Демура Т.А.

Кафедра патологической анатомии им. И.М. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Коган Е.А.

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва

Занозин А.С.

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Колосовский Д.Ю.

ООО «Доктор Колосовский», Москва

Морфологический субстрат и молекулярные механизмы нарушений исходов беременности у женщин с наследственными тромбофилиями и недифференцированной дисплазией соединительной ткани

Журнал: Архив патологии. 2018;80(5): 33‑39

Просмотров : 522

Загрузок : 7

Как цитировать

Демура Т.А., Коган Е.А., Занозин А.С., Колосовский Д.Ю. Морфологический субстрат и молекулярные механизмы нарушений исходов беременности у женщин с наследственными тромбофилиями и недифференцированной дисплазией соединительной ткани. Архив патологии. 2018;80(5):33‑39.
Demura TA, Kogan EA, Zanozin AS, Kolosovsky DYu. The morphological substrate and molecular mechanisms of impaired pregnancy outcomes in women with hereditary thrombophilias and undifferentiated connective tissue dysplasia. Arkhiv Patologii. 2018;80(5):33‑39. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/patol20188005133

Авторы:

Демура Т.А.

Кафедра патологической анатомии им. И.М. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Все авторы (4)

Проблема женского бесплодия актуальна в России и мире по сей день. В структуре идиопатического женского бесплодия важную роль играют наследственные тромбофилии (НТ). Согласно определению ВОЗ и Международного общества по тромбозу и гемостазу, тромбофилия — необычная наклонность к тромбозу с началом в раннем возрасте, отягощенность семейного анамнеза, степень тяжести тромбоза, непропорциональная известному причинному фактору и эпизодам рецидивов тромбоза. Наследственные тромбофилии, согласно T. Bombeli и соавт. [1], встречаются у 9% практически здоровых пациентов и у 30% с артериальным или венозным тромбозом в анамнезе, что подтверждается данными M. Demir и соавт. [2].

НТ, по данным разных исследований, оказывают негативное влияние на исход беременности как на ранних, так и на поздних ее сроках. В исследовании F. Azem и соавт. [3] выявлено, что частота встречаемости НТ в группе пациенток с 4 и более неудачными циклами ЭКО в анамнезе почти в 3 раза больше, чем в группе контроля. Также в метаанализе M. Di Nisio и соавт. [4] показано, что у пациенток с неудачными ЭКО выявляются НТ, в частности мутация фактора V Leiden.

В исследовании C. Coulam и соавт. [5] не выявлено статистически значимых различий в частоте специфических генных мутаций факторов свертывания в группе с повторным невынашиванием беременности и группе контроля. Однако гомозиготные мутации гораздо чаще встречались в группе с привычным невынашиванием беременности (59% против 10% в группе контроля) и множественными генными мутациями (68% против 21% в группе контроля). В исследовании Н. Qublan и соавт. [6] приводятся следующие данные: комбинированные тромбофилии (2 тромбофилических фактора и более) встречаются существенно чаще среди женщин с повторными неудачыми ЭКО по сравнению с группой контроля (35,6% против 4,4% в группе контроля). Поэтому для развития невынашивания беременности необходимо наличие выраженных нарушений системы гемостаза.

В настоящее время в патогенезе нарушений имплантации (особенно в рамках ЭКО) обсуждается роль следующих факторов: дефицит факторов противосвертывающей системы (протеинов С и S, антитромбина III), дефекты факторов свертывания II, V и XIII, полиморфизм ингибитора активатора плазминогена-1 (PAI-1) и адгезивных белков тромбоцитов (GPIIb/IIIa) [7].

Недифференцированная дисплазия соединительной ткани (нДСТ) — генетически гетерогенная группа заболеваний мультифакториальной природы, в основе которых лежат нарушения синтеза и распада внеклеточного матрикса, возникающие под действием неблагоприятных факторов внешней среды у индивидуумов с определенной генетической предрасположенностью уже в периоде раннего эмбриогенеза или постнатально и характеризующиеся нечеткой клинической картиной [8, 9].

Имеется ряд сведений, косвенно указывающих на роль нДСТ в патогенезе нарушений рецептивности эндометрия и НТ.

Для инвазии трофобласта необходимы матриксные металлопротеиназы: ММР 1, 2, 3, 9, активность которых повышается посредством ингибирования TIMP 1, 2 и 3, индуцируемого LIF [10].

Остеопонтин обеспечивает прикрепление остеобластов к неорганическому компоненту костного матрикса путем прочного связывания с кристаллами гидроксиапатита, а в эндометрии он необходим для адгезии бластоцисты за счет связывания с другими интегринами на пиноподиях эпителия [11].

Гены, которые могут инициировать развитие синдромов НТ и нДСТ, находятся в одном локусе. Например, в локусе 13q34 расположены гены коллагена IV типа COL4A1 и COL4A2, а также гены факторов свертывания FVII и FX, также в локусе 7q22.1 расположен ген SERPINE1, кодирующий белок PAI-1, и ген COL1A2, кодирующий α2-цепь коллагена 1-го типа [12—14].

Белок PAI-1 имеет двоякую функцию: помимо своей основной функции ингибирования процессов фибринолиза, он также играет важную роль в процессах интерстициального фиброза [13].

Цель исследования — определить морфологический субстрат и молекулярные механизмы нарушений исходов беременности у женщин с нДСТ и НТ.

Материал и методы

В исследование включили 130 пациенток репродуктивного возраста с первичным бесплодием, находившихся на обследовании и лечении по поводу первичного бесплодия во ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» и ООО «Гематологический кабинет доктора Димитрия Колосовского» и 11 пациенток группы контроля (суррогатные матери). В рамках этапа исследования эндометрия им выполняли пайпель-биопсию на 6—8-й день после овуляции по данным УЗИ. Пациенткам основной группы с НТ также проводили молекулярно-генетическое исследование сыворотки крови на полиморфизмы или мутации следующих генов: FII, FV (Leiden), FVII, FXII, FXIII, GpIa, GpIb (-5), GpIb (T145M), GpIIIa, PAI-1, FBGb, MTHFR, MTRR, MTR, SLC19A1, ангиотензиногена (M235T и Т145М), ангиотензинпревращающего фермента, их гомо- или гетерозиготность. Диагноз Н.Т. основывался на молекулярно-генетическом исследовании в соответствии с клиническими рекомендациями Американской коллегии торакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии, диагноз нДСТ — на углубленном анамнестическом исследовании с подробным изучением признаков нДСТ по Т.И. Кадуриной. Пациенток основной группы подразделили на подгруппы: 1А — с бесплодием и НТ (n=91), 1Б — с бесплодием, НТ и нДСТ (n=19), 1 В — с бесплодием и нДСТ (n=20; группа морфологического контроля).

Проводили морфологическое и иммуногистохимическое исследования эндометрия с использованием первичных антител к рецепторам половых гормонов, LIF, PAI-1, остеопонтину, а также статистическую обработку результатов.

Результаты

Количество беременностей в основной группе было сопоставимо с количеством пациенток в каждой подгруппе. Исходы беременности рассматривали как благоприятные — роды и неблагоприятные — замершие беременности. Больше всего благоприятных исходов отмечено в подгруппе 1 В с нДСТ, меньше всего — в подгруппе 1Б. Суммарные данные по исходам беременности представлены в табл. 1.

Таблица 1. Исходы беременности в подгруппах основной группы пациенток с бесплодием, %
В группе контроля все беременности заканчивались родами.

При анализе свертывающей системы в группе с НТ в 25% случаев наблюдалась повышенная концентрация PAI-1 в плазме крови, в 12,5% — гипергомоцистеинемия, в 55% — дезагрегационная тромбоцитопатия, в 35% случаев — синдром липких тромбоцитов и в 5% случаев отмечался низкий уровень толерантности к метиониновому тесту.

Исследовали также структуру полиморфизов гена PAI-1, из 91 пациентки выявлено 27 с гомозиготным полиморфизмом 4G/4G, 38 с гетерозиготным полиморфизмом 4G/5G и 25 без полиморфизма 5G/5G (рис. 1, а).

Рис. 1. Гистограммы, отражающие качественный состав мутаций и полиморфизмов в основной группе женщин с наследственными тромбофилиями и сочетанием наследственных тромбофилий и недифференцированной дисплазии соединительной ткани. а — качественный состав мутаций и полиморфизмов в группе с НТ; б — частота мутаций и полиморфизмов факторов свертывания крови в структуре рожавших и нерожавших женщин в группе с НТ; в — качественный состав мутаций и полиморфизмов в группе с НТ и нДСТ; г — частота мутаций и полиморфизмов факторов свертывания крови в структуре рожавших и нерожавших женщин в группе с НТ и нДСТ; д — частота сладжа или микротромбоза, а также очагового фиброза при каждой мутации генов, участвующих в процессе гемостаза.

Частота мутаций и полиморфизмов факторов свертывания в структуре рожавших и нерожавших женщин с НТ показана на рис. 1, б.

В группе с сочетанием признаков НТ и нДСТ обнаруживали следующие изменения: в 15,8% случаев повышенная концентрация PAI-1 в плазме крови, в 10,5% — гипергомоцистеинемия, в 88% — дезагрегационная тромбоцитопатия, в 36,8% случаев синдром липких тромбоцитов и в 5,2% случаев отмечали низкий уровень толерантности к метиониновому тесту.

Качественный состав мутаций и полиморфизмов в группе с НТ и нДСТ показан на рис. 1, в.

Исследовали также структуру полиморфизов гена PAI-1, среди 19 пациенток в подгруппе с нДСТ и НТ выявлено 12 с гомозиготным полиморфизмом 4G/4G, 5 с гетерозиготным полиморфизмом 4G/5G и 2 без полиморфизма 5G/5G.

Также проведен анализ частот мутаций генов факторов свертывания в зависимости от наличия родов в анамнезе у женщин подгрупп 1А и 1Б. В группе женщин, которые не имели родов в анамнезе, отмечены существенно более высокие частоты полиморфизмов генов фибриногена и метилентетрагидрофолатредуктазы, при этом мутация фактора VII была чаще у женщин с родами в анамнезе (см. рис. 1, г).

Чаще всего у пациенток с НТ, страдающих бесплодием, наблюдали мутации и полиморфизмы генов PAI-1, SLC19A1, GpIa, MTRR. В подгруппе 1А у 9 (9,9%) пациенток наблюдали полиморфизм 3 и менее генов системы свертывания крови, у остальных их было 4 и более — от 4 до 11, в среднем полиморфизм 6,6±2,3 гена у каждой пациентки. Поскольку предполагалось, что большее количество мутаций и полиморфизмов генов белков, влияющих на свертываемость крови, приведет к снижению вероятности родоразрешения, проведен анализ частот мутаций генов, факторов свертывания в зависимости от наличия родов в анамнезе. Анализ показал неоднозначные результаты в группе с НТ: у пациенток с бесплодием, у которых в анамнезе были роды (т.е. у пациенток с вторичным бесплодием), частота мутаций в целом выше, чем у пациенток, у которых в анамнезе родов не было (т.е. у пациенток с первичным бесплодием) (табл. 2).

Таблица 2. Сравнение частоты показателей системы гемостаза

У пациенток обеих подгрупп с НТ наблюдали мутации и полиморфизмы генов PAI-1, SLC19A1, GpIa, MTRR, в подгруппе с НТ и нДСТ в большем проценте случаев выявлены мутации FV (Leiden), GрIa и SLC19A1, а также GрIb. В структуре мутаций гена PAI-1 в группе с НТ и нДСТ гомозиготные полиморфизмы встречались существенно чаще, чем в группе 2 (77,8% против 30%), что может свидетельствовать в пользу того, что мутации PAI-1 могут играть определенную роль в патогенезе синдрома нДСТ, аналогично можно говорить о структуре полиморфизмов гена GpIa.

В группе с НТ у 4 (10%) пациенток наблюдали полиморфизм 3 и менее генов системы свертывания крови, у остальных их было 4 и более — от 4 до 11, в среднем полиморфизм 6,6±2,3 гена у каждой пациентки. В группе с сочетанием НТ и нДСТ только у 1 (5,3%) пациентки был полиморфизм 3 и менее генов системы свертывания крови, у остальных 18 — 5 и более, до 12. В среднем наблюдали полиморфизм 7,3±3,0 гена у каждой пациентки. Коэффициент Манна—Уитни U=136,0; р=0,266. Полученные данные подтверждаются полигенным наследованием НТ в исследуемых подгруппах. При этом различие в числе полиморфизмов в этих подгруппах не является статистически значимым, т. е. наличие нДСТ не влияет на число полиморфизмов генов белков, влияющих на свертываемость крови.

В морфологическое исследование вошел биопсийный материал эндометрия от 141 пациентки основной и контрольной групп. Распределение материала в каждой исследуемой группе по морфологическим стадиям эндометрия в период «окна имплантации» показано в табл. 3.

Таблица 3. Распределение материала в каждой исследуемой группе по морфологическим стадиям эндометрия в период «окна имплантации», %
Отмечено отставание созревания эндометрия в основной группе, особенно в подгруппе с сочетанием НТ и нДСТ (рис. 2, а,
Рис. 2, а—е. Морфологическое и иммуногистохимическое исследования эндометрия в основной и контрольной группах. а — эндометрий поздней стадии пролиферации, подруппа с НТ и нДСТ, окраска гематоксилином и эозином, ×630; б — эндометрий ранней стадии секреции, подруппа с НТ, окраска гематоксилином и эозином, ×630; в — низкая экспрессия PАI-1 в эндометрии пациенток группы контроля, иммунопероксидазная реакция, ×200; г — высокая экспрессия PАI-1 в эндометрии пациенток подгруппы с НТ и нДСТ, иммунопероксидазная реакция, ×630; д — высокая экспрессия остеопонтина в эпителии и пиноподиях в эндометрии пациенток группы контроля, иммунопероксидазная реакция, ×250; е — умеренная экспрессия остеопонтина в эпителии и строме, отсутствие в просвете желез эндометрия пациенток подгруппы с нДСТ, ×400.
б).

Пиноподии в поверхностном эпителии эндометрия определялись в подгруппах 1А, 1Б и 1 В и 19, 12 и 24 соответственно (p>0,05). В основной группе часто обнаруживали очаговый склероз, расстройства микроциркуляции — кровоизлияния в строме, сладж и тромбы в микрососудах. В подгруппах 1Б и 1 В расстройства микроциркуляции выявлены в 47,3 и 55% случаев соответственно, в подгруппе 1А их было 40%, тогда как в контроле указанные изменения не обнаружены (p>0,05). Очаги склероза встречались в подгруппах 1Б и 1 В в 68,4 и 70% случаев, в группе с НТ в 50%; p>0,05 (см. табл. 3).Частота сладжа, микротромбоза или очагов склероза в основной группе с НТ (1А и 1Б) зависела не столько от каких-то конкретных мутаций генов системы свертывания, сколько от их количества (см. рис. 1, д).

При анализе результатов иммуногистохимического исследования показано, что у пациенток основной группы имеются нарушения рецептивности как на структурном, так и на молекулярном уровне, что проявляется снижением количества зрелых пиноподий, экспрессии LIF, а также дисбалансом экспрессии рецепторов эстрогеновых и прогестероновых гормонов в строме эндометрия. Данные по экспрессии рецепторов половых гормонов и LIF опубликованы ранее в наших статьях [8, 15].

В нашем исследовании PАI-1 выявлялся на более высоком уровне в эпителии и строме у пациенток основной группы по сравнению с группой контроля (p≤0,05). Важно отметить, что максимальная экспрессия белка обнаружена в поверхностном эпителии эндометрия пациенток подгруппы 1Б с НТ и нДСТ, составив 5±1,2 балла, и в подгруппе с НТ — 4,5±1,1 балла, что превысило аналогичный показатель в группе контроля — 0,95±1,23 балла (p≤0,05). Похожая тенденция прослеживалась и в экспрессии маркера в эндотелии сосудов и в строме эндометрия (p≤0,05) (см. рис. 2, ж).

Следующим новым маркером рецептивности эндометрия был остеопонтин, являющийся одним из факторов адгезии. В нашем исследовании маркер обнаруживался в поверхностном и железистом эпителии эндометрия, в пиноподиях и строме слизистой тела матки (см. рис. 2, д, е). В группе контроля экспрессия белка достоверно выше вне зависимости от его локализации в эндометрии по сравнению с основной группой (p≤0,05) (см. рис. 2, з).

Обсуждение

Результаты исследования показали, что синдром нДСТ играет определенную роль в развитии бесплодия у пациенток с НТ, однако она не является определяющей. Это подтверждается следующими данными: отсутствие статистически значимых различий в частоте замерших беременностей и родов у пациенток в обеих группах. Частота мутаций и полиморфизмов всех исследованных факторов свертывания в целом сопоставима, однако нет статистически значимых различий между количеством мутаций и полиморфизмов у пациенток в исследуемых подгруппах с НТ (1А и 1Б). Кроме того, между частотами выявления отклонений в различных показателях системы гемостаза, как правило, статистически значимые различия отсутствовали. Однако при этом отмечается ряд тенденций, указывающих на роль синдрома нДСТ в патогенезе бесплодия у пациенток с НТ. Во-первых, в подгруппе 1Бс НТ и нДСТ существенно чаще встречались гомозиготные полиморфизмы гена PAI-1, а также статистически значимо чаще выявлялась дезагрегационная тромбоцитопатия. Во-вторых, отмечается тенденция к замедлению морфологического созревания эндометрия: в группе с НТ средняя стадия секреции, необходимая для имплантации бластоцисты, отмечалась более чем в 2 раза чаще, чем в подгруппе 1А с НТ, а морфологические изменения, соответствующие стадии пролиферации, при которой имплантация бластоцисты невозможна, на 12% чаще. Кроме того, в данной подгруппе статистически значимо чаще встречались очаги склероза и дисциркуляторные расстройства в эндометриальной строме. Данные этого исследования сопоставимы с ранее опубликованными в наших предыдущих работах [8, 15].

Кроме того, отмечается нарушение адгезии и имплантации бластоцисты, о чем косвенно свидетельствует понижение экспрессии LIF и остеопонтина особенно существенно, что уменьшает накопление данных маркеров в пиноподиях.

Заключение

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Д.Т.А., К.Е.А.

Сбор и обработка материала — Д.Т.А., К.Д.Ю., З.А.С.

Статистическая обработка — З.А.С.

Написание текста — Д.Т.А., З.А.С.

Редактирование — К.Е.А., Д.Т.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Демура Татьяна Александровна — д-р мед. наук, проф. каф. патологической анатомии им. акад. А.И. Струкова; https://orcid.org/ 0000-0002-6946-6146; e-mail: uursula90@gmail.com; demura-t@yandex.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail