Сальков В.Н.

1. Научный центр неврологии РАМН, Москва; 2. Научный центр здоровья детей РАМН, Москва; 3. Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.И. Городкова

Худоерков Р.М.

ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН, Москва

Воронков Д.Н.

ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН, Москва

Соболев В.Б.

ФГБУ "Научный центр неврологии" РАМН, Москва

Кутукова К.А.

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва, Россия

Морфохимические изменения клеточных структур черного вещества головного мозга при болезни Паркинсона

Журнал: Архив патологии. 2017;79(5): 3-9

Просмотров : 251

Загрузок : 4

Как цитировать

Сальков В. Н., Худоерков Р. М., Воронков Д. Н., Соболев В. Б., Кутукова К. А. Морфохимические изменения клеточных структур черного вещества головного мозга при болезни Паркинсона. Архив патологии. 2017;79(5):3-9.
Sal'kov V N, Khudoerkov R M, Voronkov D N, Sobolev V B, Kutukova K A. Morphochemical changes in the substantia nigra cellular structures in Parkinson’s disease. Arkhiv Patologii. 2017;79(5):3-9.
https://doi.org/10.17116/patol20177953-9

Авторы:

Сальков В.Н.

1. Научный центр неврологии РАМН, Москва; 2. Научный центр здоровья детей РАМН, Москва; 3. Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.И. Городкова

Все авторы (5)

Ожидаемая продолжительность жизни при рождении в последние годы непрерывно увеличивается как в нашей стране, так и в большинстве европейских стран [1, 2]. В связи с этим возрастает число лиц, достигающих пожилого возраста, что существенно повышает риск развития заболеваний, ассоциированных с этой возрастной группой. Одним из таких заболеваний является болезнь Паркинсона (БП), распространенность которой варьирует в общей популяции от 100 до 350 человек на 100 000 населения [3]. Двигательные нарушения (брадикинезия, ригидность и тремор), доминирующие в клинической картине БП, связывают с гибелью дофаминовых нейронов в вентральной области компактной части черного вещества (ЧВк) головного мозга и накоплением телец Леви в пигментированных (содержащих меланин) нейронах [4]. Тельца Леви, сформированные нерастворимыми агрегатами синуклеина и других белков, образующихся в результате нарушения работы убиквитин-протеасомной системы, механически смещают органеллы в нейронах, что может приводить к гибели последних и образованию свободного внеклеточного нейромеланина [5]. Высвобождение меланина при деструкции нейронов, как и накопление внеклеточных протеиновых агрегатов, обусловливает активацию микроглии [6], которая в свою очередь инициирует нейровоспалительную реакцию, усиливая гибель дофаминовых нейронов и усугубляя тем самым клинические проявления БП [7]. При старении по сравнению с БП убыль дофаминовых и пигментированных нейронов происходит значительно медленнее и не имеет «катастрофического» характера: на протяжении 2—3 десятилетий количество нейронов у взрослого человека снижается в среднем на 10% [8], а у пациента с БП на ранних стадиях болезни оно убывает на 50—90% [9].

Изложенное выше свидетельствует, что морфологическая основа возрастной инволюции головного мозга при старении и патоморфология БП изучены достаточно полно. Вместе с тем как при физиологическом старении, так и при БП недостаточно уточнены изменения экспрессии астроцитарных (глиального кислого фибриллярного белка, белка S100 и др.) и микроглиальных (IBA1, лектинов) белков. Одни авторы выявляют увеличение их экспрессии при старении [10] и БП [11], а другие его не обнаруживают [12]. Кроме того, при БП недостаточно изучены характер накопления в черном веществе (ЧВ) соединений железа и та роль, которую они играют в условиях патологии [13].

Цель работы — уточнить особенности морфохимических изменений клеточных структур ЧВ головного мозга при БП.

Материал и методы

Исследовали аутопсийный материал головного мозга умерших от интеркуррентных заболеваний лиц с БП (3 случая) и лиц, у которых в анамнезе сведения о неврологических расстройствах отсутствовали (8 случаев), — контрольная группа. Возраст умерших с БП составлял в первом случае 60 лет, во втором — 70 лет, а в третьем — 74 года. Ретроспективный анализ результатов клинического обследования больных показал, что во всех 3 случаях была диагностирована смешанная форма БП, у одного из пациентов установлена 2-я стадия заболевания, а у двух других — 3-я стадия (по шкале Хена—Яра). Длительность заболевания составила в одном случае 5 лет, в другом — 6 лет, а в третьем — 10 лет. В контрольной группе к периоду пожилого возраста (от 60 и до 75 лет) отнесли 3 случая, а к периоду старческого возраста (старше 75 лет) — 5 случаев. Средний возраст умерших из контрольной группы составил 77 лет.

Аутопсийный материал головного мозга фиксировали в 10% растворе формалина, затем дегидратировали и заключали в парафиновые блоки, которые на уровне ЧВк раскладывали на фронтальные срезы толщиной 10 мкм. Часть гистологических срезов окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу Ниссля. Другую часть срезов использовали для проведения гистохимических и иммуногистохимических реакций. Для выявления соединений железа (II) в структурах ЧВ применяли метод Перлса, предварительно обрабатывая срезы 30% раствором перекиси водорода в течение 30 мин. Иммуногистохимически выявляли дофаминовые нейроны, используя поликлональные антитела к тирозингидроксилазе («Sigma», №T8700) в разведении 1:1500, и астроцитарную нейроглию, применяя реакцию с моноклональными антителами («Sigma», №G3893) на кислый глиофибриллярный белок (GFAP) в разведении 1:200. Микроглию выявляли авидинпероксидазным методом при помощи антител к белку IBA1 (1:200, «Sigma», №SAB2500042), который экспрессируется как находящейся в стадии покоя, так и активированной микроглией [10]. В качестве хромогена использовали 3,3-диаминобензидин с хлоридом кобальта. Иммуногистохимические реакции выполняли согласно протоколу фирмы «Sigma-Aldrich». Кроме того, выявляли накопление альфа-синуклеина, фосфорилированного по серину-129 (α-Syn-p129), составного элемента телец Леви и специфического маркера Б.П. Использовали первичные антитела к α-Syn-p129 («Wako»; № 015−25191), а также вторичные антитела из набора Multivision («Тhermo Scientific»; №TL-012-MHRA). Препараты исследовали визуально и оценивали количественно на микроскопе Leica DMLB, оснащенном цифровой видеокамерой и программой анализа изображений Leica QWin. Изучали морфохимические изменения структур ЧВ головного мозга при БП, оценивая локализацию тирозингидроксилазы, соединений железа (II), GFAP и др. Дофаминовые нейроны в сегментах вентральной области ЧВк подсчитывали в поле зрения микроскопа (об. ×40, ок. ×10), используя каждый 5-й срез. Накопление α-Syn-p129 в ЧВк оценивали по количеству телец Леви, выявленных (об. ×40, ок. ×10) на единицу площади гистологического среза (0,01 мм2), т. е. подсчитывали плотность распределения телец Леви, также используя каждый 5-й срез. Полученные данные обрабатывали статистически c использованием пакета прикладных программ SigmaPlot-12.0. Различия по числу дофаминовых нейронов в сегментах вентральной области ЧВк и плотности распределения телец Леви в ЧВк у лиц с БП и в контрольной группе устанавливали с использованием U-критерия Манна—Уитни. Данные представляли в виде: Me [LQ; HQ], где Me — медиана; LQ — 1-й квартиль; HQ — 3-й квартиль.

Результаты и обсуждение

В области среднего мозга у лиц контрольной группы ЧВ наблюдали в виде тяжа, который располагался между красным ядром и основанием ножек мозга и разделялся на две части: редкоклеточную ретикулярную и густоклеточную компактную. В последней выделяли две области: дорсальную и вентральную (рис. 1, а). По сравнению с контрольной группой у лиц с БП нейроны в ЧВк располагались более разреженно, а в одном случае БП в дорсальной области выявляли лишь отдельные клеточные скопления (см. рис. 1, б).

Рис. 1. Локализация скоплений нейронов в компактной части черного вещества головного мозга (КЧ-Д — дорсальная область, КЧ-В — вентральная область). а — у лиц, не имевших неврологических расстройств; б — у лиц с болезнью Паркинсона. а, б — окраска крезиловым фиолетовым, ×32).

Дофаминовые нейроны выявляли в ЧВк как у лиц контрольной группы (рис. 2, а), так и у лиц с БП (см. рис. 2, б). В то же время в контрольной группе число дофаминовых нейронов в вентромедиальном и промежуточном сегментах вентральной области ЧВк, выявленных на одном срезе, составило 178 [158; 196], а у лиц с БП — 136 [114; 158]. Эмпирическое значение U-критерия Манна—Уитни определяли как 43, а его критическое значение — 201 (для р<0,01).

Рис. 2. Дофаминовые нейроны в компактной части черного вещества головного мозга. а — у лиц, не имевших неврологических расстройств; б — у лиц с болезнью Паркинсона. а, б — иммуногистохимическое выявление тирозингидроксилазы, ×100.

Соединения железа (II) в контрольной группе располагались вокруг стенок сосудов и в единичных клеточных элементах (рис. 3, а), а наиболее интенсивно его соединения окрашивались в вентральной области ЧВк и ретикулярной части ЧВ. В нейронах и нейроглии соединения железа (II) при БП выявляли в большом количестве (см. рис. 3, б), а в нейропиле интенсивность реакции на железо (II) была меньше, чем в клеточных элементах, но выше, чем в контроле.

Рис. 3. Локализация соединений железа (II) в компактной части черного вещества головного мозга. а — у лиц, не имевших неврологических расстройств; б — у лиц с болезнью Паркинсона. а, б — окраска по Перлсу, ×400.

Тельца Леви в ЧВк обнаруживали как в мозге у лиц контрольной группы, так и при БП, используя морфологическое окрашивание по Нисслю и иммуногистохимическое окрашивание на α-Syn-p129 (рис. 4, а—в). В контрольной группе их обнаруживали в 3 из 8 случаев исключительно в мозге людей старческого возраста. У лиц с БП, как и в контрольной группе, α-Syn-p129 локализовался в телах нейронов в виде интенсивно окрашенных агрегатов округлой формы и в отростках нейронов в виде веретенообразных включений с небольшими утолщениями. Кроме того, обнаруживали нейроны с цитоплазматическим окрашиванием на α-Syn-p129, но без крупных агрегатов белка. Интенсивность накопления α-Syn-p129 (плотность распределения телец Леви) составила на 0,01 мм2 гистологического среза в контрольной группе 2 [1; 3], а у лиц с БП 3 [2; 5]. Эмпирическое значение U-критерия Манна—Уитни определяли как 183,5, а его критическое значение — 192 (для р<0,01).

Рис. 4. Тельца Леви (обозначены стрелками) в компактной части черного вещества головного мозга. а — у лиц, не имевших неврологических расстройств, окраска крезиловым фиолетовым, ×1000; б — у лиц, не имевших неврологических расстройств; в — у лиц с болезнью Паркинсона. а, б — иммуногистохимическое выявление фосфорилированного по серину-129 альфа-синуклеина, ×1000.

Астроциты, содержавшие GFAP, как в случаях контроля, так и в случаях БП распределены по ЧВ головного мозга неравномерно. Преимущественно их обнаруживали на границе компактной и ретикулярной частей вне групп скоплений нейронов и в периферическом сегменте ретикулярной части на границе с красным ядром. В случаях контроля у большинства астроцитов, содержавших GFAP, интенсивность окрашивания тела была умеренной (рис. 5, а), а в случаях БП — значительной (см. рис. 5, б). Для GFAP-позитивной нейроглии ЧВ у лиц контрольной группы характерны длинные тонкие отростки (см. рис. 5, а), тогда как у лиц с БП — короткие утолщенные (см. рис. 5, б).

Рис. 5. GFAP-позитивные астроциты в черном веществе головного мозга. а — у лиц, не имевших неврологических расстройств; б — у лиц с болезнью Паркинсона. а, б — иммуногистохимическое выявление кислого глиофибриллярного белка, ×400.

Наиболее часто микроглиоциты при реакции на белок IBA1 выявляли в ретикулярной части ЧВ как в контрольной группе, так и при Б.П. При этом обнаруживали как микроглию с разветвленными, извитыми отростками (в стадии покоя), так и активированные клетки, имевшие овоидную форму с утолщенными короткими отростками или без них (рис. 6, а, б). Активированные клетки микроглии и макрофаги, интенсивно экспрессирующие IBA1, в мозге у лиц с БП располагались преимущественно вокруг сосудов.

Рис. 6. Микроглиоциты (обозначены стрелками) в черном веществе головного мозга. а — у лиц, не имевших неврологических расстройств; б — у лиц с болезнью Паркинсона. а, б — иммуногистохимическое выявление белка IBA1, ×1000.

Проведенная работа позволила обнаружить как в группе контроля, так и при БП внутриклеточные включения, содержащие α-Syn-p129 (тельца Леви), в нейронах ЧВк головного мозга. Кроме того, при БП, как и в группе контроля, в этом же образовании мозга выявляли нейроглию, накапливающую соединения железа (II) и характеризующуюся увеличенным содержанием GFAP. Следовательно, проведенная работа позволила продемонстрировать взаимосвязь старения и БП на основе сходных морфологических изменений, формирующихся в ЧВ при возрастной инволюции и нейродегенеративном процессе.

Вместе с тем убыль дофаминовых нейронов в ЧВк при БП была существенно выше, чем в контроле, что соответствует данным литературы [14]. Тельца Леви в ЧВк выявляли в контрольной группе исключительно у лиц старческого возраста, а при БП — в пожилом возрасте. Наряду с этим в случаях БП накопление телец Леви в ЧВк было выше, чем в случаях контроля, и коррелировало с данными литературы [15]. Кроме того, накопление соединений железа (II) в клеточных элементах и нейропиле и усиление экспрессии GFAP в клетках нейроглии при БП выражены более отчетливо, чем при физиологическом старении.

Следовательно, интенсивность структурных изменений, выявленных в ЧВ головного мозга при возрастной инволюции (физиологическом старении) и нейродегенеративном процессе (БП), была различной. Во втором случае она значительно выше, чем в первом.

Умеренная активация микроглии, описанная нами у пациентов с БП, длительность заболевания у которых составляла не менее 5 лет, согласуется с данными других авторов [16], установивших, что увеличение активности микроглии происходит лишь в начальной стадии заболевания и приводит к избыточной потере синапсов, инициируя последующие патоморфологические изменения. Подобную реакцию микроглии наблюдали и в группе контроля, что согласуется с данными других исследователей [10], обнаруживших в ЧВк при старении признаки умеренной активации микроглии. Установленное нами более отчетливое усиление экспрессии GFAP в ЧВ у лиц с БП по сравнению с контролем может свидетельствовать, что астроглиоз до некоторой степени предохраняет гибель части нейронов при прогрессировании нейродегенеративного процесса.

Заключение

Таким образом, у лиц с БП патологоанатомический диагноз (сопутствующее заболевание) не должен основываться лишь на выявлении в ЧВк телец Леви и активированных глиальных клеток. Он должен быть существенно обоснован изучением качественных и количественных изменений клеточных структур ЧВк. Кроме того, как показало наше исследование, структурные изменения ЧВк, обусловленные инволютивным процессом при старении, усугубляются и значительно усиливаются в связи с формированием патологии. Этот факт следует учитывать при разработке прижизненных методик идентификации латентной стадии нейродегенеративных заболеваний, столь необходимых клиницистам для уточнения диагноза и своевременного назначения нейропротекторов [17], и верифицировать клинический диагноз у пациентов из группы риска, прибегая к нейроморфологическим методам в максимально ранние сроки.

Исследование выполнено при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16−04−00377 а.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.Н.С., Р.М.Х., Д.Н.В.

Сбор и обработка материала: В.Н.С., Д.Н.В., В.Б.С., К.А.К.

Статистическая обработка: В.Н.С.

Написание текста: В.Н.С., Д.Н.В.

Редактирование: Р.М.Х.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail