятно, объясняется близостью расположения гена PAX5 и региона транслокационной нестабильности PAX3/7—FOXO1, приводящей к его активации [15, 21].

Экспрессия WT1 обнаружена в образцах АРМС, ЭРМС и ВРМС. В ряде публикаций такое обстоятельство рассматривается как фактор благоприятного прогноза [22, 23].

Любопытным оказался факт экспрессии маркера SIX1 в 80—95% всех случаев РМС. Транскрипторный фактор SIX1 положительно регулирует экспрессию PAX-3/7 на всех этапах развития мышечной клетки. Его значение в опухолевой ткани в настоящий момент неизвестно [24].

Несмотря на идентичность названия различных форм РМС, каждая из них нормативно, биологически, гистологически, фенотипически и клинически является самостоятельной нозологической формой. Морфологическая диагностика требует тщательной оценки всех перечисленных факторов, особенно принимая во внимание вариативность экспрессии миогенных транскрипторных факторов и высокий уровень аберрантности фенотипа.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г.К. Ботиралиева, Д.М. Коновалов

Сбор и обработка материала — Г.К. Ботиралиева, В.Ю. Рощин, И.В. Сидоров

Статистическая обработка — А.С. Шарлай

Написание текста — А.С. Шарлай, Г.К. Ботиралиева, И.В. Сидоров

Редактирование — Д.М. Коновалов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail