Ефремова Ю.Е.

Лаборатория молекулярной и клеточной кардиологии и отдел ангиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздравсоцразвития России

Андреева Е.Р.

Лаборатория молекулярной и клеточной кардиологии и отдел ангиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздравсоцразвития России

Соболева Г.Н.

Лаборатория молекулярной и клеточной кардиологии и отдел ангиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздравсоцразвития России

Радюхина Н.В.

Лаборатория молекулярной и клеточной кардиологии и отдел ангиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздравсоцразвития России

Белоярцев Д.Ф.

ФГБУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского» РАН, Москва

Карпов Ю.А.

Лаборатория молекулярной и клеточной кардиологии и отдел ангиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздравсоцразвития России

Тарарак Э.М.

Лаборатория молекулярной и клеточной кардиологии и отдел ангиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздравсоцразвития России

Накопление фотосенсибилизатора фотосенса в атеросклеротической бляшке сонной артерии человека in vitro

Журнал: Архив патологии. 2012;74(5): 18-22

Просмотров : 62

Загрузок :

Как цитировать

Ефремова Ю. Е., Андреева Е. Р., Соболева Г. Н., Радюхина Н. В., Белоярцев Д. Ф., Карпов Ю. А., Тарарак Э. М. Накопление фотосенсибилизатора фотосенса в атеросклеротической бляшке сонной артерии человека in vitro. Архив патологии. 2012;74(5):18-22.
Efremova Iu E, Andreeva E R, Soboleva G N, Radiukhina N V, Beloyartsev D F, Karpov Iu A, Tararak É M. In vitro accumulation of the photosensitizer Photosens in the atherosclerotic plaque of the human carotid artery. Arkhiv Patologii. 2012;74(5):18-22.

Авторы:

Ефремова Ю.Е.

Лаборатория молекулярной и клеточной кардиологии и отдел ангиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса Минздравсоцразвития России

Все авторы (7)

С 70-х годов прошлого века фотодинамическую терапию (ФДТ) применяют преимущественно в онкологической практике. В основе данной методики лежит селективное накопление определенными клетками фотосенсибилизатора (ФС), что может быть детектировано при помощи лазерной флюоресцентной спектроскопии. Последующее локальное воздействие низкоинтенсивным лазерным облучением на области, накопившие ФС, ведет к образованию активных форм кислорода, оказывающих цитотоксическое действие, что в конечном счете приводит к гибели клеток [5]. Поскольку опухолевые клетки метаболически более активны, они интенсивнее по сравнению с окружающими тканями накапливают ФС, что обеспечивает гибель этих клеток после лазерного облучения [17]. Позже ФДТ стали применять в офтальмологии, дерматологии, стоматологии и других областях медицины.

Поскольку ФС предпочтительнее связываются с наиболее метаболически активными тканями, было высказано предположение, что они также будут накапливаться в атеросклеротических бляшках (АСБ) артериальной стенки, что в дальнейшем было подтверждено в ряде работ [6, 8, 11]. Это позволило заключить, что метод, основанный на фотодинамической реакции, может быть перспективным в диагностике и лечении атеросклеротических изменений. Благодаря использованию ФДТ для лечения атеросклероза можно добиться уменьшения размера АСБ, например посредством регулирования ее клеточного состава.

Целью данного исследования явилось изучение накопления ФС фотосенса (сульфированный фталоцианин алюминия производства ФГУП ГНЦ «НИОПИК») в АСБ человека, удаленных во время каротидной эндартерэктомии, и идентификация в них типов клеток, накопивших ФС.

Материал и методы

В работе использовали биоптаты сонных артерий, полученные в ходе операции эндартерэктомии от 30 пациентов с атеросклерозом сонных артерий (средний возраст 67 лет), находившихся на лечении в Институте хирургии им. А.В. Вишневского. Биоптаты доставляли в лабораторию в течение 1—2 ч после проведения операции и инкубировали in vitro в среде RPMI 1640 с добавлением 5% сыворотки плода коровы, 50 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мл/л амфотерицина и 10 мл/л L-глутамина и 75 мкг/мл фотосенса в течение 24 ч при 37 °С в атмосфере 95% воздуха и 5% СО2, после чего тщательно отмывали от ФС в физиологическом растворе. После визуальной оценки поражений образцы разрезали на кусочки перпендикулярно длинной оси сосуда. Для дальнейшего анализа было использовано 67 кусочков из 30 бляшек толщиной 1 см. Кусочки замораживали в среде O.C.T. Compound (Tissue Tek, Sakura, Япония) и готовили криомикротомные срезы. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по Ван-Гизону. Атеросклеротические поражения классифицировали по Stary [14] и Virmani [15].

Для идентификации разных типов клеток, присутствующих в АСБ, применяли стрептавидин-биотиновый метод иммуноцитохимического выявления антигенов с использованием специфических моноклональных антител согласно стандартным методикам. Для выявления гладкомышечных клеток (ГМК) использовали маркер гладких мышц α-актин («Dako»; 1:200), для выявления макрофагов — антиген HAM («Dako»; 1:100), а для идентификации лимфоцитов — CD3 («Dako»; 1:100). Ядра клеток докрашивали метиловым зеленым.

Распределение ФС изучали с помощью флюоресцентной микроскопии на неокрашенных, нефиксированных срезах АСБ. Негативным контролем служили срезы бляшек, которые не инкубировали с ФС.

Для световой и флюоресцентной микроскопии использовали флюоресцентный микроскоп Leiса DM5000B (Германия) с ртутной лампой НВО 100АС, оборудованный камерой DC420 для автоматической регистрации изображения, с применением фильтра UV (ВР340-380, LP 425).

Накопление ФС оценивали по интенсивности флюоресценции, которую определяли в различных областях АСБ. Оценку проводили полуколичественным методом по 5-балльной системе. Отсутствие флюоресценции принимали за 0 баллов, 4 балла соответствовали максимальной интенсивности флюоресценции. Промежуточным величинам были присвоены значения 1, 2 и 3 соответственно (рис. 1).

Рисунок 1. Полуколичественная оценка накопления фотосенса в АСБ сонных артерий, удаленных во время эндартерэктомии. Накопление фотосенса оценивали по интенсивности флюоресценции (от 0 до 4 баллов). ×200. а — флюоресценция отсутствует — 0 баллов; б — минимальная интенсивность флюоресценции — 1 балл; в — флюоресценция средней интенсивности — 2 балла; г — интенсивная флюоресценция — 3 балла; д — очень интенсивная флюоресценция — 4 балла.

Анализ клеточного состава выполняли на срезах, параллельных таковым, в которых определяли интенсивность флюоресценции, в аналогичных полях зрения полуколичественным методом. Отсутствие клеток принимали за 0 баллов, от 0 до 5 клеток соответствовали 1 баллу; 2 балла — от 5 до 15 клеток; 3 балла — от 15 до 25 клеток; 4 балла — более 25 клеток.

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 6.0. Для анализируемых качественных порядковых признаков вычисляли медиану (Ме) и процентили распределения — нижний квартиль (LQ) и верхний квартиль (UQ). Достоверность различий величин в группах определяли при помощи непараметрического критерия Манна—Уитни. Анализ корреляции проводили непараметрическим методом Спирмена. Пороговая величина вероятности ошибки была установлена на уровне 0,05.

Результаты

Из 30 проанализированных поражений большинство (n=18) согласно классификации Stary принадлежало к VI типу (осложненное поражение с поверхностным дефектом, кровоизлиянием и/или тромботическими наложениями). По классификации Virmany 11 поражений были охарактеризованы как многослойные, среди них чаще встречалась заживающая эрозия (n=8), 19 АСБ были однослойными (табл. 1).

В результате исследования накопление ФС было выявлено во всех АСБ. Однако интенсивность флюоресценции ФС значительно различалась в разных областях бляшек (табл. 2).

Так, в участках с наибольшим количеством клеточных элементов (плечи, периферические зоны ядра бляшки, покрышка, участки вновь образованной соединительной ткани, области скопления новообразованных сосудов и гематогенных клеток) флюоресценция была интенсивной (рис. 2).
Рисунок 2. Морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика участков накопления фотосенса в АСБ. ×200, а—в, г—е, ж—и — параллельные срезы. а — периферическая зона атеронекротического ядра АСБ, содержащая большое количество клеточных элементов. Окраска гематоксилином и эозином; б — тот же фрагмент. Экспрессия антигена макрофагов HAM (коричневое окрашивание). Стрептавидин-биотиновый метод. Ядра докрашены метиловым зеленым; в — тот же фрагмент. Флюоресценция ФС (красный цвет, интенсивность 4) выявляется в зоне расположения макрофагов. Аутофлюоресценция соединительнотканных волокон голубого цвета, фильтр UV; г — участок плеча АСБ, содержащий большое количество клеток с округлыми ядрами. Окраска гематоксилином и эозином; д — тот же фрагмент АСБ. Экспрессия антигена лимфоцитов CD3 (коричневое окрашивание). Стрептавидин-биотиновый метод. Ядра докрашены метиловым зеленым; е — тот же фрагмент АСБ. Флюоресценция ФС (красный цвет, интенсивность 4), выявляется в области скопления лимфоцитов. Аутофлюоресценция соединительнотканных волокон голубого цвета, фильтр UV; ж — фрагмент покрышки АСБ. Окраска гематоксилином и эозином; з — тот же участок. Экспрессия антигена гладкомышечных клеток α-актина (коричневое окрашивание). Стрептавидин-биотиновый метод. Ядра докрашены метиловым зеленым; и — тот же фрагмент. Флюоресценция ФС (красный цвет, интенсивность 4) выявляется в зоне расположения гладкомышечных клеток. Аутофлюоресценция соединительнотканных волокон голубого цвета, фильтр UV.
В областях атеросклеротического поражения, не содержащих клетки, таких как участки кальциноза, соединительнотканный матрикс, центральная зона атеронекротического ядра, а также внешне неизмененная интима, флюоресценция практически не определялась.

Анализ корреляционной зависимости между количеством клеток определенного иммунофенотипа и интенсивностью флюоресценции ФС продемонстрировал достоверную положительную корреляцию между количеством клеток и интенсивностью флюоресценции в плечах, покрышке и периферических зонах ядра АСБ (см. табл. 2). В остальных областях АСБ достоверная корреляционная зависимость между этими показателями не была обнаружена, что, по-видимому, связано с недостаточным количеством наблюдений внутри каждой области. При объединении данных по всем областям АСБ, содержащим клетки, анализ связи между интенсивностью флюоресценции и количеством клеток показал, что положительная корреляция также существовала между интенсивностью флюоресценции и количеством макрофагов (r=0,51, р<0,05) и лимфоцитов (r=0,5, р<0,05).

При разделении АСБ на стабильные и нестабильные (в соответствии с общепринятыми морфологическими критериями) [4, 7] 18 бляшек оказались нестабильными и 12 стабильными.

При сравнении интенсивности флюоресценции ФС в этих группах обнаружено, что в нестабильных АСБ она была достоверно выше, чем в стабильных, и составила 3 (2—4) и 2 (1—2) балла соответственно (р<0,05).

Обсуждение

Изучение накопления ФС в различных компонентах АСБ является необходимым условием для разработки методов диагностики и ФДТ атеросклероза.

В нашем исследовании было показано, что в отличие от непораженных участков сосудистой стенки ФС селективно накапливается в атеросклеротически измененной интиме. При этом оказалось, что флюоресценция ФС в поверхностных слоях интимы была более интенсивной, чем в медии и адвентиции. Аналогичные данные были получены в работах по изучению накопления различных ФС в аорте кроликов с экспериментальным атеросклерозом [2, 10—12], аутопсийном материале аорты и коронарных артерий человека [3, 6] и образцах артерий (сонные, коронарные, бедренные и подколенные), полученных при эндартерэктомии [8, 9, 13].

Было также продемонстрировано, что в участках АСБ, содержащих наибольшее количество клеточных элементов, происходит преимущественное накопление красителя. Напротив, в участках АСБ, не содержащих клеточные элементы, таких как области кальциноза и соединительнотканный матрикс без клеток, накопление ФС выявлено не было. Наши данные хорошо согласуются с результатами, полученными Р. Gonschior и соавт. [8] при исследовании эндартерэктомического материала из коронарных артерий и артерий нижних конечностей. Однако в этих работах не проводили иммуногистохимический анализ типов клеточных элементов бляшек в участках преимущественного накопления красителя, что было сделано в нашем исследовании.

Ранее нами было показано, что в культивируемых моноцитах/макрофагах, выделенных из периферической крови человека, происходит интенсивное накопление ФС этими клетками [1]. В связи с этим можно предположить, что по крайней мере часть красителя накапливается в первую очередь в макрофагах. Действительно, в результате проведенного нами иммуногистохимического анализа областей АСБ с наибольшей интенсивностью флюоресценции отмечено, что в этих зонах содержится максимальное количество макрофагов и лимфоцитов.

Следует подчеркнуть, что в нестабильных АСБ накопление ФС было более выраженным, чем в стабильных. По-видимому, это связано с тем, что нестабильные бляшки по сравнению со стабильными содержат большее количество клеточных элементов, особенно макрофагов. Учитывая результаты R. Waksman и соавт. [16], которые продемонстрировали значительное снижение количества макрофагов в АСБ после ФДТ на кроликах с экспериментальным атеросклерозом, можно предположить, что наиболее перспективным направлением дальнейших исследований будет изучение влияния ФДТ на нестабильные АСБ.

Выводы

1. ФС накапливался в АСБ человека in vitro. Преимущественное накопление красителя происходит в участках АСБ, содержащих наибольшее количество клеточных элементов.

2. Иммуногистохимический анализ областей АСБ с максимальной интенсивностью флюоресценции продемонстрировал, что в этих зонах содержится наибольшее количество макрофагов и лимфоцитов.

3. В нестабильных АСБ ФС накапливался в большей степени, чем в стабильных, что было связано с более выраженной инфильтрацией нестабильных бляшек клетками, участвующими в воспалительной реакции.

Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы, гос. контракт №8/3-279н-10.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail