Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Осколкова С.А.

ФГБНУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского», Москва, Россия

Полякова В.О.

НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Крылова Ю.С.

Иванова А.Г.

отделение патологоанатомическое I

Абрамян А.В.

ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского», Москва, Россия

Гавриленко А.В.

ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского», отделение хирургии сосудов, Москва, Россия; кафедра госпитальной хирургии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия

Структура стенки внутренней сонной артерии при патологической извитости

Журнал: Архив патологии. 2015;77(5): 3-8

Просмотров : 78

Загрузок : 4

Как цитировать

Пальцева Е. М., Осколкова С. А., Полякова В. О., Крылова Ю. С., Иванова А. Г., Абрамян А. В., Гавриленко А. В. Структура стенки внутренней сонной артерии при патологической извитости. Архив патологии. 2015;77(5):3-8.
Pal'tseva E M, Oskolkova S A, Poliakova V O, Krylova Iu S, Ivanova A G, Abramyan A V, Gavrilenko A V. The structure of the internal carotid artery wall in pathological tortuosity. Arkhiv Patologii. 2015;77(5):3-8.
https://doi.org/10.17116/patol20157753-8

Авторы:

Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Все авторы (7)

Патологическая извитость (ПИ) внутренних сонных артерий (ВСА) является второй по частоте причиной развития симптомов сосудисто-мозговой недостаточности, уступая лишь атеросклеротическим поражениям магистральных артерий головы [1]. ПИ ВСА встречается у 5—7% взрослого населения [2—4]. Этиология возникновения таких изменений до сих пор окончательно не выявлена, большинство авторов считают, что извитость сонных артерий является результатом врожденных [5, 6] или приобретенных факторов (артериальная гипертония, атеросклероз, старение) [7—9].

Общепринятой классификации ПИ ВСА не существует. Наибольшее распространение получила классификация патологических форм ВСА, предложенная J. Weibel и W. Fields [10, 11]. Авторы выделяют три типа деформации ВСА, обозначая их как извитость (tortuosity), петлеобразование (coiling) и перегиб артерий (kinking). Петлеобразование характеризуется врожденной круговой деформацией с образованием петли, которая может приводить к нарушению мозгового кровообращения. Под извитостью понимается S- или C-образная деформация ВСА без острых углов и видимых нарушений кровотока. Перегиб представляет собой приобретенное, гемодинамически значимое углообразование ВСА со стенозированием ее просвета (угол перегиба ВСА менее 90°) [12]. Последние два типа развиваются вследствие атеросклероза и фиброзно-мышечной дисплазии стенки артерии [13].

При ПИ ВСА, в основе которой лежит фиброзно-мышечная дисплазия, в интиме артерии отмечается неравномерная гиперплазия c пролиферацией гладкомышечных клеток. В медиальной оболочке выявляются фрагментация эластических волокон, развитие фиброзной соединительной ткани, дистрофия коллагеновых волокон и гладкомышечных клеток [14, 15]. Ведущим морфологическим признаком фиброзно-мышечной дисплазии является нарушение формирования эластических волокон: неравномерное утолщение, расщепление, фрагментация, а также существование молодых, незрелых эластических структур с одновременным неправильным формированием гладкомышечных структур в средней оболочке артерии, их беспорядочной ориентацией, гипертрофией и атрофией, с изменениями тинкториальных свойств цитоплазмы и признаками функциональной активности их ультраструктур, с постепенным количественным уменьшением гладких мышечных клеток наряду с нарастанием процессов фиброза [16]. В адвентиции выявляется фиброз с наибольшей выраженностью по малой кривизне ПИ ВСА, который фиксирует артерию в изогнутом положении [14, 15].

Эластин и коллагены играют центральную роль в определении механических свойств стенки сосуда, обеспечивая прочность при его растяжении. Это достигается с помощью трехмерной сети окончатых эластических мембран средней оболочки артерий, между которыми расположены веретенообразные гладкомышечные клетки и коллагеновые волокна. Высокое содержание коллагеновых фибрилл, прежде всего коллагена I и III типов, в адвентиции также способствует предотвращению разрыва сосудов при высоком артериальном давлении. Процессы повышения жесткости сосудов, обусловленные снижением содержания эластина и увеличением коллагена в стенках сосудов, происходят при различных патологических процессах. Низкое содержание эластина приводит к пролиферации гладкомышечных клеток, уменьшению просвета сосуда и появлению стеноза. Снижение содержания коллагена III типа приводит к хрупкости сосудов и склонности к разрыву крупных артерий. Гладкомышечные клетки выполняют контрактильную и синтетическую функции, продуцируя коллаген и эластин, цитокины и протеазы. Изменение их количества и превалирование синтетической функции над контрактильной приводят к нарушению нормального соотношения компонентов внеклеточного матрикса [17].

Несмотря на активные работы в области изучения ПИ ВСА, на сегодняшний день не существует единой теории возникновения данной патологии и остаются неизученными изменения структуры стенки артерии. Целью данной работы было исследование экспрессии эластина, коллагена I и III типов, матриксной металлопротеиназы 9 (ММП-9) и содержания гладкомышечных клеток в стенке внутренней сонной артерии при ПИ, возникающей на фоне фиброзно-мышечной дисплазии, с использованием иммуногистохимического (ИГХ) метода и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Материал и методы

Проведено исследование образцов артерий 58 пациентов, проходивших хирургическое лечение по поводу ПИ ВСА. При морфологическом исследовании у 34 (59%) пациентов выявлено атеросклеротическое поражение сонных артерий, у 15 (26%) — фиброзно-мышечная дисплазия стенки артерии и у 9 (15%) — ее сочетание с атеросклерозом, т. е. ПИ ВСА наиболее часто развивалась на фоне атеросклеротического поражения артерий (р=0,03).

Для ИГХ-исследования отобран материал с фиброзно-мышечной дисплазией и с сочетанным поражением, в образцах которого имелись достаточные для оценки результатов участки дисплазии (n=21, мужчин — 3, женщин — 18, средний возраст 56,67±10,61 года). Контрольную группу составили 11 образцов внутренних грудных артерий (мужчин — 7, женщин — 4, средний возраст 59,27±8,27 года), полученных при операции маммарокоронарного шунтирования. Для анализа результатов пациенты были поделены на группы в зависимости от возраста: молодой возраст — 25—44 года, средний — 45—59 лет и пожилой возраст — 60—75 лет. По типам извитости материал был разделен следующим образом: с петлеобразованием (coiling) и перегибом (kinking) — по 4 (19%) образца, с C-образной деформацией ВСА — 3 (14%) образца и с S-образной деформацией — 10 (48%).

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и после гистологической проводки заливали в парафин. Для гистологического исследования срезы толщиной 3—4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, а также применяли комбинированную окраску фукселином и пикрофуксином.

Для ИГХ-исследования срезы толщиной 3—4 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла («Gerhard Menzel GmbH»). Депарафинирование и ИГХ-исследование проводилось по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica»). Использовали первичные антитела к эластину (клон 10В8, «Abcam», разведение 1:400), коллагену I типа (клон 3G3, «Abcam», разведение 1:200), коллагену III типа (клон Col-29, «Abcam», разведение 1:100) и гладкомышечному актину (SMA, клон 1A4, «Dako», разведение 1:400). В каждой серии препаратов использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли. Срезы докрашивались гематоксилином. Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Результаты иммунопероксидазной реакции оценивали полуколичественным методом: (–) — отсутствие экспрессии, (+)  — слабая, (++) — умеренная, (+++) — выраженная интенсивность иммунопероксидазной реакции. Для анализа данных типы экспрессии объединили в 2 группы: низкая (–, + для коллагена III типа и +, ++ для остальных маркеров) и высокая (++ для коллагена III типа и +++ для остальных маркеров) экспрессия. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру («Leica»).

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Исследование проводили на тонких депарафинизированных и дегидратированных срезах (2—4 мкм) с парафиновых блоков. Температурную демаскировку антигенов проводили с использованием 0,01 М цитратного буфера, рН 6,0, под давлением. Для промывки использовался фосфатносолевой буфер с твином-20. Срезы инкубировали в течение 30 мин с блокирующей сывороткой при комнатной температуре. После промывки наносили первые первичные антитела к ММП-9 (клон 439, «Novocastra», разведение 1:80) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали Alexa fluor 647, «Abcam». После дополнительной отмывки образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со вторыми первичными антителами к эластину (клон 10В8, «Abcam», разведение 1:400). В качестве вторичных антител использовали Alexa fluor 488, «Abcam». После отмывки срезы докрашивали DAPI, appliChem. Все образцы заключали в монтирующую среду DACO. Результат: первые антитела — красная флюоресценция; вторые антитела — зеленая флюоресценция; двойное окрашивание — голубая флюоресценция; контрастированное ядро — синяя флюоресценция. Исследование образцов проводили на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Olympus FV1000D. Для изучения объектов получали спектры флюоресценции и определяли количественные характеристики. Проводили измерение двух параметров — относительную площадь экспрессии и площадь колокализации. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Флюоресценцию с определенными спектральными характеристиками регистрировали только в плоскости (2D).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программного обеспечения SPSS Statistics 17.0 for Windows. Достоверность различий между сравниваемыми группами (р) определяли с помощью критерия χ2 и точного метода Фишера. Для всех проведенных анализов различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение

При гистологическом исследовании ВСА с фиброзно-мышечной дисплазией выявляли утолщенную интиму, нарушение структуры средней оболочки с фрагментацией эластических волокон, беспорядочным расположением коллагеновых волокон, формированием фиброзных разрастаний, местами отмечали деструкцию внутренней эластической мембраны.

При исследовании ИГХ-методом в контрольной группе у большинства пациентов (63,5%) отмечали низкую экспрессию эластина в медиальной оболочке артерий и лишь у 36,5% больных — высокую экспрессию (рис. 1, а). В то время как при ПИ ВСА содержание эластиновых волокон в медии было выше (у 81% — высокая экспрессия, у 19% — низкая; р=0,03), но выявляли их фрагментацию (см. таблицу, рис. 1, б).

Экспрессия эластина, коллагена I и III типов, гладкомышечного актина при ПИ ВСА и в контрольной группе (абс. %)

Рис. 1. Экспрессия эластина, коллагена I и III типов и гладкомышечного актина при патологической извитости сонных артерий и в контрольной группе. а — высокая экспрессия эластина в медиальной оболочке внутренней грудной артерии у пациента контрольной группы. ×200; б — высокое содержание эластина в медии внутренней сонной артерии при ее патологической извитости; видна фрагментация эластиновых волокон. ×200; в — слабая экспрессия коллагена I типа в медиальной оболочке при патологической извитости сонной артерии. ×100; г — слабая экспрессия коллагена III типа в медиальной оболочке при патологической извитости сонной артерии. ×100; д — высокая экспрессия гладкомышечного актина во внутренней сонной артерии при ее патологической извитости. ×100; е — высокая экспрессия гладкомышечного актина в медиальной оболочке внутренней грудной артерии у пациента контрольной группы. ×200; а—е — иммуногистохимическая реакция.

Содержание коллагена I типа в средней оболочке стенки артерий было примерно одинаковым в обеих группах: в большинстве случаев отмечалась низкая экспрессия (90% при ПИ и 91% в контрольной группе; р>0,05) (см. рис. 1, в). Сопоставление экспрессии коллагена III типа также не показало достоверных различий между группами (р>0,05). У пациентов с ПИ в группе сравнения превалировала низкая экспрессия данного маркера — 90 и 73% соответственно (см. рис. 1, г). При этом в адвентиции содержание обоих типов коллагена было высоким как при ПИ, так и в контрольной группе.

Сравнение содержания гладкомышечных клеток выявило достоверные различия между группами (р=0,01): при ПИ ВСА низкую и высокую экспрессию гладкомышечного актина отмечали примерно в одинаковом количестве случаев (54 и 47% соответственно), в то время как в контрольной группе во всех образцах обнаружена его высокая экспрессия (100%) (см. рис. 1, д, е).

Поиск корреляций экспрессии каждого из четырех маркеров с полом и возрастом ни при ПИ ВСА, ни в контрольной группе зависимости не выявил (р>0,05). Ассоциации показателей экспрессии изучаемых маркеров с типом патологической извитости также не найдены (р>0,05).

Таким образом, выявлено, что при ПИ ВСА отмечается нарушение эластических свойств сосуда за счет разрушения эластических волокон, что согласуется с данными других авторов [14, 16]. При этом содержание коллагена I и III типов как в медиальной оболочке, так и в адвентиции остается неизменным. Уменьшение количества гладкомышечных клеток может приводить как к ухудшению механических свойств артерии, так и к нарушению синтеза ими компонентов внеклеточного матрикса. В работе G. La Barbera [15] также продемонстрировано уменьшение количества эластических волокон и гладкомышечных клеток.

При исследовании методом конфокальной микроскопии уровня экспрессии ММП-9, разрушающей эластин, и эластина в контрольной группе получены следующие значения: экспрессия ММП-9 составила 4,3±0,69; эластина — 16,2±1,48 (рис. 2, а). В группе ПИ ВСА выявлена экспрессия ММП-9 26±1,26; эластина 9,1±0,36 (см. рис. 2, б). При сравнении экспрессии ММП-9 и эластина между группами выявлены достоверные различия (p<0,03 для ММП-9; р<0,05 для эластина). При этом отмечалась коэкспрессия данных маркеров в 16,9% случаях, т. е. в группе контроля наблюдался высокий уровень экспрессии эластина и низкий уровень экспрессии протеиназы, и, напротив, в группе ПИ — низкое содержание эластина и высокое — протеиназы. Таким образом, при ПИ ВСА происходит разрушение эластина матриксной ММП-9.

Рис. 2. Экспрессия ММП-9 и эластина при патологической извитости сонных артерий и в контрольной группе. Иммунофлюоресценция. а — ММП-9 — красная флюоресценция 4,3%; эластин — зеленая флюоресценция 16% в контрольной группе. ×400; б — ММП-9 — красная флюоресценция 26%; эластин — зеленая флюоресценция 9% при патологической извитости. ×400.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что одной из причин возникновения ПИ является нарушение эластических свойств сосуда за счет деструкции эластических волокон и их фрагментации, а также снижения количества гладкомышечных клеток и нарушения их синтетической функции, что обусловливает в свою очередь усиление активности ММП-9 и деградацию тканевого матрикса.

Следует обратить внимание, что в данной работе не использовали все возможности конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, позволяющей исследовать материал не только на плоскости по осям X, Y, но и в объеме по оси Z. Это обусловлено использованием тонких срезов с парафиновых блоков, а не толстых (10—25 мкм) криостатных срезов, позволяющих исследовать искомые антигены в толще, восстанавливая структуру ткани и определяя коэкспрессию и взаиморасположение их на всем протяжении объекта. Эти задачи являются предметом нашего дальнейшего исследования.

Участие авторов:

Дизайн и концепция исследования: А.В.Г.

Сбор и обработка материала: С.А.О., А.Г.И., А.В.А., Е.М.П.

Статистическая обработка данных: Ю.С.К., В.О.П.

Написание текста статьи: Е.М.П., С.А.О., В.О.П.

Редактирование: А.В.Г.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail