Более 90% злокачественных новообразований слизистой оболочки рта (СОР) приходится на плоскоклеточный рак (ПР). По частоте встречаемости он находится на 11-м месте среди всех онкологических заболеваний и составляет 3% от числа всех наблюдений впервые выявленного рака [1, 2]. По данным исследований, низкая выживаемость больных ПР СОР связана с его поздней диагностикой. Уровень 5-летней выживаемости при диагностике ПР на ранней стадии (I и II) может доходить до 80%, в то время как при диагностике ПР на поздней стадии (III и IV) составляет только около 20% [3, 4]. Поэтому раннее выявление предраковых состояний СОР является одним из приоритетных направлений современной медицины. На практике точная постановка диагноза особенно на фоне хронической воспалительной реакции не всегда представляется возможной, поэтому актуальной задачей является поиск новых достоверных критериев малигнизации эпителия СОР. Известно, что в зависимости от степени неопластической трансформации в СОР меняется пролиферативная активность клеток в разных слоях эпителия [5].

Повышение пролиферативной активности не является единственным признаком неопластического процесса, в клетках злокачественных опухолей повышается метаболизм глюкозы [6, 7] за счет усиления аэробного гликолиза (эффект Варбурга) [8, 9]. Транспорт глюкозы через клеточную мембрану осуществляется двумя путями: либо при участии натрийзависимых переносчиков глюкозы, либо - белков-переносчиков семейства GLUT [10], которые обеспечивают попадание глюкозы в клетку по градиенту концентрации без энергетических затрат [11]. В настоящее время выявлено 14 транспортеров семейства GLUT. Каждый транспортер обладает разной аффинностью к глюкозе и другим гексозам. Наиболее выражена экспрессия белка-переносчика GLUT1. Установлено, что повышение его уровня в различных тканях во многих случаях может быть связано с процессом онкогенеза [12, 13] и считается плохим прогностическим фактором [14, 15].

Цель исследования - изучение особенностей экспрессии белка GLUT1 в зависимости от пролиферативной активности клеток и степени неопластической трансформации эпителия СОР.

Использовали операционный материал отделения хирургической стоматологии и архивный материал лаборатории патологической анатомии ФГБУ ЦНИИС и ЧЛХ Минздрава России за период с января 2007 г. по октябрь 2015 г. Были исследованы биоптаты СОР 44 пациентов (37 женщин и 7 мужчин; средний возраст 53,7 года) с клиническим диагнозом лейкоплакии и ПР СОР. В 14 (31,9%) случаях установлен диагноз очаговая эпителиальная гиперплазия (ОЭГ) СОР, в 13 (29,5%) - плоскоклеточная внутриэпителиальная неоплазия (Squamous Intraepithelial Neoplasia - SIN). В 17 (38,6%) случаях при гистологическом исследовании был выявлен ПР СОР, в 5 (29,4%) ПР был низкодифференцированный, в 12 (70,6%) - высокодифференцированный. В контрольную группу включили 10 пациентов (8 женщин и 2 мужчин; средний возраст 51,1 года) с неизмененной слизистой оболочкой и диагнозом фиброма СОР без воспалительных изменений и реактивных гиперпластических процессов.

Для изучения биопсийного материала СОР кусочки ткани фиксировали в 10% забуференном формалине (рН 7,4) в течение 24 ч, после проводки на гистопроцессоре карусельного типа STP 120 Thermo scientific и станции заливки EC-350 Thermo scientific заливали в парафин с температурой плавления 54 °C. Затем изготавливали серийные срезы толщиной 5 мкм, которые впоследствии были окрашены в автоматическом режиме гематоксилином и эозином на аппарате Microm HMS 740 Thermo scientific и заключали в Bio-Mount («Bio Optica Milano S.P.A.», Италия).

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование биопсийного материала проводили в соответствии со стандартным протоколом. Из блоков, приготовленных для гистологического исследования на микротоме, нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Депарафинизацию и высокотемпературную демаскировку антител осуществляли при помощи PT-модуля в течение 20 мин при температуре 98 °C. Дальнейшие процедуры осуществляли в автоматическом режиме на Autostainer 360 Thermo scientific с использованием системы визуализации QUANTO. Протокол для Autostainer включал 10 мин Н₂О₂, 10 мин протеиновый блок, 30 мин первичные антитела, 10 мин вторичные антитела, 5 мин DAB. Промывка в TRIS-Buffer pH 6 с Tween 20. Тканевые антигены определяли с помощью мышиных моноклональных антител к Ki-67 (ММ1, «Diagnostic Biosystems») и эпитопспецифичных кроличьих антител к GLUT1 (Thermo scientific). После инкубации срезы отмывали в дистиллированной воде, а затем в течение 3 мин докрашивали гематоксилином Майера. После того как срезы приобретали голубой оттенок, стекла извлекали, обезвоживали в батарее спиртов восходящей концентрации, заключали в Bio-Mount («Bio Optica Milano S.P.A.», Италия). Препараты исследовали под микроскопом (Axioplan 2 imaging, «Karl Zeis») с фотофиксацией (AxioCam ERc 5s).

Индекс пролиферации (ИП) по Ki-67 (ИП Ki-67; %) определяли по отношению клеток с иммунореактивными ядрами к общему числу клеток. Экспрессию GLUT1 оценивали на наружной мембране эпителиальных клеток в условных единицах: 0 - экспрессии не отмечалось; 1 - слабое окрашивание мембран клеток; 2 - умеренное окрашивание мембран клеток; 3 - интенсивное окрашивание мембран клеток.

Большая часть пролиферирующих клеток при ОЭГ и SIN локализована в нижних 2/3 эпителия, поэтому оценку экспрессии белков Ki-67 и GLUT1 проводили в 300 клетках трех зон эпителия: 1-я зона - базальный слой - клетки, непосредственно прилегающие к базальной мембране; 2-я зона - парабазальный слой - 2 ряда клеток над базальным слоем; 3-я зона шиповатый слой эпителия. При П.Р. СОР выделены центральная и периферическая зоны опухоли. Показатели определяли в соответствующих участках тканей. Подсчет клеток проводили при увеличении в 400 раз.

Для количественной оценки результатов проводили морфометрические исследования. Статистический анализ осуществляли при помощи программы Statistica 10.0 в среде Windows 7, после оценки нормальности распределения данных по W-критерию Шапиро-Улка, достоверность различий для количественных признаков с ненормальным распределением осуществляли с помощью U-критерия Манна-Уитни, при этом указаны медианы, 25-й и 75-й процентили признаков, различия считали статистически значимыми при р<0,05. В случае нормального распределения данные представлены в виде средней величины и среднеквадратичного отклонения. Корреляционные взаимоотношения между ИП клеток и экспрессией GLUT1 оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Повышение пролиферативной активности клеток является одним из важных звеньев патогенеза опухолевого роста. Белок Ki-67 считается универсальным маркером пролиферирующих клеток, так как выявляется в клетке во всех фазах митотического цикла, кроме G0 [5]. В неизмененном эпителии и при ОЭГ пролиферирующие клетки локализовались в базальном и парабазальном слоях, но распределение иммунопозитивных клеток было различным. В неизмененном эпителии в 6 (60%) из 10 случаев пролиферирующие клетки преимущественно находились в базальном слое, в 2 (20%) - только в базальном слое и в 2 (20%) случаях - преимущественно в парабазальном слое (см. рисунок, а). При ОЭГ СОР в 6 (42,9%) случаях из 14 иммунопозитивные клетки выявлены преимущественно в парабазальном слое, из которых в 2 (30%) случаях и в шиповатом слое эпителия (см. рисунок, в). При SIN СОР во всех случаях пролиферация клеток отмечалась во всех трех зонах, в 7 (53,8%) случаях из 13 иммунопозитивные клетки локализовались преимущественно в парабазальном слое эпителия (см. рисунок, д). При П.Р. СОР пролиферация клеток отмечалась преимущественно по периферии солидных образований (см. рисунок, ж). Средние значения количественных показателей представлены в таблице.

Поскольку GLUT1 является мембранным белком, его экспрессия выявляется на плазматической мембране эпителиоцитов. В неизмененном эпителии окрашивание мембран клеток отмечалось только в единичных клетках базального слоя, интенсивность его была умеренной (см. рисунок, б). При ОЭГ в 8 (57,14%) случаях из 14 ИГХ-реакция в клетках базального и парабазального слоев была умеренной, а в шиповатом слое - слабой, в 3 (21,42%) случаях в базальном и парабазальном слоях окрашивание было интенсивным, в шиповатом слое - умеренным. В 2 (14,28%) случаях в базальном слое выявлено интенсивное окрашивание мембран клеток, в парабазальном - умеренное, в шиповатом - слабое. В одном случае максимальное окрашивание отмечалось в парабазальном слое, умеренное - в базальном и слабое - в шиповатом (см. рисунок, г). При SIN СОР в 100% случаев выявлена интенсивная окраска клеточных мембран базального и парабазального слоев, в шиповатом слое ИГХ-реакция была умеренной в 6 (46,2%) случаях из 13 и интенсивной в 7 (53,8%) случаях (см. рисунок, е). При П.Р. СОР во всех исследуемых препаратах в обеих зонах окраска мембран опухолевых клеток была интенсивной. В эпителиоцитах с признаками атипии GLUT1 определялся в виде гранул в цитоплазме (см. рисунок, з). Средние значения количественных показателей представлены в таблице.

Во всех нозологических формах между пролиферативной активностью клеток по Ki-67 и экспрессией GLUT1 выявлена высокая положительная корреляция (r=0,768, p<0,001).

Известно, что опухолевым клеткам требуется повышенное количество питательных веществ для поддержания высокого уровня их пролиферативной активности. Поэтому избыточное потребление глюкозы тесно взаимосвязано с количеством белков-транспортеров на поверхности мембран подобных клеток [16]. Проведенное исследование показало достоверно значимое увеличение экспрессии белка-транспортера GLUT1 в биоптатах пациентов с ПР СОР по сравнению с пациентами с ОЭГ и SIN. Повышение количества этого транспортного белка подтверждает его активное участие в обеспечении энергией раковых клеток, что способствует росту опухоли [17]. Цитоплазматическую экспрессию данного маркера при ПР СОР можно считать неблагоприятным прогностическим признаком [7].

В настоящем исследовании выявлена прямая взаимосвязь пролиферативной активности эпителиальных клеток и экспрессии на мембранах этих клеток белка GLUT1. Таким образом, мембранный транспортный белок GLUT1 может служить маркером при ранней диагностике неопластической трансформации клеток многослойного плоского эпителия СОР.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.И.Б., А.А.И.

Сбор и обработка материала: В.А.С., И.И.Б., А.А.И.

Статистическая обработка данных: И.И.Б.

Написание текста: А.А.И.

Редактирование: И.И.Б.

Конфликт интересов отсутствует.