Меланома кожи является новообразованием, развивающимся в результате злокачественной трансформации меланоцитов и меланобластов [1, 2]. Исследования последних лет в области эпидемиологии меланомы кожи установили четкий рост заболеваемости меланомой в разных странах мира, в том числе и в России [3], что делает чрезвычайно актуальной проблему повышения эффективности ее лечения. Молекулярно-биологические исследования клеток меланомы определили, что при меланоме кожи наблюдается более 40 различных точковых мутаций в ключевом онкогене BRAF [4]. В 40-60% случаев меланома кожи ассоциирована с мутациями онкогена BRAF (локализация в геноме клетки 7q34), следствием которых является конститутивная активация серинтреониновой киназы BRAF и соответственно митогенного сигнала по пути MAPK/ERK [5]. Около 90% таких мутаций приводит к замене глутамата на валин в кодоне 600 (BRAF V600E); известны и другие активирующие BRAF-мутации (например, BRAF V600K, BRAF V600R) [6]. Одним из наиболее значимых достижений молекулярной медицины последних десятилетий явилось определение у пациентов с меланомой кожи молекулярно-генетических подтипов и выявление разных механизмов развития меланомы кожи, что позволило избирательно подходить к лечению пациентов с таким заболеванием. Вместе с тем это привело к появлению новых нерешенных проблем. Во-первых, отсутствует терапия BRAF-негативной меланомы кожи. Во-вторых, несмотря на хорошие результаты проводимой таргетной терапии у пациентов с BRAF-позитивной меланомой, спустя 2-18 мес после применения BRAF-ингибиторов, развивается резистентность к данному виду лечения с быстрым дальнейшим прогрессированием заболевания. Вместе с тем продукт гена BRAF является наиболее доказанной молекулярной мишенью при лечении меланомы кожи, и таким образом является оправданным дальнейшее разъяснение механизмов развития меланомы кожи, формирования особенностей инвазивного роста, метастазирования в зависимости от присутствия или отсутствия мутации вышеуказанного гена.

Цель - оценить частоту мутации BRAF V600E у пациентов с меланомой кожи и ассоциацию с клинико-морфологическими характеристиками заболевания.

Анализ данных историй болезней пациентов с меланомой кожи осуществлялся на базе КГБУЗ «Красноярский краевой онкологический диспансер». Биоптаты больных с меланомой кожи (n=71) получены в КГБУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Перед выделением ДНК стекла с материалом, окрашенные гематоксилином и эозином, оценивали на предмет содержания опухолевых клеток в срезе. В дальнейшем проводили выделение геномной ДНК с помощью набора FFPET DNA-Extraction Kit («Биолинк», Россия). Анализ мутации BRAF V600E осуществляли методом аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени. На первом этапе осуществлялась нормализация концентрации ДНК к концентрации ДНК в отрицательном стандарте: оптимальной является концентрация ДНК в образце, при которой Ct неизвестных образцов в контрольной реакции отличалась от Ct ДНК контроля не более чем на 2 цикла.

Контрольная реакция проводится для оценки пригодности образцов ДНК для дальнейшего анализа. Определение концентрации ДНК по оптической плотности при длине волны 260 нм не позволяет выбрать концентрацию, оптимальную для BRAF-теста. Причинами могут быть частичная деградация или химические модификации ДНК, возникшие при фиксации ткани, которые могут ингибировать или снижать эффективность ПЦР. Качество и количество ДНК оценивается по величине Ct, которая соответствует количеству циклов ПЦР, при которых кривая флюоресценции пересекает заданный уровень фона. Различные разведения образцов ДНК сравниваются в контрольной ПЦР с ДНК отрицательного стандарта. Для дальнейшей аллель-специфичной ПЦР выбирают разведение образца ДНК, которое имеет наиболее близкую величину Ct относительно отрицательного ДНК-стандарта.

На этом этапе выбранные разведения ДНК тестируют в аллель-специфичной ПЦР. Для этого используют праймеры, специфичные к мутации V600E в гене BRAF. ДНК BRAF дикого типа (без мутации) амплифицируется в тех же условиях с увеличением Ct на 5 циклов, что позволяет отличать ее от мутантной. Для нормировки результатов все образцы тестируют в реакции с контрольной смесью, также в каждый эксперимент включают ПЦР с положительным стандартом и контролем без матрицы.

Для всех образцов ДНК результаты ПЦР для мутации BRAF представляют в виде: dCt = CtAS – CtC, где CtAS - среднее Ct образца ДНК в ПЦР-специфичной к мутации BRAF, CtC - среднее Ct того же образца ДНК в контрольной ПЦР. Затем dCt образца сравнивают с dCt-положительного стандарта, содержащего 1% ДНК с мутацией. Образец является положительным (содержащим мутацию), если dCt образца равно или меньше dCt-положительного стандарта. Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации менее 1%), если dCt образца больше dCt-положительного стандарта.

Проверку нормальности распределения выборки проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий определяли с помощью критерия Манна-Уитни. Для оценки качественных признаков применяли точный односторонний критерий Фишера. При р<0,05 различия признавались статистически значимыми.

Анализ частоты встречаемости мутации V600E гена BRAF у больных с меланомой кожи выявил наличие данной мутации у 40,84% пациентов, в 59,16% случаев данный вид мутации не определялся (рис. 1, а, б).

В настоящем исследовании выявлено значимое увеличение количества пациентов, имеющих отрицательный BRAF-статус, с локализацией опухоли на верхних конечностях, включая пальцы кисти. Толщина первичной опухоли по Бреслоу в данной выборке варьировала от 0,1 до 8,5 мм, в большинстве случаев она находилась в диапазоне 2,01-4,0 мм. При этом преобладали пациенты, не имеющие изучаемой мутации. Почти в половине случаев (43,6%) уровень инвазии по Кларку был равен 3 и присутствовало изъязвление опухоли (54,9%), при этом не было выявлено различий между изучаемыми группами по данному признаку (p=0,16). Наиболее часто встречались поверхностно-распространяющаяся меланома (ПРМ) - 54,9% (рис. 2)

Таким образом, резюмируя данную работу, можно отметить, что BRAF-позитивные пациенты в исследуемой выборке характеризуются преимущественным расположением меланомы в области участков тела, не подверженных воздействию ультрафиолетового излучения, и тенденцией к развитию в более молодом возрасте.

Одной из приоритетных задач изучения механизмов развития различных онкологических патологий является выявление спектра мутаций и различных вариантов регуляции экспрессии генов как в норме, так и при развитии злокачественных новообразований. В связи с этим определение наличия или отсутствия мутации V600E в гене BRAF у пациентов с меланомой кожи является важным звеном в оценке биологического поведения опухолевых клеток и реализации ими таких биологически значимых функций, как опухолевая инвазия, метастазирование, неоангиогенез, что имеет значение для дальнейшей оценки опухолевой прогрессии и последующего прогноза течения заболевания.

Исследование выполнено в рамках гранта Фонда Президента РФ для молодых ученых (Т.Г.Р., MД 901.2013.7).

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М.Б.А., Т.Г.Р.

Сбор и обработка материала: М.Б.А., С.С.Б.

Написание текста: М.Б.А.

Редактирование: Т.Г.Р., С.С.Б.