Атеросклероз — многофакторное заболевание, одними из патогенетических звеньев которого являются дисфункция эндотелия и воспаление [17]. Эти процессы связаны между собой и во многом обусловливают прогрессирование друг друга.

Воспалительный компонент играет важную роль в начале атеросклеротического процесса и во время развития осложнений в атеросклеротической бляшке, приводящих к ее нестабильности [11, 16]. На ранних стадиях атеросклеротического процесса дисфункция эндотелия развивается в ответ на воздействие воспалительных хемокинов, вырабатываемых мононуклеарами крови (фактор некроза опухоли α, интерферон γ, интерлейкин-1, 2 и др.) [11].

В экспериментах на животных исследованы и подробно описаны происходящие in vivo процессы адгезии (прилипания) мононуклеаров крови к клеткам эндотелия. Дисфункция эндотелия приводит к экспрессии этими клетками Р- и Е-селектина, что способствует смещению мононуклеаров крови из середины потока в сторону сосудистой стенки к эндотелию [19]. Приблизившись к сосудистой стенке, мононуклеары крови начинают катиться или перекатываться по эндотелию. Р- и Е-селектины, взаимодействуя с лигандами на мононуклеарах, замедляют перекатывание мононуклеаров по эндотелию, переводя их из стадии «быстрого качения» в стадию «медленного качения» (или «стреноживания») [7].

Процесс адгезии Т-клеток и моноцитов к эндотелию и внедрение их в интиму очень сложен, в нем участвует большое количество различных рецепторов интегринов со стороны мононуклеаров крови и лигандов со стороны эндотелиальных клеток. Интегрины LFA-1, VLA-4, рецептор к фибронектину, рецептор к ламинину, МАС-1, L-селектин и др. связываются с лигандами на эндотелиальных клетках (Р-, Е-селектин, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, VCAM-1, PECAM-1, CD44L, JAM-A, JAM-B, JAM-C и др.) [14]. Устранение неблагоприятных факторов, влияющих на эндотелий, приводит к исчезновению селектинов на его поверхности; однако если воспалительные хемокины или неблагоприятные факторы продолжают оказывать свое влияние на эндотелий, процесс адгезии переходит во вторую стадию. В этой стадии клетки, помимо Р- и Е-селектинов, начинают экспрессировать молекулы адгезии ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, VCAM-1 [5, 15]. Интегрины мононуклеаров крови (LFA-1, MAC-1, VLA-4) связываются с лигандами (молекулами адгезии ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, VCAM-1, PECAM-1), на поверхности эндотелиальных клеток начинается вторая стадия (стадия адгезии мононуклеарных клеток к эндотелиальным клеткам) [3, 20]. Продолжение активации эндотелиальных клеток приводит к появлению на их поверхности таких лигандов, как JAM-A, JAM-C, CD199, PECAM-1 и др., которые участвуют в сложном, до конца не ясном процессе миграции мононуклеаров в субэндотелиальное пространство, — третья стадия (стадия миграции мононуклеаров крови) [14].

Трудно переоценить значение адгезии макрофагов и других мононуклеаров крови в процессе становления ранних стадий атеросклеротического процесса и при прогрессировании этого заболевания. Исследования, выполненные на культуре эндотелиальных клеток, позволили прояснить многие вопросы, связанные с межклеточным взаимодействием мононуклеаров крови и клеток эндотелия, однако ввиду трудностей методического характера эта проблема почти не исследована морфологами. Препараты «en face» дают возможность исследовать эндотелий со стороны просвета сосуда. Использование препаратов артерий «en face» может позволить изучить взаимоотношения адгезированных мононуклеаров крови на клетках эндотелия с отложением липидов в интиме. Различные методики (для получения препаратов «en face») позволяют отделить только пласт эндотелиальных клеток или пласт эндотелия вместе с подлежащей интимой. Из всего разнообразия предложенных методик [4, 8, 9, 21 и др.] для получения таких препаратов нам встретились только две, где не применяются жидкости, растворяющие липиды [4, 8]. К сожалению, ни одно из этих двух исследований не было посвящено изучению адгезии мононуклеаров крови и отношению их к депозитам липидов в интиме.

Целью настоящего исследования явилось изучение адгезии Т-клеток, моноцитов и макрофагов к эндотелию коронарных артерий у больных с ишемической болезнью сердца.

Материалом для исследования служили сегменты коронарных артерий (состоящие из интимы и примыкающей к ней части медии), полученные во время операции коронарного шунтирования, сопровождающейся эндартерэктомией из коронарных артерий. Исследованию подвергались артерии, взятые у 27 мужчин. Возраст больных колебался от 59 до 70 лет. Были изучены сегменты 27 коронарных артерий. Исследовали участки артерий: 1) с макроскопически неизмененной интимой, 2) с липидными пятнами, 3) с атеромами и 4) с фиброатеромами. Большую часть материала (20 сегментов артерий) немедленно замораживали и в таком виде доставляли в лабораторию. Затем артерии фиксировали в 4% параформе и готовили препараты интимы «en face» по ранее описанной нами методике [2]. С целью выяснения, оказывает ли негативное влияние предварительное замораживание на адгезию мононуклеаров к эндотелию, семь сегментов коронарных артерий, взятых у 7 больных в операционной, немедленно фиксировали в 4% параформе. Затем фиксированные в параформе сегменты артерий промывали в проточной воде и готовили препараты «en face». Полученные препараты инкубировали с моноклональными антителами к моноцитам и макрофагам (CD68, фирма «DAKO», Дания), Т-лимфоцитам (CD4, фирма «Beckman Coulter», Франция; CD8, фирма «Сорбент», Россия), с антителами к ICAM-1, VIII фактору свертывания крови (фирма «Sigma», США). Реакцию визуализировали с помощью пероксидаза-антипероксидазного комплекса (ПАП-комплекс, фирма «МР Biomedicals», США) и 0,005% раствора диаминобензидина тетрагидрохлорида.

Иммуногистохимическую реакцию проводили по общепринятой методике. Затем препараты окрашивали гематоксилином или метиловым зеленым и на жир красителем Oil red.

В окрашенных гематоксилином и Oil red срезах и препаратах «en face» обнаружили гетерогенность изучаемого нами материала: наряду с микроскопически интактными участками в эндартерэктомированных участках коронарных артерий встречались липидные пятна, атеромы и фиброатеромы.

В микроскопически интактной интиме (при окрашивании Oil red в этих участках липиды не выявлены) на поверхности эндотелия адгезированные моноциты обнаруживали крайне редко в виде единичных клеток. Субэндотелиально расположенные макрофаги в этих участках отсутствовали или выявлялись как единичные клетки в поле зрения. При этом в свободных от липидов участках часто можно было обнаружить скопления Т-лимфоцитов (как CD4, так и CD8), которые образовывали на поверхности эндотелия целые гроздья (кластеры). При иммуногистохимической реакции с антителами к фактору фон Виллебранда эндотелиальные клетки образовывали непрерывный, интенсивно окрашенный пласт. Причем окрашивались в клетках главным образом тельца Вейбеля—Паладе. При микроскопическом исследовании эндартерэктомированных сосудов с макроскопически неизмененной интимой при окраске Oil red в интиме выявлены мелкие (пылевидные) капли липидов, лежащие внеклеточно под эндотелием. В таких участках коронарных артерий обнаружена связь между отложением липидов и адгезией на эндотелии в этом месте больших кластеров моноцитов (CD68). Субэндотелиально в интиме в этих же участках обнаружены скопления макрофагов (CD68) (см. рисунок, а),

Нами обнаружена своеобразная зависимость между адгезией Т-лимфоцитов и ранним отложением липидов в интиме. Так, отложение липидов всегда сопровождается обильной адгезией Т-лимфоцитов к эндотелию, но часто почти такая же обильная адгезия Т-лимфоцитов встречается и в интактной интиме, в местах, не содержащих липиды.

Макроскопическое изучение препаратов коронарных артерий «en face» у 5 больных обнаружило липидные пятна. В интиме этих препаратов большие скопления макрофагов с каплями липидов в цитоплазме чередовались с липидными каплями, свободно лежащими в субэндотелиальном пространстве. Иммуногистохимически в этих местах обнаружены скопления адгезированных Т-клеток (CD4, CD8) и кластеры адгезированных моноцитов (CD68). Субэндотелиально располагались макрофаги (CD68) и Т-клетки (CD4, CD8). Клетки эндотелия интенсивно окрашивались при иммуногистохимической реакции с антителами к фактору фон Виллебранда. Следует отметить неоднородность окраски: пласт эндотелия содержал группы клеток, отличающихся по интенсивности окраски.

Исследованию подвергались также артерии с атеромами и фиброатеромами. Препараты «en face» коронарных артерий с атеромами и фиброатеромами (19 больных) отличались большим количеством Т-клеток, моноцитов и макрофагов как адгезированных на эндотелии, так и находящихся субэндотелиально. Цитоплазма макрофагов часто была перегружена липидами. Иногда капли липидов сливались, образуя одну большую каплю, занимающую всю цитоплазму. Большое количество липидов обнаруживали в интиме и вне клеток. Макроскопически атеросклеротические бляшки были без эрозий и изъязвлений, но у 5 больных при микроскопическом исследовании обнаружены повреждения эндотелия. Дефекты эндотелиального покрова в этих местах равнялись по площади 1, максимум 5 клеткам эндотелия. Соседние эндотелиальные клетки положительно реагировали с антителами к фактору фон Виллебранда и были окрашены в коричневый цвет. Дно таких эрозий представлено инфильтратами из Т-клеток и макрофагов (см. рисунок, д, е).

Таким образом, повреждения эндотелиального покрова (поверхностные эрозии) отличались от окружающих тканей отсутствием одной или нескольких клеток эндотелия, так как инфильтрация мононуклеарами крови интимы была также и вокруг эрозий.

Микроскопически адгезированные Т-лимфоциты имели разную форму и размер. Одни Т-клетки имели округлую лимфоцитоподобную форму и почти гомогенное окрашивание, т.е. CD8- или CD4-антиген гомогенно распределялся по поверхности мембраны клетки. Наряду с такими мононуклеарами были CD8 Т-клетки, округлые, но несколько неправильной формы, как бы распластанные на эндотелиальных клетках. CD8- или CD4-антиген локализовался, в основном, по краю Т-клеток. Единичные Т-лимфоциты вытянутой формы также имели просветленную в центре окраску, т.е. CD4- и CD8-антигены локализовались, в основном, по краю и полюсам клетки. Редкой находкой было обнаружение мигрирующего в интиму Т-лимфоцита.

Моноклональные антитела к ICAM-1 выявили единичные эндотелиальные клетки, содержащие белки (молекулы адгезии). Эти молекулы адгезии локализовались, в основном, на мембране по границам эндотелиальных клеток, т.е. концентрация молекул адгезии в середине эндотелиальных клеток была меньше (см. рисунок, б). Эндотелиальные клетки с ICAM-1 находили над липидными пятнами, атеромами и фиброатеромами.

Наши данные подтверждают проведенные ранее исследования по адгезии мононуклеаров крови к эндотелиальным клеткам. Так, ранее было отмечено, что мононуклеары (в норме имеющие округлую форму) в процессе адгезии на эндотелии распластываются на эндотелиальных клетках, их форма становится неправильной. Далее они вытягиваются и мигрируют в субэндотелиальное пространство [12]. При исследовании препаратов «en face» нами обнаружены Т-клетки (CD8 и CD4) округлой лимфоцитоподобной формы с гомогенным распределением по поверхности мембраны CD4- и CD8-антигенов. По своей морфологии они соответствуют клеткам, закончившим медленное качение, т.е. адгезированным клеткам. Кроме этих клеток, встречались Т-лимфоциты с округлой формой и несколько большим, чем предыдущие клетки, диаметром. Такой вид клетки может свидетельствовать о том, что она «распласталась» на эндотелии. Далее наступает фаза поляризации Т-клеток, они вытягиваются и мигрируют в субэндотелиальное пространство. То, что такие клетки встречались как единичные в препарате, можно объяснить краткостью всего процесса миграции Т-лимфоцитов. Фаза поляризации занимает от 1 до 2 мин и приводит к клеточной подвижности в течение 2—3 мин. Сама же скорость миграции Т-лимфоцитов равна 10—15 мм/мин. Все вышеизложенное доказывает, что процесс миграции Т-клеток занимает чрезвычайно маленький промежуток времени и как следствие обнаруживается наличие единичных клеток, находящихся в данный момент в этой стадии.

Выявлена зависимость между ранним отложением липидов и адгезией в этом месте моноцитов (CD68). В участках интимы без отложений липидов адгезированные моноциты отсутствовали или выявлялись как единичные клетки в поле зрения. В местах отложения липидов в интиму находили адгезированные моноциты и субэндотелиальные скопления макрофагов (CD68). Т-клетки всегда обнаруживали в местах липидных пятен, однако большие кластеры адгезированных Т-клеток можно было обнаружить на эндотелии, находящемся над интимой, не содержащей липидов. Наличие массивных кластеров Т-клеток (CD4, CD8) на эндотелии, интима которого не содержит липиды, может свидетельствовать о самых ранних проявлениях атеросклеротического процесса, явлениях, когда еще нет отложений липидов в интиме (т.е. они еще не обнаруживаются при окраске Oil red). Возможно и другое объяснение присутствия кластеров Т-клеток на неизмененной интиме. Популяция Т-клеток неоднородна и состоит из нескольких субпопуляций: CD4-клеток [CD4-клетки делятся на Т-reg (регуляторные), Th1-, Th2- и Th17-клетки] и CD8 Т-клеток [CD8-клетки состоят из нативных (CCR7+, CD45RA+), клеток памяти (CCR7+, CD45RA–), эффекторных клеток памяти (CCR7–, CD45RA) и конечных эффекторных клеток (CCR7–, CD45+)] [18]. В эксперименте на мышах показано, что нарушение соотношения Th1 и Т-reg Т-лимфоцитов в ту или иную сторону приводит к прогрессированию атеросклероза или, наоборот, тормозит этот процесс [6, 10, 13]. Популяция Th1 (субпопуляция CD4 Т-клеток) синтезирует цитокины (интерлейкин-2, интерферон γ, фактор некроза опухолей β), которые активируют эффекторные клетки (макрофаги; CD8 Т-клетки и натуральные киллеры). Т-регуляторные клетки (T-reg) снижают иммунную активность Th1, что приводит к торможению прогрессирования атеросклеротического процесса. Поэтому появление кластеров Т-лимфоцитов вне зоны отложений липидов может быть связано с превалированием среди этих клеток субпопуляций Т-лимфоцитов, тормозящих процессы атерогенеза (Т-регуляторные) и тем самым препятствующих отложению липидов в интиму.

Все это доказывает непосредственное участие макрофагов в атеросклеротическом процессе и сложное опосредованное влияние Т-лимфоцитов на развитие атеросклероза. У части больных (с атеромами и фиброатеромами в сегментах коронарных артерий) на препаратах «en face» обнаружены повреждения эндотелиального слоя, заключающиеся в отсутствии одной или 3—5 клеток в эндотелиальном пласте. Мы считаем, что такие поверхностные эрозии можно рассматривать как начальную стадию развития нестабильной бляшки. Эти эрозии можно отнести (согласно классификации Рагино Ю.И. и соавт. [1]) к воспалительно-эрозивным (2-й тип эрозии). Так как иногда отсутствует всего лишь одна эндотелиальная клетка, можно предположить, что на этом этапе возможно и обратное развитие нестабильности. Такой дефект в эндотелиальном пласте может быть заполнен соседними или вновь образованными эндотелиальными клетками. Дно эрозий было выполнено инфильтратами Т-клеток и макрофагов и служило частью покрышки атеросклеротической бляшки (так как данные препараты «en face» сделаны из сегментов артерий, содержащих атеромы и фиброатеромы, верхние слои покрышки бляшки вошли в изучаемые препараты). Такие неприкрытые эндотелием участки интимы могут быть местом, где начнется образование тромба, который может привести к развитию острого коронарного синдрома. Технология для получения препаратов «en face» включает в себя этап примораживания интимы артерий. Категорически исключить возможность повреждения эндотелиальных клеток на этапе примораживания и далее при последующей иммуноморфологической реакции нельзя. Тем не менее мы считаем более вероятным то, что повреждения эндотелия не являются артефактом, связанным с приготовлением препаратов «en face». Обнаружено, что дно микроэрозий состоит из мононуклеаров крови, мигрировавших в интиму сосуда. Мы считаем, что связь инфильтратов мононуклеаров крови с дефектом эндотелиального покрова над ним не случайна. Доказано, что макрофаги (CD68) экспрессируют ферменты, разрушающие коллаген, в частности коллаген базальной мембраны эндотелия. Это приводит к потере связи эндотелиальных клеток со стенкой сосуда. Кроме того, предварительная фиксация формалином, призванная усилить связь клеток между собой, не изменила частоту появления микроэрозий. Все это может свидетельствовать о прижизненном повреждении эндотелиального покрова.

Молекулы адгезии ICAM-1 находятся на всей поверхности эндотелиальной клетки, но больше всего их по границам эндотелиальных клеток, что способствует миграции мононуклеаров через участок между ними.

Обнаружена четкая связь между ранними явлениями атеросклероза, т.е. мелкокапельным (пылевидным) отложением липидов в интиму, и адгезией в этих местах к эндотелию моноцитов. В участках сосудов, свободных от липидов, адгезия моноцитов к эндотелию отсутствовала.

В коронарных артериях обнаружены большие кластеры адгезированных на эндотелии и мигрировавших в интиму Т-клеток (СD4, CD8). Кластеры этих клеток встречались не только в участках сосудов с атеросклеротическими изменениями, но и в интактных относительно атеросклероза местах.