Основную роль в опухолевой прогрессии играют два процесса — деструкция и ангиогенез. Они отвечают за рост и развитие опухоли, ее способность к инвазии и метастазированию. В процессе деструкции тканей ведущая роль принадлежит матриксным металлопротеиназам (ММП). Наряду с деструктивной они выполняют и регуляторные функции, активируя, инактивируя и модифицируя свойства целого ряда биологически активных молекул, которые контролируют процессы инвазии, метастазирования и ангиогенеза [1—3]. Повышенная экспрессия ММП наблюдается практически во всех злокачественных опухолях и ассоциируется с агрессивным течением заболевания и неблагоприятным прогнозом. Доказаны определенные различия в продукции ММП опухолями и тканями [1, 3]. ММП с достаточной избирательностью гидролизуют все основные компоненты соединительнотканного матрикса (СТМ) [1, 2]. Тканевые коллагеназы — ММП-1, ММП-8, ММП-13 и МТ1-ММП гидролизуют фибриллярные коллагены — основу соединительнотканного матрикса, обеспечивая развитие процесса инвазии. ММП-2 и ММП-9 гидролизуют коллаген IV типа — основу базальных мембран, что способствует отделению эндотелиальных клеток от мембран с последующей их миграцией и участием в процессе ангиогенеза [4—6]. ММП-2 и ММП-9 освобождают ряд ангиогенных факторов, связанных с СТМ, в частности ММП-9 высвобождает VEGF, который считается основным индуктором ангиогенеза [4, 6]. Активность ММП в тканях регулируется тканевыми активаторами и ингибиторами (ТИМП). Основным ингибитором ММП-2 и ММП-9 является ТИМП-2, который принимает участие и в активации ММП-2. Активатором ММП-9 служит плазмин, который активируется из плазминогена активатором плазминогена урокиназного типа (уАП). Уровень уАП служит косвенным показателем уровня плазмина [1].

В злокачественную трансформацию и опухолевую прогрессию вовлечена также ренинангиотензиновая система (РАС). Активация опухолевой РАС выражается в повышенном образовании ангиотензина II (AII) под действием ключевого фермента РАС — ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) и повышенной экспрессии рецептора AII типа 1 [7]. АПФ и АТ1R экспрессируются в злокачественных опухолях человека, в том числе при разных видах гинекологического рака [8]. Имеются данные о повышенной экспрессии AT1R при раке шейки матки [10]. Этот процесс сопровождается увеличением синтеза ряда факторов роста, в том числе VEGF [8, 9].

ММР-9 и факторы РАС способны продуцировать и высвобождать из СТМ VEGF — основной индуктор ангиогенеза. VEGF стимулирует рост эндотелиальных клеток сосудов, их выживание и пролиферацию, а также играет важную роль в образовании новых лимфатических сосудов, которые обеспечивают путь для метастазирования злокачественного новообразования, поддерживает сосудистую сеть опухоли, препятствуя апоптозу незрелых клеток эндотелия, подавляет созревание дендритных клеток, препятствуя иммунному ответу на раковую опухоль.

Настоящее исследование посвящено изучению особенностей экспрессии ключевых ферментов деструкции и ангиогенеза — ММП-2 и ММП-9, и их эндогенных регуляторов: ТИМП-2 и уАП, а также АПФ как в опухоли, так и прилегающей к ней морфологически нормальной ткани, при плоскоклеточной карциноме шейки матки (ПКШМ).

Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место после рака молочной железы по частоте заболеваемости и смертности у женщин. Этиологическими факторами возникновения РШМ служат вирусы папиллом (HPV) высокого риска, среди которых вирусы HPV16 и HPV18 являются наиболее распространенными и агрессивными [11]. В случае карциномы шейки матки имеются немногочисленные данные об увеличении экспрессии желатиназ, А и В в опухоли, а также данные об экспрессии ТИМП-2 [12]. Сведения об экспрессии ММП и ингибиторов в морфологически нормальной ткани, окружающей опухоль, единичны. Есть работа, указывающая на то, что при карциноме шейки матки стромальные клетки могут увеличивать прогрессию опухоли с помощью ММП-2 [13]. По предварительным данным, полученным нами, наблюдается достаточно высокий уровень экспрессии ММП как в опухолевой, так и в нормальной, прилегающей к опухоли, ткани [14].

В работе использованы образцы плоскоклеточной карциномы шейки матки и прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани. Все образцы были стадированы по TNM-классификации злокачественных опухолей 2014 г. Исследования проводились в соответствии с принципами, обозначенными в Хельсинской декларации. Все образцы карцином экспрессировали ген Е7 HPV16.

Методом зимографии определяли активность и спектр ММП-2 и ММП-9 в 15 образцах опухолевой и 12 образцах прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани. Зимографию с сополимеризованным желатином проводили по модифицированному методу, описанному в работе [15]. Концентрация верхнего (концентрирующего) геля составляла 4%, нижнего (разделяющего) — 7,5%, концентрация желатина — 1,5 мг/мл. Пробы наносили из расчета 50 мкг белка на лунку. Электрофоретический анализ проводили при температуре 9 °C в течение 1,5 ч. Гель промывали (3×30 мин) в буферном растворе, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ СаСl2, 2,5% тритон Х-100, после чего инкубировали в течение 20 ч при температуре 37 °C в этом же буферном растворе, но с пониженной до 1% концентрацией тритона Х-100. После инкубации гель фиксировали в смеси изопропанол—уксусная кислота—вода (в разведении 5:2:13), окрашивали в течение 30 мин 0,1% Кумасси R 250 и отмывали в растворе изопропанол—уксусная кислота—вода (2:1:17). Количественную оценку проводили с помощью денситометрии.

Иммуногистохимическое исследование проводили на 24 случаях плоскоклеточной карциномы шейки матки по стандартному протоколу [16] с некоторыми модификациями. Послеоперационный материал фиксировали раствором 10% нейтрального формалина в течение 24 ч. Восстановление антигенной активности проводили при температуре 95 °C в течение 20 мин в цитратном буфере (рН 6,0) или в стандартном Трис-HCl-EDTA-буфере (рН 9,0) для соответствующих антител. Использовали моноклональные антитела к ММР-1, -2, -9 и TИМП-1, -2 фирмы «LabVision» в готовом разведении; иммуногистохимические (ИГХ) реакции проводили в автоматизированном режиме в иммуногистостейнере Avtosteiner («Dako», Дания). Микроскопирование проводили на анализаторе изображения Leica Q 550 («Leica Microsystems», Германия). Выраженность реакции оценивали полуколичественным способом по шкале от 0 до 3 баллов (0 — отсутствие реакции, 1 — слабая реакция, 2 — умеренная реакция, 3 — сильная реакция).

Активность уАП исследована в лизатах образцов опухоли (9) и прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани (9). Активность фермента определяли по гидролизу специфического флюорогенного субстрата Z-Gly-Gly-Arg-MCA (4∙10^–5 М) при рН 7,8. Гидролиз субстрата проводили при 37 °C в течение 15—30 мин. Реакцию останавливали добавлением 20 мМ ацетатного буфера (рН 4,0). Флюоресценцию продукта реакции 7-амино-4-метил-кумарила (МСА) измеряли при 370 нм (возбуждение) и 460 нм (излучение). Активность выражали в пмоль продукта, освобожденного за 1 мин, на 1 мг белка.

Активность АПФ в исследуемых образцах определяли флюориметрическим методом по расщеплению субстрата Z-Phe-His-Leu. Образующийся под действием АПФ дипептид His-Leu взаимодействовал в щелочной среде с ортофталевым диальдегидом с образованием флюоресцирующего продукта, измерение которого проводили при длине волн 370 нм (экстинкция) и при 500 нм (эмиссия). Активность выражали в нм продукта, освобожденного за 1 мин, на 1 мг белка [17].

Исследование спектра и активности ММП-2 и ММП-9 методом зимографии проведено на 15 образцах карцином шейки матки и 12 образцах прилегающих к опухоли тканей. На рис. 1 представлены данные зимографии, демонстрирующие в большинстве (94%) исследованных образцов опухолей, по данным денситометрии, ярко выраженную экспрессию ММП-9, в то время как в нормальной ткани она присутствовала в незначительных количествах или отсутствовала. Активность ММП-2 обнаружена как в опухоли, так и в нормальной ткани. В большинстве (61%) образцов активность ММП-2 в опухоли была выше, чем в норме, хотя и в значительно меньшей степени, чем ММП-9, а в 39% образцов активность ММП-2 в норме была выше, чем в опухоли. Результаты, полученные по исследованию активности ММП-2 и ММП-9, свидетельствуют о том, что при ПКШМ происходит резкое увеличение экспрессии ММП-9 в опухолевой ткани, экспрессия же ММП-2 изменяется в меньшей степени, причем находится на достаточно высоком уровне. ММП-9 может служить маркером развития инвазивного процесса. Экспрессия этих ферментов происходит не только в опухолевых клетках, но и в прилегающей к ним морфологически нормальной ткани (см. рис. 1). Следует учесть, что ММП-2 относится к конститутивным ферментам, экспрессия которых мало зависит от индуцирующих факторов, а ММП-9 является индуцируемым ферментом, экспрессия которого зависит от факторов индукции, в частности онкогена. Результаты, полученные в исследовании активности ММП-2 и ММП-9, свидетельствуют о том, что экспрессия этих ферментов происходит не только в опухолевых клетках, но и в прилегающей к ним морфологически нормальной ткани, что вносит свой вклад в увеличение инвазивного потенциала опухоли и указывают на существенную роль регуляции активности этих ферментов на посттрансляционном уровне.

Исследование уровней экспрессии ММП-2, ММП-9 и их тканевого ингибитора ТИМП-2 было проведено с применением ИГХ на 24 образцах карцином шейки матки. Полученные данные (рис. 2) показывают, что экспрессия ММП-2 и ММП-9 была ярко выражена в опухолевых клетках (3 балла), в то время как экспрессия ТИМП-2 была выражена значительно слабее либо отсутствовала.

Наши результаты по исследованию экспрессии ММП-2 и ММП-9 в ПКШМ согласуются с результатами, полученными нами ранее при исследовании экспрессии этих ферментов в случае трансформации фибробластов Е7 онкогеном HPV16 [18], а также на коммерческих клеточных линиях ПКШМ [19] и клиническом материале [14]. Имеющиеся в литературе данные по экспрессии ММП-2, ММП-9 в РШМ весьма противоречивы. Одни авторы указывают на отсутствие корреляции в развитии инвазивного процесса и метастазов с экспрессией ММП-2 и ТИМП-2. Другие исследователи обнаружили значительную экспрессию ММП-2, ММП-9 в тканях карцином шейки матки разной степени дифференцировки [12, 20]. Результаты нашего исследования, полученные при зимографии и ИГХ, свидетельствуют о том, что основной вклад в деструктивный (инвазивный) потенциал HPV-позитивных, экспрессирующих ген Е7 HPV, карцином шейки матки вносят увеличение активности ММП-9, а также низкая экспрессия ингибитора ТИМП-2 и в меньшей степени изменение активности ММП-2, хотя активность этого фермента остается на достаточно высоком уровне. ММП-9 может служить маркером инвазивного процесса, а уровень ее активности имеет прогностическое значение. Оценивая экспрессию ТИМП-2, следует учитывать, что этот ингибитор принимает участие и в активации ММП-2. В прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани также обнаружена существенная экспрессия ММП-2 и ММП-9, которая вносит свой дополнительный вклад в увеличение деструктивного потенциала опухоли.

Исследование экспрессии уАП было проведено на 18 образцах, включающих 9 образцов опухоли и 9 образцов прилегающей к ней морфологически нормальной ткани. Установлено, что активность фермента присутствовала во всех исследованных образцах (рис. 3). При этом в опухоли активность фермента в большинстве случаев была существенно выше, чем в нормальной ткани (от 2 до 10 раз). В двух случаях активность уАП была вне опухоли, что может иметь прогностическое значение. Высокая активность уАП характеризует высокую потенциальную возможность проявления ферментативной активности ММП. Данные по низкой экспрессии тканевого ингибитора ТИМП-2 и высокой экспрессии уАП свидетельствуют о нарушении регуляции ММП на посттрансляционном уровне, что приводит к повышению активности ММП и увеличению инвазивной активности опухоли [1].

Для оценки участия РАС в развитии ПКШМ исследовали особенности экспрессии АПФ как фактора ангиогенеза. Активность АПФ определяли в 18 образцах опухоли и прилегающей к опухоли нормальной ткани (рис. 4). Активность АПФ в большинстве случаев (1—6) была существенно выше в опухолях (от 30 до 300%), что подтверждает участие АПФ в развитии опухолевой прогрессии. Предполагается, что повышение активности АПФ может являться маркером, прогнозирующим ухудшение клинического исхода заболевания. В одном случае (7) существенных различий в активности АПФ не наблюдалось. В двух парных образцах (8 и 9) активность АПФ была выше в прилегающей к опухоли ткани. Можно предположить, что повышенная активность АПФ в нормальной ткани свидетельствует об активации РАС в клетках организма-хозяина, что может служить прогностическим признаком развития инвазивного процесса.

Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение экспрессии ММП-9 и ее активатора уАП, в меньшей степени изменение активности ММП-2, а также низкая экспрессия тканевого ингибитора ТИМП-2 в опухолях при ПКШМ направлены на увеличение деструктивного потенциала опухоли. При этом ММП-9 может рассматриваться в качестве маркера инвазивного процесса. Повышенная активность АПФ в опухолевой ткани подтверждает участие этого фермента в прогрессии опухоли. В большинстве случаев экспрессия исследуемых ферментов была обнаружена и в прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани, причем в некоторых случаях ее уровень превышал уровень экспрессии в опухолевой ткани, что вносит дополнительный вклад в деструктивный процесс и может служить негативным прогностическим признаком. Данные важны для понимания механизма деструкции матрикса, ангиогенеза, развития процессов инвазии и метастазирования, имеют прогностическое значение при ПКШМ.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка материалов: О.С.Т., Е.В.К., Т.А.Г., Л.Э.З.

Статистическая обработка данных: О.С.Т., Е.В.К., Т.А.Г.

Написание текста: О.С.Т., Е.В.К., Н.И.С., Л.Э.З.

Редактирование: Н.И.С., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Конфликт интересов отсутствует.