На сегодняшний день заслуживают внимания вопросы изменения миометрия при соединительнотканной дисплазии (СД). В современной литературе этот аспект практически не освещен, однако у женщин с СД описываются такие осложнения родов, как слабость родовой деятельности, гипотонические кровотечения, преждевременные роды [1]. По мнению многих авторов, важную роль в течении беременности и родов играют процессы ремоделирования миометрия [2]. При этом больше всего внимания уделяется межклеточному матриксу. Именно за счет процессов его ремоделирования формируется межклеточный каркаc, позволяющий связать в единую жесткую тяговую систему пучки гладкомышечных клеток (ГМК), что также обеспечивает адекватный межклеточный обмен [3]. Многие исследователи, изучавшие другие органы при данном синдроме, отмечали нарушение процессов эластогенеза и образования коллагена с изменением их соотношения.

Цель исследования — выявление морфологических особенностей миометрия нижнего сегмента матки у женщин со слабостью родовой деятельности при СД.

Материалом исследования явились образцы биопсии нижнего сегмента миометрия, взятые во время кесарева сечения у 15 рожениц со слабостью родовой деятельности и признаками СД (основная группа), и 10 — без слабости родовой деятельности и признаков СД (группа сравнения). Диагноз С.Д. 15 обследованным женщинам поставлен совместно кардиологами и акушерами-гинекологами по внешним и висцеральным признакам в соответствии с Российскими рекомендациями I пересмотра [4]. В группе сравнения кесарево сечение проводилось по поводу ягодичного предлежания плода, крупного плода или пороков его развития. Использовали: 1) гистологическое исследование парафиновых срезов с применением окраски гематоксилином и эозином и по ван Гизону; 2) иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) с использованием антител к коллагену I, III типов, матричным металлопротеиназам (MMP) 1, 9, ингибитору матричных металлопротеиназ (TIMP-1), фибронектину, фибулину-5, коннексину-43; 3) электронную микроскопию; 4) электронную иммуноцитохимию с коннексином-43; 5) морфометрию с вычислением средней относительной площади экспрессии (отношение площади экспрессии антигенов к площади гистологического препарата в %) коллагена I, III типов, фибронектина, фибулина-5, коннексина-43. Экспрессию MMP 1, 9, TIMP-1 оценивали в баллах: 1 — в единичных клетках, 2 — в небольших группах, 3 — в больших группах клеток, 4 — тотальная.

Для электронной микроскопии и электронной иммуноцитохимии использовали фрагменты миометрия нижнего сегмента матки 3 рожениц основной группы и 2 — группы сравнения. Для электронной микроскопии образцы фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего промывали в 3 сменах фосфатного буфера. Далее выполняли постфиксацию кусочков в 1% растворе тетроксида осмия на том же буфере при той же температуре в течение 1 ч. После фиксации объекты дегидратировали в серии растворов этанола возрастающей концентрации, пропитывали ацетоном и заключали в эпоксидную смолу Эпон. На ультрамикротоме Leica UC7 получали ультратонкие срезы толщиной 50—70 нм. Срезы собирали на медные сетки для электронной микроскопии. Сетки со срезами отконтрастировали в спиртовом растворе уранил-ацетата и водном растворе цитрата свинца. Электронно-микроскопическое исследование срезов выполняли на микроскопе JEOL JEM 1011. Для электронной иммуноцитохимии образцы миометрия фиксировали 4% раствором параформальдегида в фосфатном буфере с добавлением 0,2% глутарового альдегида в течение 1 ч. Далее объекты дегидратировали в серии растворов этанола возрастающей концентрации и заключали в акриловую смолу LRWhite («Sigma Inc.»). Полимеризация смолы проходила в закрытых желатиновых капсулах при температуре 52 °C. На ультрамикротоме Leica UC7 получали ультратонкие срезы (50—70 нм) изучаемого материала. Срезы собирали на никелевые сетки для электронной микроскопии. С целью блокирования неспецифического связывания антител срезы на сетках обрабатывали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина («Sigma Inc.») в фосфатном буфере в течение 15 мин при комнатной температуре. Коннексин-43 на ультратонких срезах выявляли непрямым методом. В качестве первичных антител использовали те же поликлональные кроличьи антитела к коннексину-43 («Diagnostic BioSystems»), что и при ИГХИ. Сеточки со срезами инкубировали в растворе указанных антител на фосфатном буфере (1:100) в течение 1 ч и отмывали в 0,05% растворе твина-20 в фосфатном буфере. В качестве вторичных антител использовали антитела козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с коллоидным золотом диаметром 10 нм («Sigma»; разведение 1:100, инкубация в течение 1 ч). После проведения иммунной реакции сетки со срезами отконтрастировали в спиртовом растворе уранил-ацетата и водном растворе цитрата свинца. Электронно-микроскопическое исследование срезов выполняли на микроскопе JEOL JEM 1011. Цифровые электронные микрофотографии получены с использованием камеры Morada («Digital Imaging Solutions Inc.»). Морфометрический анализ осуществляли на анализаторе изображения Leica Application Suite V 4.5.0 и Image J 1.48v. Статистическую обработку проводили с помощью программы Statictica v.10. Различия между группами (t-тест и непараметрическое сравнение) считали достоверными при p<0,05.

При традиционном гистологическом исследовании в основной группе и группе сравнения миометрий преимущественно представлен гипертрофированными ГМК, плотно прилегающими друг к другу. В отдельных полях зрения отмечали увеличение расстояния между ГМК за счет отека стромы. В обеих группах в строме миометрия отмечали лимфоцитарный инфильтрат, при этом в основной группе количество лимфоцитов было больше (7—15 на 1 мм², в группе сравнения 3—5 на 1 мм²). ИГХИ показало, что в группе рожениц с СД средняя относительная площадь экспрессии коллагена I типа 3,7±2,8%, коллагена III 14,7±2,2%, фибронектина 29,2±15% (см. таблицу). Количество коллагенов I и III типов меньше, чем в группе сравнения (соответственно p=0,003, p=0,04; рис. 1); соотношение коллагена составило 1:4, при этом в группе сравнения соотношение было 2:1. Площадь экспрессии фибронектина в исследуемых группах достоверно не различалась. Экспрессия фибулина-5 в строме имела очаговый характер; средняя относительная площадь экспрессии составила 2,6±1,9%, что было достоверно меньше, чем в группе сравнения (p<0,01). Уровни экспрессии MMP 1 и 9 в основной группе и в группе сравнения не отличались. Экспрессия TIMP-1 наблюдалась только в 25% случаев на ГМК (1 балл), при этом в группе сравнения она также отмечалась на ГМК, но уровень ее был выше (2—3 балла). Экспрессия коннексина-43 у женщин с СД имела очаговый характер с участками полного отсутствия антигена; ее средняя относительная площадь составила 1,7±2,4%, что меньше, чем в группе сравнения (p<0,01; рис. 2). При этом коннексин-43 определялся не только на ГМК, но и на клетках и волокнах стромы.

Таким образом, в миометрии нижнего сегмента матки при СД отмечается снижение экспрессии коннексина-43, фибулина-5, TIMP-1, коллагена I и III типов с преобладанием коллагена III типа, а уровень экспрессии фибронектина и MMP 1, 9 не изменяется.

При традиционном гистологическом исследовании вены миометрия в основной группе и группе сравнения не различались, характеризовались резко выраженным расширением просвета и полнокровием. При ИГХИ вен миометрия в группе СД экспрессия коллагена I типа составила 1,1±2,4%, коллагена III типа — 22,6±0,3%, фибронектина — 10,1±2,9%, что статистически достоверно меньше, чем в группе сравнения. Также отмечалось изменение отношения коллагена межклеточного матрикса миометрия и вен: в строме в группе сравнения коллаген I: коллаген III 2:1, при СД 1:3; в венах в группе сравнения 1:1, при СД 1:21. В группе СД экспрессия коллагена I типа в венах не отличалась от экспрессии в строме миометрия, при этом коллагена III типа в венах в 1,5 раза больше, чем в строме (p=0,003). Экспрессия фибулина-5 в венах 14,2±1,4%, что было больше, чем в строме (p<0,01), и меньше, чем в группе сравнения (p<0,01).

Таким образом, в венах при СД отмечается уменьшение содержания коллагена I и III типов, количество коллагена III больше, чем коллагена I; снижается экспрессия фибулина-5, при этом его больше в венах, чем в строме.

Электронно-микроскопический анализ обнаружил, что ГМК миометрия рожениц в группе сравнения имеют в целом удлиненную, близкую к веретеновидной, форму (рис. 3, а). На периферии клеток обнаруживали небольшие пальцевидные цитоплазматические выросты (см. рис. 3, б). Цитоплазма ГМК заполнена большим количеством миофибрилл. На плазматической мембране данных клеток обнаруживали множество мелких округлых инвагинаций — кавеол. ГМК заключены в соединительнотканную строму, в составе которой присутствовали пучки коллагеновых и эластических волокон (см. рис. 3, в). Данная строма обеспечивает механическое взаимодействие между соседними ГМК. В частности, на концах соседних клеток обнаруживали массивные электронно-плотные полудесмосомы, с которыми ассоциировалась тонкая прослойка волокнистого внеклеточного матрикса. Очевидно, такая структура обеспечивает согласование сократительного усилия между двумя данными клетками. Следует подчеркнуть, что ГМК связаны друг с другом множеством межклеточных контактов различного типа: полудесмосом и десмосом (обеспечивают механическое взаимодействие клеток друг с другом) и щелевых контактов (выполняют регуляторную функцию). Десмосомы характеризовались наличием массивных электронно-плотных бляшек с цитоплазматической стороны контактирующих клеток и шириной щели между контактирующими мембранами 20—40 нм (см. рис. 3, г). Щелевые контакты имели значительно меньший размер по сравнению с десмосомами, они сформированы в основном между пальцевидными выростами соседних ГМК и обеспечивают тесное сближение мембран на 2—4 нм. В составе соединительнотканной стромы миометрия обнаруживали отростчатые интерстициальные клетки, между отростками которых также выявляли щелевые контакты. По-видимому, щелевые контакты между интерстициальными клетками наряду со щелевыми контактами между ГМК обеспечивают проведение сигналов между ними и способствуют согласованию сократительной активности миометрия при родовой деятельности.

При электронной микроскопии миометрия пациенток с СД обнаружено, что данная патология выражается в резком снижении количества межклеточных контактов (как десмосом, так и щелевых контактов) между ГМК миометрия по сравнению с группой сравнения (рис. 4). Электронная иммуноцитохимия выявила крайне редкие немногочисленные области коннексинпозитивных щелевых контактов, при этом большинство мембран как ГМК, так и интерстициальных клеток, в том числе и телоциты, не содержали коннексин-43 (рис. 5).

По мнению многих авторов, важную роль играет межклеточный матрикс, который представлен коллагеновыми, эластичными волокнами и аморфным веществом [5]. Именно с ним связывают возрастное ремоделирование миометрия [6]. Например, в постменопаузе наряду с атрофией ГМК отмечаются фиброзные изменения, которые начинаются преимущественно вокруг сосудов. Но наиболее важные процессы ремоделирования соединительной ткани определяются при беременности и родах. В последнее время все больше внимания уделяется роли внеклеточного матрикса, механотрансдукции и межклеточному взаимодействию в матке [7]. Ранний этап беременности в большей мере характеризуется гиперплазией ГМК, а также и возможной дифференцировкой миофибробластов в зрелые ГМК, что сопровождается увеличением клеточности миометрия без изменения межклеточного пространства [8]. В дальнейшем с развитием плода происходят кардинальные изменения в фенотипе ГМК. Явления гиперплазии уменьшаются, клетки увеличиваются в размере за счет длины и диаметра — происходит гипертрофия ГМК. Именно гипертрофированная ГМК синтезирует основные белки межклеточного матрикса, тем самым увеличивая объем межклеточного пространства. Эти феноменальные реакции играют важную роль в образовании соединительнотканного каркаса, который плотно связывает клетки между собой, создавая тем самым «функциональный синцитий», предназначенный для проведения электрического импульса и синхронизации деятельности мышечных элементов [9]. В настоящее время главным белком координации сокращения ГМК считается коннексин-43, экспрессия которого выявляется не только на миоцитах, но и в межклеточном матриксе, на клетках стромы, включая фибробласты и телоциты (клетки Кахаля) [10]. Последние считаются клетками-пейсмекерами [11]. В нашем исследовании при электронной микроскопии и электронной иммуноцитохимии миометрия у пациенток с СД выявлено не только уменьшение количества межклеточных контактов, но и резко выраженное снижение/отсутствие экспрессии коннексина-43 на ГМК и телоцитах, что подтверждалось иммуногистохимическим анализом на световом уровне. По нашему мнению, отсутствие достаточного количества как механических контактов (десмосом), так и регуляторных щелевых контактов в миометрии при СД приводит к невозможности нормального сокращения матки при родах и сопровождающей данную патологию слабости родовой деятельности.

Немаловажную роль в формировании межклеточного контакта играет фибронектин, который синтезируется самой ГМК [12]. Он способствует клеточной адгезии, а именно «склеиванию» клетки и межклеточного матрикса. Посредством такого белкового взаимодействия формируется важный путь передачи информации от клетки к клетке. Уровень фибронектина при слабости родовой деятельности в нашем исследовании достоверно не изменялся. Наиболее вероятно, что этот белок не играет существенной роли в изменении стромы матки при СД.

Важным звеном межклеточной структурной сети является и эластин, обеспечивающий матке возможность увеличения в размере и сокращения. Коллагеновые волокна в свою очередь составляют стационарный каркас и деградируют ко времени родов, что обусловлено активным участием матричных металлопротеиназ и их ингибиторов, но при этом количество данных белков сбалансировано, а значит и процесс ремоделирования контролируемый [13].

В нашей работе у женщин с СД определяли снижение содержания коллагена I и III типов, при этом изменялось их соотношение по сравнению с группой сравнения. Аналогичные изменения содержания коллагена при данной патологии отмечаются и в других органах [14]. При отсутствии изменения уровня экспрессии ММР 1 и 9 обнаружили снижение экспрессии их ингибитора TIMP-1, что свидетельствует о дисбалансе процесса расщепления и лизиса коллагеновых волокон во время родов у женщин с С.Д. Также определялось и снижение экспрессии белка, ответственного за формирование эластических волокон — фибулина-5. Нарушение эластогенеза, несомненно, сказывается на равномерности мышечного сокращения матки.

В подтверждение системности поражения соединительной ткани обнаружили однотипные изменения как в строме, так и в венах миометрия. Подобные патологические находки описаны и F. Chieh-Min [15], который считает, что в основе варикозного расширения вен лежит не изменение клапанного аппарата, а наследственный дефект соединительной ткани.

Таким образом, при слабости родовой деятельности мы обнаружили изменения соединительной ткани в матке, характерные для СД.

СД в миометрии женщин со слабостью родовой деятельности проявляется уменьшением экспрессии фибулина-5, ингибитора матричных металлопротеиназ I типа, коллагена I и III типов с преобладанием последнего, а также снижением межклеточных контактов и коннексина-43 на компонентах стромы, ГМК и телоцитах.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.Б.М., П.В.К.

Сбор и обработка материала: П.В.К., Ф.А.О., А.Н.Г.

Статистическая обработка: П.В.К.

Написание текста: П.В.К.

Редактирование: Л.Б.М.

Конфликт интересов отсутствует.