Аксененко М.Б.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, Российская Федерация

Бекузаров С.С.

Красноярское краевое патологоанатомическое бюро, Красноярск, 660022, Российская Федерация

Рукша Т.Г.

ГОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого

Определение мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи: клинико-морфологические особенности

Журнал: Архив патологии. 2014;76(5): 38-43

Просмотров : 1070

Загрузок : 28

Как цитировать

Аксененко М. Б., Бекузаров С. С., Рукша Т. Г. Определение мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи: клинико-морфологические особенности. Архив патологии. 2014;76(5):38-43.
Aksenenko M B, Bekuzarov S S, Ruksha T G. BRAF V600E mutation detection in melanoma patients: Clinical and morphological features. Arkhiv Patologii. 2014;76(5):38-43.

Авторы:

Аксененко М.Б.

ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава России, 660022 Красноярск, ул. Партизана Железняка, д. 1, Российская Федерация

Все авторы (3)

Меланома кожи является новообразованием, развивающимся в результате злокачественной трансформации меланоцитов и меланобластов [1, 2]. Исследования последних лет в области эпидемиологии меланомы кожи установили четкий рост заболеваемости меланомой в разных странах мира, в том числе и в России [3], что делает чрезвычайно актуальной проблему повышения эффективности ее лечения. Молекулярно-биологические исследования клеток меланомы определили, что при меланоме кожи наблюдается более 40 различных точковых мутаций в ключевом онкогене BRAF [4]. В 40-60% случаев меланома кожи ассоциирована с мутациями онкогена BRAF (локализация в геноме клетки 7q34), следствием которых является конститутивная активация серинтреониновой киназы BRAF и соответственно митогенного сигнала по пути MAPK/ERK [5]. Около 90% таких мутаций приводит к замене глутамата на валин в кодоне 600 (BRAF V600E); известны и другие активирующие BRAF-мутации (например, BRAF V600K, BRAF V600R) [6]. Одним из наиболее значимых достижений молекулярной медицины последних десятилетий явилось определение у пациентов с меланомой кожи молекулярно-генетических подтипов и выявление разных механизмов развития меланомы кожи, что позволило избирательно подходить к лечению пациентов с таким заболеванием. Вместе с тем это привело к появлению новых нерешенных проблем. Во-первых, отсутствует терапия BRAF-негативной меланомы кожи. Во-вторых, несмотря на хорошие результаты проводимой таргетной терапии у пациентов с BRAF-позитивной меланомой, спустя 2-18 мес после применения BRAF-ингибиторов, развивается резистентность к данному виду лечения с быстрым дальнейшим прогрессированием заболевания. Вместе с тем продукт гена BRAF является наиболее доказанной молекулярной мишенью при лечении меланомы кожи, и таким образом является оправданным дальнейшее разъяснение механизмов развития меланомы кожи, формирования особенностей инвазивного роста, метастазирования в зависимости от присутствия или отсутствия мутации вышеуказанного гена.

Цель - оценить частоту мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи и ассоциацию с клинико-морфологическими характеристиками заболевания.

Материал и методы

Анализ данных историй болезней пациентов с меланомой кожи осуществлялся на базе КГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер». Биоптаты больных с меланомой кожи (n=71) получены в КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Перед выделением ДНК стекла с материалом, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на предмет содержания опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем проводили выделение геномной ДНК с помощью набора FFPET DNA-Extraction Kit («Биолинк», Россия). Анализ мутации BRAF V600E осуществляли методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. На первом этапе осуществлялась нормализация концентрации ДНК к концентрации ДНК в отрицательном стандарте: оптимальной является концентрация ДНК в образце, при которой Ct неизвестных образцов в контрольной реакции отличалась от Ct ДНК контроля не более чем на 2 цикла.

Контрольная реакция проводится для оценки пригодности образцов ДНК для дальнейшего анализа. Определение концентрации ДНК по оптической плотности при длине волны 260 нм не позволяет выбрать концентрацию, оптимальную для BRAF-теста. Причинами могут быть частичная деградация или химические модификации ДНК, возникшие при фиксации ткани, которые могут ингибировать или снижать эффективность ПЦР. Качество и количество ДНК оценивается по величине Ct, которая соответствует количеству циклов ПЦР, при которых кривая флюоресценции пересекает заданный уровень фона. Различные разведения образцов ДНК сравниваются в контрольной ПЦР с ДНК отрицательного стандарта. Для дальнейшей аллель-специфичной ПЦР выбирают разведение образца ДНК, которое имеет наиболее близкую величину Ct относительно отрицательного ДНК-стандарта.

На этом этапе выбранные разведения ДНК тестируют в аллель-специфичной ПЦР. Для этого используют праймеры, специфичные к мутации V600E в гене BRAF. ДНК BRAF дикого типа (без мутации) амплифицируется в тех же условиях с увеличением Ct на 5 циклов, что позволяет отличать ее от мутантной. Для нормировки результатов все образцы тестируют в реакции с контрольной смесью, также в каждый эксперимент включают ПЦР с положительным стандартом и контролем без матрицы.

Для всех образцов ДНК результаты ПЦР для мутации BRAF представляют в виде: dCt = CtAS – CtC, где CtAS - среднее Ct образца ДНК в ПЦР-специфичной к мутации BRAF, CtC - среднее Ct того же образца ДНК в контрольной ПЦР. Затем dCt образца сравнивают с dCt-положительного стандарта, содержащего 1% ДНК с мутацией. Образец является положительным (содержащим мутацию), если dCt образца равно или меньше dCt-положительного стандарта. Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации менее 1%), если dCt образца больше dCt-положительного стандарта.

Проверку нормальности распределения выборки проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. При р<0,05 различия признавались статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Анализ частоты встречаемости мутации V600E гена BRAF у больных с меланомой кожи выявил наличие данной мутации у 40,84% пациентов, в 59,16% случаев данный вид мутации не определялся (рис. 1, а, б).

Рисунок 1. Детекция мутации V600E гена BRAF методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. а - контрольная ПЦР.
Рисунок 1. Детекция мутации V600E гена BRAF методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. б - ПЦР BRAF V600E; ДНК с мутацией (красная линия); ДНК без мутации (синяя линия).
Не было выявлено значимых различий между полом пациентов в зависимости от BRAF-статуса (p>0,05) (табл. 1).
В литературе имеются данные о том, что мутация гена BRAF чаще встречается у женщин [7]. В свою очередь в исследованиях J. Ellerhorst и соавт. [8] также не было выявлено различий по полу и возрасту между пациентами с меланомой кожи в зависимости от их мутационного статуса по BRAF. Средний возраст всей выборки больных составил 58,97±14,15 года. Минимальный возраст пациентов с BRAF-положительным статусом составил 34 года, а максимальный возраст - 77 лет. У пациентов с отрицательным статусом он составил 26 и 88 лет соответственно. Средний возраст манифестации меланомы кожи у пациентов, имеющих мутацию, был меньше, чем у пациентов, которые не имели данной мутации (см. табл. 1). При этом в исследовании, проводимом W. Liu и соавт. [9], было выявлено, что мутация гена BRAF V600E чаще встречается у пациентов в возрасте моложе 50 лет по сравнению с пациентами старше 50 лет, несмотря на то что возраст пациентов с наличием мутации в данном исследовании был меньше, подобной тенденции не наблюдалось. Таким образом, можно отметить, что наблюдается тенденция к наличию BRAF-позитивных меланом кожи у лиц более молодого возраста (табл. 2).
Преимущественной локализацией у BRAF-позитивных пациентов была кожа туловища 44,8%, у пациентов с отрицательным BRAF-статусом данная локализация также являлась преимущественной и составляла 40,4%. Известно, что анатомическая локализация меланомы кожи является одним из прогностических факторов. В частности, установлено, что опухоли, расположенные на туловище, а также в области головы и шеи, имеют более неблагоприятный прогноз по сравнению с опухолями, расположенными на конечностях. Опухоли нижней части туловища отличаются лучшим прогнозом, чем верхней [10].

В настоящем исследовании выявлено значимое увеличение количества пациентов, имеющих отрицательный BRAF-статус, с локализацией опухоли на верхних конечностях, включая пальцы кисти. Толщина первичной опухоли по Бреслоу в данной выборке варьировала от 0,1 до 8,5 мм, в большинстве случаев она находилась в диапазоне 2,01-4,0 мм. При этом преобладали пациенты, не имеющие изучаемой мутации. Почти в половине случаев (43,6%) уровень инвазии по Кларку был равен 3 и присутствовало изъязвление опухоли (54,9%), при этом не было выявлено различий между изучаемыми группами по данному признаку (p=0,16). Наиболее часто встречались поверхностно-распространяющаяся меланома (ПРМ) - 54,9% (рис. 2)

Рисунок 2. Поверхностно-распространяющаяся меланома. Цитологическая характеристика: клеточная атипия, ядерная атипия, гиперхромия ядер. Здесь и на рис. 3-5: окраска гематоксилином и эозином. ×400.
и узловая меланома (УМ) - 28,1%. Гистологический подтип меланомы кожи является одним из прогностических признаков, но, как правило, не рассматривается как самостоятельный признак. Известно, что наилучшим прогнозом обладают меланомы, представленные веретенообразными клетками. При оценке гистологического подтипа исследуемых опухолей преимущественным был смешанно-клеточный вариант (55,7%). При этом выявлено, что эпителиоидно-клеточный вариант меланомы значительно преобладал у людей, не имеющих данную мутацию (p<0,05). Не было установлено различий по содержанию пигмента в зависимости от BRAF-статуса (p>0,05). У 71 пациента, включенного в исследование, преобладали следующие стадии по классификации AJCC: IIb (28,5%) и IIa (22,8%). При оценке TILs-статуса (tumor infiltrating lymphocytes status) большую часть составили пациенты с TILs-статусом по типу Brisk (рис. 3)
Рисунок 3. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Brisk. Лимфоциты проникают между опухолевыми клетками.
, при этом не было выявлено статистически значимых различий среди пациентов, имеющих лимфоцитарный инфильтрат по типу Non Brisk (рис. 4)
Рисунок 4. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Non Brisk. Лимфоциты образуют фокальные очаги вблизи опухоли, между клетками не проникая (на фото представлен фокальный очаг).
и Absent (рис. 5).
Рисунок 5. Лимфоцитарный инфильтрат по типу Absent. Лимфоциты отсутствуют в опухолевом узле.
Известно, что отсутствие TILs в опухолях толщиной 3,65 мм и больше по Бреслоу служит отрицательным прогностическим признаком выживаемости больных и положительным в отношении вероятности возникновения висцеральных и кожных метастазов [11]. В исследовании данная категория пациентов составила 12,6%.

Таким образом, резюмируя данную работу, можно отметить, что BRAF-позитивные пациенты в исследуемой выборке характеризуются преимущественным расположением меланомы в области участков тела, не подверженных воздействию ультрафиолетового излучения, и тенденцией к развитию в более молодом возрасте.

Заключение

Одной из приоритетных задач изучения механизмов развития различных онкологических патологий является выявление спектра мутаций и различных вариантов регуляции экспрессии генов как в норме, так и при развитии злокачественных новообразований. В связи с этим определение наличия или отсутствия мутации V600E в гене BRAF у пациентов с меланомой кожи является важным звеном в оценке биологического поведения опухолевых клеток и реализации ими таких биологически значимых функций, как опухолевая инвазия, метастазирование, неоангиогенез, что имеет значение для дальнейшей оценки опухолевой прогрессии и последующего прогноза течения заболевания.

Исследование выполнено в рамках гранта Фонда Президента РФ для молодых ученых (Т.Г.Р., MД 901.2013.7).

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.Б.А., Т.Г.Р.

Сбор и обработка материала: М.Б.А., С.С.Б.

Написание текста: М.Б.А.

Редактирование: Т.Г.Р., С.С.Б.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail